基因組編輯技術在水稻育種中的應用進展

陳 峰，朱文銀，焦曉真，姜明松，張士永，周學標，徐建第*

（1.山東省農業科學院濕地農業與生態研究所，山東 濟南 250100；2.中國水稻研究所，浙江 杭州 311006）

基因組編輯技術已經在單子葉模式作物水稻中得到成功應用，主要包括鋅指核酸酶（ZFNs）系統、類轉錄激活效應因子核酸酶（TALEN）系統、成簇規律間隔的短回文重復序列/核酸內切酶（CRISPR/Cas）系統以及近年來快速發展的單堿基編輯技術[1]。

利用基因組編輯技術可實現對基因組的高效精準修飾，其巨大的技術優勢將會成為現代作物育種和農業生物技術研發的一項革命，成為作物遺傳育種研究的重要手段[2]。水稻是主要的糧食作物以及重要的單子葉模式作物，基因組編輯技術已成為水稻農藝性狀改良及基因功能研究的重要手段。本文介紹了基因組編輯技術及其在水稻性狀改良與基因功能研究中的應用進展。

1 基因組編輯技術概述

鋅指核酸酶（ZFNs）[3]和類轉錄激活因子效應物核酸酶（TALENs）[4]最先被應用于基因組定點編輯。ZFN特異性較低，并且操作較為繁瑣，費用較高。TALEN技術與ZFN相比，操作較為簡單、成本較低。

CRISPR/Cas9系統是通過一段向導RNA和配套的核酸酶對特定的基因組序列進行定點編輯。CRISPR/Cas9具有載體構建簡單易行、成本低、能夠實現多個靶點的同時定點編輯以及效率高等優點。Hu等對spCas9蛋白進行了改進，改進后可以識別不同的原間隔基序結構（protospacer adjacent motif,PAM），使CRISPR/Cas9系統能識別范圍更為廣泛的靶點[5]。表1列出了3種工程核酸酶的特點。

表1 3種工程核酸酶ZFN、TELEN、CRISPR/Cas9的比較

Zetsche等研究發現，Cpf1核酸內切酶包括AsCpf1、FnCpf1和LbCpf1 3種[6]。相比于CRISPR/Cas9系統，Cpf1更簡單、更小、更容易進入細胞；Cpf1的PAM是靶序列為5′端連續的2個或3個胸腺嘧啶（T），擴大了基因組編輯的范圍；Cpf1不僅可以切割DNA，還可以切割RNA，有利于構建多基因編輯的載體。

Komor等開發了3種不同的堿基編輯器，分別是胞嘧啶堿基編輯器（cytosine base editor,CBE）、腺嘌呤堿基編輯器（adenine base editor,ABE）和先導編輯器（prime editor），這些堿基編輯器在工作時不依賴雙鏈DNA斷裂（double strand breaks,DSB）的產生，也不需要供體DNA的參與[7]。朱健康團隊在水稻中首次應用了腺嘌呤堿基編輯器（ABE）[8]，利用用于大腸桿菌的ABE結構能顯著提高腺嘌呤堿基編輯器在水稻中的編輯效率[9]。

2 基因組編輯技術在水稻遺傳育種中的應用

利用基因編輯技術對水稻進行改良，在保證其原有優良性狀的基礎上，可以快速獲得具有高產、穩產、優質、多抗等優良性狀的水稻種質。

TALEN技術可以用于水稻抗病及優質材料的創制。Li等應用TALEN技術對蔗糖轉運蛋白基因OsSWEET14啟動子區與白葉枯病原菌效應蛋白結合順式元件定點突變，降低OsSWEET14的啟動子與白葉枯病原菌分泌的效應蛋白的結合能力，獲得了對白葉枯病原菌的抗性[10]。Cai等利用TALEN技術編輯Os09g29100基因啟動子中的Tal7結合位點，提高了水稻細菌性條斑病的抗性[11]。Shan等在水稻原生質體及愈傷組織中共轉化2對TALENs，實現了OsBADH2a和OsBADH2 b2個基因雙突變，得到了同一染色體上2個位點間大片段缺失的突變體[12]。

在水稻品質性狀編輯方面，利用CRISPR/Cas9基因編輯系統實現了直鏈淀粉含量、香味等基因的突變。周鑫等利用CRISPR/Cas9基因編輯系統，獲得了新型糯稻種質[13-15]。Huang等挖掘出一個稀有Wx等位基因waxyabe2，利用2種堿基編輯系統（ABE-NG和CBE-NG），獲得了直鏈淀粉含量（amylose content,AC)范圍為0.30%～29.43%（野生型對照為19.87%）的一系列新的Wx等位基因，其中waxyabe2等位基因編碼的GBSSI蛋白上第237位氨基酸由T突變為A，使稻米表現出“軟米”的表型，改善了蒸煮食味品質（eating and cooking quality，ECQ）和外觀品質[16]。Huang等通過CRISPR/Cas9技術編輯Wx基因啟動子上的關鍵順式作用元件，創制了多個可微調直鏈淀粉含量的新Wx等位基因，為水稻優質育種提供了新種質與新方法[17]。邵高能等通過CRISPR/Cas9技術對香味基因Badh2進行了編輯，實現對稻米香味性狀的定向改良[18-21]。周文甲等利用CRISPR/Cas9技術對綏粳14的抽穗期基因Hd2、香味基因Badh2進行編輯，獲得了抽穗期縮短的香稻種質[22]。

利用CRISPR/Cas9基因編輯系統創制了多種水稻株型發育及產量相關性狀的突變材料。Miao等通過密碼子優化Cas9蛋白在水稻中高效獲得了葉綠素合成基因CAO1和分蘗夾角控制基因LAZYJ突變的植株[23]。Shan等對水稻不同性狀的多個基因進行突變，包括OsBADH2、OsDEP1、OsCKX2、OsSD1，獲得了可以用于水稻育種的種質材料[24]。Feng等對水稻ROC5、OsWaxy基因進行突變，創制出卷葉及糯性種質[25]。盛夏冰等利用CRISPR/Cas9技術對水稻落粒性主效基因qSH1定點編輯，降低了受體品種的落粒性[26]。Huang等通過CRISPR/Cas9技術對水稻高產基因（Gn1a和DEP1）進行編輯，對Gn1a和DEP1基因隨機突變進行表型篩選，獲得了多個高產Gn1a和DEP1等位基因[27]。王加峰等應用CRISPR/Cas9系統對調控水稻產量基因TGW6定點編輯，部分tgw6的缺失突變能顯著提高千粒質量（幅度大于5%），為水稻的高產穩產奠定了重要的材料基礎[28]。沈蘭等利用CRISPR/Cas9系統，構建了共敲除載體pC1300-2×35S::Cas9-gGS3-gGn1a，成功地實現了對粒型基因GS3和每穗粒數基因Gn1a的定點編輯[29]。孟帥等利用CRISPR/Cas9技術編輯粒長基因GS3，獲得了花時早于短粒粳稻野生型的材料[30]。張浩等利用CRISPR/Cas9技術編輯DTH8基因改良了粳稻99-25的抽穗期，獲得了抽穗期提前的DTH8突變體材料[31]。胡雪嬌等利用CRISPR/Cas9系統，以SD1基因為靶基因，構建基因編輯載體CRISPR-SD1，定向改良了恢復系申繁17和申繁24的株高[32]。

利用CRISPR/Cas9基因編輯系統創制了多種水稻抗病突變材料，為水稻抗性改良提供了種質。卿冬進等利用CRISPR/Cas9基因編輯方法敲除水稻恢復系“GH998”的Bsr-d1基因，獲得無轉基因成分的純合突變株系，為進一步研究Bsr-d1基因在雜交水稻上的功能提供了理論依據和種質資源[33]。劉維等利用CRISPR/Cas9技術，靶向編輯抗病基因OsCOL9的CDS起始區域以及外顯子末端，在T1代獲得了類型豐富的OsCOL9（CONSTANS-Like 9）突變體，為水稻抗病育種奠定了重要材料基礎[34]。徐鵬應用CRISPR/Cas9系統，以稻瘟病抗性基因Pita、Pi21和ERF922為靶基因，構建共編輯載體，獲得了具有較高稻瘟病抗性的長粒粳稻恢復系L1014純合突變株系，為稻瘟病抗性改良提供了良好的材料[35]。楊海河等應用CRISPR/Cas9技術對日本晴稻瘟病基因pi21進行編輯，獲得了pi21隱性突變株系，稻瘟病抗性得到提高[36]。王芳權等針對Pi21基因的2個靶位點構建基因敲除載體，轉化南粳9108，利用CRISPR/Cas9技術成功敲除了水稻Pi21基因，為培育廣譜抗稻瘟病的水稻新品系奠定了基礎[37]。Wang等利用CRISPR/Cas9技術編輯編碼AP2/ERF類轉錄因子的基因OsERF922，獲得了抗稻瘟病空育131株系[38]。

利用CRISPR/Cas9基因編輯系統創制了抗除草劑、低鎘積累種質。Li等利用CRISPR/Cas9技術對5-烯醇丙酮酰莽草酸-3-磷酸合成酶基因OsEPSPS進行編輯，獲得了具有草甘膦除草劑抗性的水稻種質[39]。Sun等利用CRISPR/Cas9技術對乙酰乳酸合酶基因OsJiS進行了定點編輯，獲得了抗嘧啶羧酸類除草劑的水稻種質[40]。Xu等應用CRISPR/Cas9系統編輯苯達松抗性基因BEL，獲得了對苯達松敏感的水稻材料[41]。Tang等利用CRISPR/Cas9系統，敲除金屬轉運基因OsNramp5，創制出低鎘積累秈稻新種質[42]。

另外，CRISPR/Cas9基因編輯系統在水稻生長發育調控的分子機制方面也取得了重要進展。楊宏等根據OsSUTs基因序列信息設計靶位點，構建CRISPR/Cas9載體，獲得5個OsSUTs基因的陽性敲除苗，為研究OsSUTs基因的分子功能及其調節關系提供了良好材料[43]。彭廷等利用CRISPR/Cas9基因編輯技術，得到miR1866的CRISPR/Cas9表達載體，利用農桿菌介導法導入日本晴，研究了miR1866對水稻生長發育的調節作用，對研究miRNA調控途徑和分子機制具有重要的意義[44]。陳會杰等利用CRISPR/Cas9技術原理，構制PHYB的CRISPR/Cas9表達載體，轉化粳稻品種日本晴，對PHYB基因進行了定點編輯，為進一步研究PHYB在水稻中的功能提供了依據[45]。黃小貞等利用CRISPR/Cas9系統，分別構建TIFYlb及其同源基因TIFYla（LOC_Os03g47970）的單基因和雙基因敲除載體，成功實現了轉錄因子TIFYla和TIFYlb的基因編輯，獲得不同類型單基因突變株系以及雙基因突變株系，為研究TIFY1響應低溫應答的機制提供了依據[46]。張宗飛等采用CRISPR/Cas9技術，成功創建了2個已鑒定了的水稻果糖激酶OsFRK家族基因的敲除突變體，為研究OsFRK1和OsFRK2的生物學功能提供了材料[47]。沈蘭等利用CRISPR/Cas9多基因編輯系統成功構建共敲除水稻中8個農藝性狀基因的載體，還在T0代獲得了純合的六突突變株、七突突變株、八突突變株，表明CRISPR/Cas9系統在作物育種過程中可快速引入遺傳多樣性[48]。中國水稻研究所王克劍團隊利用CRISPR/Cas9基因編輯技術在雜交水稻春優84中同時敲除PAIR1、REC8、OSD1和MTL4個生殖相關基因，得到了雜交稻的克隆種子，完成了雜合基因型的固定，實現了雜交稻無融合生殖從0到1的關鍵突破，具有重要的理論和實踐意義[49]。

3 問題與展望

以CRISPR/Cas9系統為代表的基因組編輯技術提高了作物定向遺傳改良效率，廣泛地應用于作物的精準遺傳改良。當然，基因組編輯技術也面臨技術以及監管方面的一些問題，目前的研究多局限于理論研究及新材料的創制，隨著基因組編輯技術的完善可望在生產應用方面發揮重要作用。

3.1 擴大基因組編輯范圍

最常用的Cas9來自于產胺鏈球菌（Streptococcus pyogenes），被稱為SpCas9。SpCas9能夠識別的PAM序列主要是NGG，限制了CRISPR/Cas9系統在基因組的可編輯范圍[50]。Hu等通過定點突變的方法對SpCas9蛋白進行改造，獲得2種SpCas9變體VQR和VRER，可以識別NGA以及NGCG 2個PAM序列，在水稻中可編輯范圍拓展到現有的2倍以上，2種變體也可以同時對多基因進行有效的編輯，為進行更廣泛的基因組編輯提供了新的可選工具[5]。辛高偉等利用改進后的CRISPR/VQR系統對水稻中3個相對低效的VQR靶位點NAL1-Q1、NAL1-Q2和LPA1-Q進行了編輯，結果表明，改進的CRISPR/VQR系統可以高效編輯NGAC PAM位點，并產生豐富的突變類型[51]。這為水稻及其他植物相關基因NGAC PAM位點的編輯提供了理論依據。

Zetsche等通過生物信息學手段發現了新的V型CRISPR基因編輯系統CRISPR/Cpf1，有效地擴展了基因組編輯范圍[6]。研究結果表明，CRISPR/Cpf1在植物基因組編輯上具有廣闊的應用前景。除了SpCas9，還有一些不同來源的CRISPR/Cas系統，也具有基因編輯能力[45]。

3.2 無外源DNA污染的植物基因編輯技術應用

常規植物基因組編輯手段存在脫靶效應及外源DNA污染的風險[50]。Woo等將Cas9蛋白和gRNA在體外組裝成核糖核蛋白復合體，再通過聚乙二醇轉化法將核糖核蛋白復合體轉入原生質體，成功對目的基因進行了編輯，T0代獲得了無外源DNA殘留的基因編輯植株[52]。Liu等報道了一種對外源成份進行精確分析的工具FED（foreign element detector），有望為全球基因組編輯生物的應用和安全監管提供重要工具平臺[53]。

3.3 監管政策方面的問題

基因編輯技術的出現為作物分子育種提供了極好的機遇，但對于基因編輯作物是否屬于轉基因生物，目前國際上尚未有明確一致的定論，其監管標準存在較大爭議[54]。美國農業監管部門認為，基因編輯作物是通過細胞自我修復機制產生的突變體，不被定義為轉基因生物[55]。2020年6月，美國農業部給出了對基因編輯技術的支持性指南，可通過監管豁免和未來豁免決定監管狀況程序來監管基因編輯產品。截止到2020年底，美國農業部已批準了70種以上的基因編輯作物，不再額外實施監管。除美國以外，采用類似政策的國家有加拿大、巴西、阿根廷、澳大利亞、智利、哥倫比亞、以色列等。日本和俄羅斯原本都是反對轉基因作物種植的國家，但都對基因編輯技術持積極態度。2020年，日本批準其國內第一個基因編輯西紅柿可以商業化生產和食用。

鑒于基因編輯技術在農業生物育種中的巨大優勢和潛力，建議相關部門加強基因編輯作物研發支持力度，同時盡快出臺更科學合理的基因編輯作物監管政策，從而有序推進生物育種產業化應用。