水稻白葉白穗突變體wlwp7的鑒定與基因定位

李哲理 張林金 譚穎 吳朝暉 肖豐 蘇雨婷 譚炎寧 肖應輝

摘? 要：水稻葉穗色澤突變體為解析不同器官葉綠素生物合成之間的內在聯系提供了優良的遺傳材料。本研究鑒定了1份白葉白穗突變體wlwp7（white leaf and white panicle 7），分析了wlwp7的形態、生理和遺傳特點。結果表明：wlwp7對低溫敏感，當環境溫度為20 ℃時苗期葉片白化，但溫度升高至30 ℃后葉色正常;大田環境下wlwp7抽穗后穎殼白化，葉綠素含量降低至野生型的40.73%;除結實率較野生型T98B下降6.28%外，其他產量性狀不受影響;遺傳分析發現，wlwp7與T98B的正反雜交F2群體中都未出現白葉綠穗和綠葉白穗重組單株，經卡方檢測白葉白穗突變單株與綠葉綠穗野生型單株的理論分離比符合1∶ 表明白葉白穗性狀受同一隱性核基因控制;利用BSA策略進一步將wlwp7定位在第3染色體上一個280 kb的區域內，該區域未有已報道的白葉白穗基因。本研究發現了wlwp7同時控制葉部和穗部葉綠素合成，精細定位結果為最終克隆wlwp7奠定了基礎。

關鍵詞：水稻;白葉白穗突變體;葉綠素;基因定位

中圖分類號：S511????? 文獻標識碼：A

Identification and Gene Mapping of a White Leaf and White Panicle Mutant wlwp7 in Rice

LI Zheli1，3， ZHANG Linjin1，3， TAN Ying2，3， WU Zhaohui3，4， XIAO Feng1， SU Yuting1， TAN Yanning3，4*， XIAO Yinghui

1. College of Agriculture， Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan 410128， China; 2. College of Biological Science and Technology， Hunan Agricultural University， Changsha， Hunan 410128， China; 3. State Key Laboratory of Hybrid Rice， Hunan Hybrid Rice Research Center， Changsha， Hunan 410125， China; 4. Long Ping Branch， Graduate School of Hunan University， Changsha， Hunan 410125， China

Abstract： Rice mutants varied both in leaf color and panicle color are valuable genetic resources for revealing the link of chlorophyll biosynthesis between different organs. Here， a white leaf and white panicle 7 mutant （wlwp7） was identified and analyzed from morphological， physiological and genetic levels. It showed that the seedling plants of wlwp7 was sensitive to low temperature with white leaves at 20 ℃. While， it became green at a high temperature of 30 ℃. The paddy plants of wlwp7 was observed to present white hulls at heading. The chlorophyll content in the hulls of wlwp7 was reduced to 40.73% of its wild type T98B. Except for the seed-setting rate （with a decrease of 6.28%）， other yield traits remained unaffected. Further genetic analysis confirmed there was no recombinant plant with a phenotype of white leaf/green panicle or green leaf/white panicle in two F2 groups derived from wlwp7/T98B and T98B/wlwp7. Moreover， it found the theoretical segregation ratio of mutant plants to wild-type plants was consistent with 1：3 by chi square test， supporting wlwp7 would be controlled via one recessive nuclear gene. Finally， wlwp7 was mapped within 280Kb on chromosome 3 using BSA strategy， and there is no reported gene controlling white leaf and white panicle in this area. This study reveals that wlwp7 functions in regulating the chlorophyll bio-synthesis in leaves and panicles， and the gene mapping results provides a basis for the cloning of wlwp7.

Keywords： rice; white leaf and white panicle mutant; chlorophyll; gene mapping

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.09.010

葉綠素廣泛分布于綠色植物的光合器官中，起吸收、傳遞和轉化光能的作用，對植物生長發育和農作物產量形成具有重要意義[1]。葉是高等植物光合作用的主要器官，葉肉細胞通過制造大量的有機物來滿足不同階段生長發育和形態建成的需要[2]。穗也是重要的光合器官，谷類作物的穗器官（主要是穎殼和枝梗）能積累葉綠素，具有制造碳水化合物的能力[3];在水分虧損導致葉光合能力降低的條件下，穗器官能儲存和動員光合產物促進籽粒灌漿[4-5]。光合作用對水稻干物質生產的貢獻率達到了90%，穩定葉穗中的葉綠素含量已成為塑造和培育高光效高產群體的重要手段;目前，以葉、穗等器官的色澤突變體為主要對象，運用分子生物技術已克隆了參與水稻葉綠素生物合成[6]、降解[7]及調控[8]等相關的功能基因，為定向調控葉綠素含量及指導高光效高產育種奠定了基礎[9]。

白化是一種常見的葉綠體發育缺陷和葉綠素虧損型變異現象，可單獨或同時表現于葉、穗等部位;該類型材料能完成前質體至白色體的分化，但白色體不能發育至黃化質體或成熟葉綠體，其生理成因是白色體片層結構中積累原脫植基葉綠素，而原脫植基葉綠素不能還原成脫植基葉綠素[10]。目前，關于控制水稻葉片和穗器官白化的分子機理已取得了重大進展[11-12]，但值得思考的一個問題是，既然葉綠素合成途徑和調控網絡高度保守，為什么某些基因即使是組成型表達基因（如OsPPR6[13]）的突變只造成特定器官的失綠而不會波及所有光合器官呢？這啟示我們不同光合器官既遵循葉綠素合成的共同機制又選擇性地保留了適合自身需求的調節機制，而鑒定葉穗色澤突變體將為解析不同器官葉綠素生物合成之間的內在聯系提供優良的遺傳材料。

本課題組從T98B的輻射誘變后代中發現了1份白葉白穗突變體wlwp7，但是wlwp7的生理和遺傳行為尚不清楚;為此，本研究擬從多個角度分析wlwp7的特征特性并精細定位wlwp7，研究結果將為wlwp7克隆及功能分析奠定基礎。

1? 材料與方法

1.1? 材料

水稻‘T98B是我國長江流域常用的秈稻保持系;wlwp7是利用60Co-γ射線誘變‘T98B后獲得的低溫敏感型白葉白穗突變體，已自交穩定至M8代。

1.2? 方法

1.2.1? wlwp7的表型及葉綠素素含量分析? 將‘T98B和wlwp7的成熟種子37 ℃浸種催芽1 d，置于20、25、30 ℃等3個溫度的恒溫光照培養箱中催芽生長至3葉期，持續觀察葉色變化，取第2片葉測定色素含量;另一方面，夏季在湖南雜交水稻研究中心長沙縣春華鎮大田種植‘T98B和wlwp7，于6月中旬觀察穗部色澤情況，并取‘T98B和wlwp7抽穗第1天穎殼測定色素含量。將色素測定部位剪成長寬2～3 mm的小片，稱取0.1～0.2 g，于無水乙醇中4 ℃避光浸提48 h，用分光光度計測量665、649、470 nm的OD值并計算葉綠素含量測定葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量[6]。

1.2.2? wlwp7的遺傳分析? 將‘T98B和wlwp7正反交后獲得F1和F2種子。在20 ℃恒溫光照培養箱中對F2種子進行發芽培養，待生長14 d后統計各群體中的白葉表型和綠葉表型植株數;然后，上調溫度至28 ℃培養1周，再轉至大田高溫條件下生長（生育期內平均氣溫23～34 ℃），統計白葉白穗、白葉綠穗、綠葉白穗和綠葉綠穗4種類型單株的數量和分離比，經卡方檢測推斷白葉與白穗性狀的連鎖關系。

1.2.3? wlwp7的基因定位? 利用wlwp7與正常穗色粳稻品種‘日本晴的雜交F2群體定位白葉白穗基因。參照BSA方法[14]，隨機挑選25個白穗單株和25個綠穗單株按CTAB法[15]提取葉片DNA，構建隱性池和顯性池，再選擇均勻分布于12條染色體的112對SSR或InDel標記進行連鎖分析，將白穗基因定位至某一染色體上。進一步開發InDel標記，利用497個隱性單株鑒定緊密連鎖標記，精細定位wlwp7;在水稻基因組注釋系統RGAP（http：//rice.plantbiology.msu.edu/index. shtml）中根據注釋信息分析定位區域內是否含有已知的白葉白穗基因。wlwp7基因定位主要引物信息見表1。

1.2.4? wlwp7的農藝狀考察? 2020年6月，將‘T98B和wlwp7種植于湖南雜交水稻研究中心長沙縣春華鎮試驗基地，每份材料種植100穴，每穴2苗;于成熟期，取達到平均分蘗水平的5穴稻株考察株高、穗長、結實率和千粒重等指標。

1.3? 數據分析

使用SPSS 12.1軟件分析突變體和野生型各指標在0.05和0.01水平有無顯著性差異。

2? 結果與分析

2.1? wlwp7的表型觀察

2017—2019年連續觀察發現，wlwp7在長沙早春季節播種時（如3月下旬，平均氣溫10.0～16.5 ℃）葉片白化，而在夏季播種時（如6月上旬，平均氣溫24.0～26.5 ℃）葉色正常。為了明確wlwp7的低溫敏感特性，在3個人工處理溫度條件下觀察wlwp7的苗期葉色表型;結果表明，在20 ℃的低溫條件下，wlwp7的葉片大面積白化（僅葉尖部分呈淺綠色）;在25 ℃的適溫條件下，其第1片葉呈綠色而新出葉葉緣仍發生白化;當溫度升高至30 ℃時，葉片全綠，而野生型‘T98B在3種溫度條件下皆為綠葉表型（圖1A）。

于2019年4月下旬（此后日均溫度超過21 ℃，抽穗期日均溫超過26 ℃）移栽wlwp7后，可見其株型結構、葉色與野生型無明顯差異，但穗部色澤有顯著變化（圖1B）;抽穗后wlwp7的第1、3、5天穎殼和穗枝梗白化（圖1C～D），成熟后谷粒呈灰白色，而對照為谷黃色（圖1E）。

2.2? wlwp7的色素含量分析

取上述3種溫度處理下的苗期葉片測定葉綠素含量，結果顯示在20 ℃的低溫條件下wlwp7的葉綠素含量幾乎為0;在25 ℃的適溫下，葉綠素a（Chla）、葉綠素b（Chlb）和總葉綠素含量分別為野生型T98B的41.71%、44.37%和42.42%，差異均為極顯著（P<0.01），在30 ℃的高溫下葉綠素含量明顯升高并達到了野生型水平（圖2A）。取大田生長植株測定穎殼葉綠素含量，發現wlwp7抽穗后第1天的葉綠素a、葉綠素b和總葉綠素含量均與野生型具有極顯著差異，分別為野生型T98B的40.82%、40.48%和40.73%（圖2B）。

2.3? wlwp7的遺傳分析

由表2可知，T98B和wlwp7的正交和反交F1都表現為與野生型一致的綠葉綠穗表型，說明白葉白穗性狀受隱性核基因控制;2個F2群體都出現了正常的綠葉綠穗單株和白葉白穗單株，且未見有白葉綠穗和綠葉白穗的重組類型單株，經χ2檢測白葉白穗單株和綠葉綠穗單株的理論分離比為1∶ 表明白葉白穗表型只受1對隱性核基因控制。

2.4? wlwp7的基因定位

利用在wlwp7與‘日本晴中表現為多態性的77個SSR或InDel標記分析了F2隱性混池和顯性混池DNA之間的基因型差異，發現第3染色體多個SSR標記如CHR305、ZM3-27與目的基因存在連鎖關系，表明wlwp7位于第3染色體上（圖3）。然后，利用497個白穗單株并發展多態性標記縮小定位區間，最終將wlwp7精細定位至Ind8和Ind8-3之間。定位區域對應‘日本晴基因組的物理位置范圍為25 493 396～25 775 501 bp，共含有35個基因;經查搜RGAP數據庫，該區域內沒有已知的的白葉白穗基因，但存在2個葉色基因，其中1個為編碼葉綠素b還原酶的NOL 基因（LOC_Os03g45194），另一個編碼含NusB結構域的質體蛋白基因V1（LOC_Os03g45400）。

2.5? wlwp7的農藝性狀分析

wlwp7的植株形態與‘T98B相似，株型松散適中，葉上禾，劍葉較長，分蘗力中等，著粒較稀疏，粒細長;在具體產量性狀方面，除結實率下降了6.28%外，wlwp7與‘T98B的生育期、株高、穗長、有效穗數、每穗粒數、粒長、粒寬和千粒重等指標的差異不顯著（表3），表明wlwp7的產量結構基本不受影響。

3? 討論

葉和穎殼都含有葉綠素，二者葉綠素合成的紊亂都有可能導致白化。從數量上來看，白葉突變體最多，白葉白穗突變體和白穗突變體相對較少[16]。在已鑒定的白穗突變體中，除wp（t）、wp6和wp7僅局限于穗部變異外[17-19]，其他大多數突變體的白化性狀同時在葉片中得到了表達;在這些突變體中，白化表型對溫度的敏感性可能不太一致，如wp1和wp2對溫度不敏感[20-21]，wlp6、slwp和st_wp的葉片對低溫敏感且wlp6升高溫度穗部轉綠[22-24]，而wlp2的葉片和穎殼都對高溫敏感（34 ℃的高溫條件下白化）。另一方面，白化發生時期也有所不同，如wslwp在芽期就出現白化，其第1葉全白但后續新葉的葉尖沿葉脈漸漸轉綠[25]，而wsp1在發育至3葉期或4葉期才發生白化[26]。本研究所鑒定的白葉白穗突變體wlwp7在苗期對低溫（20 ℃）敏感，增加溫度能恢復至綠葉表型;wlwp7抽穗早期穗部內外稃及二次枝梗也發生明顯白化，但白穗表型對溫度是否敏感尚不清楚。此外，我們還注意到wlwp7與‘日本晴的F2后代中的白穗個體的穗部白化程度不盡一致，這一現象與st_wp類似，暗示遺傳背景可能干擾白穗性狀的表達。

在已定位或克隆的白穗（含白葉白穗）基因中，除st_fon受細胞質基因控制外，其余基因均為細胞核基因，且呈隱性遺傳[27]。研究進一步發現，大部分白穗基因的蛋白產物是核酸工具酶或核糖體的基本組成成分。如WP1編碼1個Val-tRNA合成酶OsVALRS2[20]，WLP1編碼1個50S核糖體L13蛋白[28]，他們都影響葉綠體中核糖體的組裝;WSP1編碼1個細胞器RNA編輯因子（MORF）家族蛋白，突變后影響質體核糖核酸的編輯（ndhA剪接受到損傷）[26];WLP2與Os TrxZ、Os FLN2組成質體轉錄激活復合體（TAC）亞基共同調節PEP聚合酶的活性[12]。WLWP7被定位在第3號染色體，定位區域內包含了白化轉綠基因V1和滯綠葉基因NOL[29-30]，但未發現有已報道的白葉白穗基因;考慮到V1參與質體蛋白的合成且其突變表型（葉片白化、對低溫敏感[17]）與wlwp7類似，結合不同等位變異可導致表型差異現象（如ST1的2種等位變異出現白穗和綠穗2種表型），尚不能排除WLWP7與V1等位的可能。另一方面，白化性狀既有可能局限于某一特定器官，也有可能發生在多個器官或全部營養器官（如st_fon），其豐富的表型與目的基因的特異性表達或組成型表達有關;WLWP7基因的克隆將為解析多器官葉綠素生物合成之間的內在聯系提供線索，也將對認識條件型轉綠的分子機制具有啟發意義。

從農藝性狀來看wlwp7的白化性狀對植株生長勢和穗粒結構影響不大;葉色標記是水稻育種中可利用的種質資源，wlwp7攜帶明顯的穗色標記，可以將其轉入水稻不育系中提高親本和雜種的除雜效率[31]。后續工作將加強wlwp7的克隆和功能研究，同時探討wlwp7在水稻育種中的利用價值。

wlwp7具有葉穗白化特點，在苗期對低溫敏感，抽穗后穎殼和枝梗失綠，葉穗合成葉綠素能力顯著降低;wlwp7的白葉和白穗性狀受同一隱性核基因控制，推測其候選基因可能為編碼NUS1的V1;白葉白穗突變體wlwp7的鑒定將為解析多器官葉綠素生物合成之間的內在聯系提供新材料。

參考文獻

[1]? Von Wettstein D， Gough S， Kannangara C G. Chlorophyll biosynthesis[J]. Plant Cell， 1995： 1039-1057.

[2]? Adachi S， Nakae T， Uchida M， et al. The mesophyll anatomy enhancing CO2 diffusion is a key trait for improving rice photosynthesis[J]. Journal of Experimental Botany， 2013， 64（4）： 1061-1072.

[3]? Araus J L， Brown H R， Febrero A， et al. Ear photosynthesis， carbon isotope discrimination and the contribution of respiratory CO2 to differences in grain mass in durum wheat[J]. Plant， Cell and Environment， 1993， 16（4）： 383-392.

[4]? Tambussi E A， Bort J， Guiamet J J， et al. The photosynthetic role of ears in C3 cereals： metabolism， water use efficiency and contribution to grain yield[J]. Critical Reviews in Plant Sciences， 2007， 1（26）： 1-16.

[5]? Maydup M L， Antonietta M， Guiamet J J， et al. The contribution of ear photosynthesis to grain filling in bread wheat （Triticum aestivum L.）[J]. Field Crops Research， 2010， 119（1）： 48-58.

[6]? Wu Z， Zhang X， He B， et al. A chlorophyll-deficient rice mutant with impaired chlorophyllide esterification in chlorophyll biosynthesis[J]. Plant Physiology， 2007， 145（1）： 29-40.

[7]? Sato Y， Morita R， Katsuma S， et al. Two short-chain dehydrogenase/reductases， NON-YELLOW COLORING 1 and NYC1-LIKE， are required for chlorophyll b and light- harvesting complex II degradation during senescence in rice[J]. Plant Journal， 2009， 57（1）： 120-131.

[8]? He Y， Shi Y F， Zhang X B， et al. The OsABCI7 transporter interacts with OsHCF222 to stabilize the thylakoid membrane in rice[J]. Plant Physiology， 2020， 184（1）： 283-299.

[9]? Shin D， Lee S， Kim T H， et al. Natural variations at the Stay-Green gene promoter control lifespan and yield in rice cultivars[J]. Nature Communications， 2020， 11（1）： 1-11.

[10]????? Sakuraba Y， Rahman M L， Cho S H， et al. The ricefaded green leaflocus encodes protochlorophyllide oxidoreductase B and is essential for chlorophyll synthesis under high light conditions[J]. Plant Journal， 2013， 74（1）： 122-133.

[11]????? Liu C， Zhu H， Xing Y， et al. Albino Leaf 2 is involved in the splicing of chloroplast group I and II introns in rice[J]. Journal of Experimental Botany， 2016， 67（18）： 5339-5347.

[26]????? Zhang Z G， Cui X A， Wang Y W， et al. The RNA editing factor WSP1 is essential for chloroplast development in rice[J]. Molecular Plant， 2017， 10（1）： 86-98.

[27]????? 陳德西， 李? 婷， 曲廣林， 等. 水稻條斑和穎花異常突變體st-fon的鑒定與遺傳分析[J]. 中國水稻科學， 2012， 26（6）： 677-685.

[28]????? Song J， Wei X J， Shao G N， et al. The rice nuclear gene WLP1 encoding a chloroplast ribosome L13 protein is needed for chloroplast development in rice grown under low temperature conditions[J]. Plant Molecular Biology， 2014， 84（3）： 301-314.

[29]????? Iba K， Takamiya K I， Toh Y， et al. Formation of functionally active chloroplasts is determined at a limited stage of leaf development in virescent mutants of rice[J]. Developmental Genetics， 1991， 12（5）： 342-348.

[30]????? Kusumi K， Sakata C， Nakamura T， et al. A plastid protein NUS1 is essential for build-up of the genetic system for early chloroplast development under cold stress conditions[J]. The Plant Journal， 2011， 68（6）： 1039-1050.

[31]????? Wu D X， Shen S Q， Cui H R， et al. A novel thermo/photoperiod-sensitive genic male-sterile （T/PGMS） rice mutant with green-revertible albino leaf color marker induced by gamma irradiation[J]. Field Crops Research， 2003， 81（2/3）： 141-147.

責任編輯：黃東杰