稻田土壤CH4排放及其關聯微生物功能基因豐度對磺胺二甲嘧啶和銅污染的響應

程粟裕，朱長俊，李昕鈺，董寧，周金蓉，蔣靜艷

（南京農業大學資源與環境科學學院，南京210095）

甲烷（CH4）是重要的溫室氣體之一，其增溫潛能是二氧化碳（CO2）的28 倍，對溫室效應的貢獻率僅次于CO2，為20%，且在大氣中滯留時間較長[1]。稻田是CH4的重要排放源之一，稻田年CH4排放量可占其總排放量的9%~19%[2]。近幾十年來我國畜牧養殖模式高度集約化，畜禽養殖規模增大導致畜禽糞便增多，大量畜禽糞便就近施用于農田，促進了CH4排放[3]。

微量元素Cu、Zn、As 等作為動物飼料添加劑，可以促進畜禽生長，但其不能被動物完全吸收，不被吸收的部分隨著畜禽糞便排出體外，再經施肥進入農田造成污染[4]。有報道統計分析了我國841 個農田土壤樣本，發現Cu 是僅次于Zn 的第二大輸入農田的重金屬（84 069 t·a?1）[5]，含量范圍在 0.12~1 247.82 mg·kg?1[6]，且南方土壤76%的Cu 來自于畜禽糞便的施用[5]。LIU 等[7]對2 300 多份豬糞樣品進行統計分析，發現豬糞中 Cu 濃度介于 72.66~1 288.00 mg·kg?1，平均為531.37 mg·kg?1，且因畜禽糞便中豬糞產量最高，因此豬糞還田是農田土壤中Cu來源的主要貢獻者。

規模化養殖業大量使用獸用抗生素，同重金屬一樣，30%~90%的抗生素并不能被畜禽代謝，而是隨著畜禽糞便排出體外，經農用后進入土壤環境[8]。豬糞中磺胺二甲嘧啶（SMZ）濃度甚至可高達28.7 mg·kg?1[9]。畜禽糞便還田導致抗生素持續輸入農田土壤，目前我國農田土壤中獸藥抗生素的濃度介于每千克微克級到毫克級之間[10]。土壤中抗生素的存在會影響土壤微生物結構與功能，導致抗性基因大量傳播，具有較大的生態毒性[11]。

土壤CH4是在極端厭氧的條件下，由土壤中產甲烷菌利用其他微生物發酵形成的低碳有機酸、H2和CO2等物質為底物轉化產生[12]。土壤CH4排放是產甲烷菌和甲烷氧化菌共同作用的結果。重金屬能夠阻礙微生物本身的蛋白質合成以及相關酶類的生成與分泌，或者通過土壤中重金屬的氧化還原過程直接抑制微生物的新陳代謝，改變微生物數量和活性[13]。抗生素對靶標微生物主要起殺死或抑制效應[14]。因此畜禽糞便施用導致的土壤中重金屬和抗生素含量增多，勢必會對土壤微生物活性產生影響，進而會影響到土壤CH4的排放。已有報道證實在豬糞厭氧消化過程中，添加25、50 mg·L?1四環素和磺胺甲氧二嗪可降低 CH4的產生[15]；而 Cu 離子濃度為 100~300 μg·g?1時可提高CH4產量，濃度為400~600 μg·g?1時，則明顯抑制CH4產量[16]。培養基培養中，隨著重金屬Pb2+、Cd2+和Hg2+濃度的增大，其對甲烷氧化菌生長的抑制作用增強[17]；紅霉素濃度越高對產甲烷菌的抑制作用越明顯，產CH4速率越低[18]。近年來，國內外抗生素和重金屬復合污染對農田土壤CH4排放的研究鮮見報道，已有研究多集中于對堆肥發酵過程或土壤微生物群落結構與活性的影響。如KONG 等[19]的研究表明，土霉素和重金屬Cu 的復合污染對土壤微生物群落的功能多樣性具有負面影響，且表現出明顯的加和作用。YANG等[20]的最新研究表明，一定濃度的Cu和SMZ復合污染相比于單一污染會抑制脲酶、磷酸酶和蔗糖酶的活性，但在一定的暴露時間內卻會促進二磷酸核酮糖羧化酶的活性，促進或抑制酶活作用取決于二者的劑量以及暴露時間。這說明重金屬和抗生素復合污染對土壤有關酶活以及微生物群落結構與功能的影響存在一定的聯合作用，與單一污染影響不同，因而對土壤CH4的排放影響也可能存在不同效果。

隨著畜禽養殖業的規模化擴大，畜禽糞便大量還田，農田土壤中抗生素和重金屬殘留量增高，因此有必要研究兩者復合污染對CH4排放及相關微生物的影響。本文以重金屬Cu和磺胺類抗生素中的典型代表SMZ 作為研究對象，通過室內模擬培養試驗，以未經重金屬和抗生素污染的農家豬糞為肥源，分別添加不同濃度的Cu 和SMZ，探究在不同濃度Cu 和SMZ 單一及復合污染條件下CH4排放，以及與CH4產生有關的功能基因（16S rRNA?CH4和mcrA）和與CH4氧化有關的功能基因（pmoA）豐度的變化[21]，首次分析了Cu和SMZ 復合污染對CH4排放及相關功能基因豐度的交互效應，以期為了解畜禽糞便還田導致的Cu 和SMZ 復合污染對CH4排放的影響及機制提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試土壤采自安徽皖南常規農田0~20 cm耕作層（118°19′E，29°59′N）。土壤pH 為5.15，有機質含量為 88.41 g·kg?1，全氮含量為 1.20 g·kg?1，Cu 含量為28.66 mg·kg?1。供試豬糞來源于未飼喂過含有重金屬和抗生素添加劑飼料的農戶家豬排泄物，屬于有機豬糞，全氮含量為8.81 g·kg?1，全磷含量為1.84 g·kg?1，有機質含量為 720.33 g·kg?1，Cu 含量為 27.72 mg·kg?1。供試土壤和豬糞均未檢測出磺胺類抗生素。

供試抗生素為上海麥克林公司生產的磺胺二甲嘧啶鈉試劑（純度≥98%），供試重金屬試劑為上海阿拉丁公司生產的五水合硫酸銅試劑（純度≥99.0%）。

1.2 試驗設計

室內模擬淹水培養試驗共設16 個處理，以有機豬糞為肥源，Cu 添加的濃度分別為0、100、500、1 500 mg·kg?1，SMZ 添加的濃度分別為 0、0.1、1、5 mg·kg?1，兩兩組合，代碼分別為Cu0+SMZ0、Cu0+SMZ0.1、Cu0+SMZ1、Cu0+SMZ5、Cu100+SMZ0、Cu100+SMZ0.1、Cu100+SMZ1、Cu100+SMZ5、Cu500+SMZ0、Cu500+SMZ0.1、Cu500+SMZ1、Cu500+SMZ5、Cu1500+SMZ0、Cu1500+SMZ0.1、Cu1500+SMZ1、Cu1500+SMZ5，其中Cu0+SMZ0 即為對照（CK）。每個處理9 個重復，其中3個重復用于定期測定CH4排放，6個重復用于培養中間階段土樣微生物測定。每個處理稱取150 g 干土（過10 目篩）置于590 mL 塑料瓶內，加超純水預培養1 周，按設定濃度同步添加豬糞（按N=100 mg·kg?1干土計算，豬糞添加量為每處理干質量1.702 6 g）、Cu和SMZ 后，在恒溫恒濕（25 ℃、95%水分）培養箱中進行室內模擬淹水培養。考慮到土壤和豬糞中存在Cu背景值，代表無污染（Cu0）、低（Cu100）、中（Cu500）、高（Cu1500）濃度處理實際的Cu 濃度分別為29（[4.299 mg 土壤+0.047 mg 豬糞）/0.15 kg 干土）]、129、529 mg·kg?1和 1 529 mg·kg?1。因土壤和豬糞中無背景SMZ 存在，各SMZ 處理實際濃度即為設定濃度。培養試驗中每個培養瓶水深約2 cm，期間土壤水分通過補加超純水（重量法）保持，每3 d 補充1 次。氣體測定頻率為前25 d每日測定，之后2~3 d測定1次。在前期（5 d）、中期（39 d）和培養終期（71 d）分別采集各處理的土壤，放入?80 ℃冰箱中儲存，用于測定CH4排放相關基因的基因豐度。

1.3 樣品采集與測定方法

1.3.1 土壤CH4排放的測定

采用間歇密閉培養?氣相色譜法測定土壤CH4排放速率。采樣時培養瓶處于完全密閉環境，唯一出口用三通閥連接用于采氣。在每日密閉培養開始前，使用針筒通過三通閥從培養瓶中抽取10~15 mL 氣體（背景氣樣），密閉培養12 h 后，用同樣的操作從培養瓶中抽取10~15 mL 氣體（試驗氣樣），每次采樣完成，培養瓶敞口繼續培養。測定儀器為配置了FID 檢測器的氣相色譜儀（GC7890B，安捷倫，美國）。載氣為99.999%高純氮，檢測溫度為250 ℃，柱箱溫度為50 ℃。測得背景氣樣與試驗氣樣的CH4濃度后，經過計算得出密閉培養12 h期間，培養瓶內土壤的CH4排放速率。具體計算公式為：

式中：F為氣體排放速率，ng·g?1·h?1；ρ為氣體密度，g·L?1；V為培養瓶內氣體的有效空間，L；Δt為培養瓶密閉培養時間，h；Δc為Δt時間內培養瓶內氣體濃度差，μg·g?1；W為培養瓶內土壤干質量，g；A為分子量；T為培養溫度，℃。

通過3 個重復觀測的數據按時間加權平均后獲得CH4的排放總量，計算公式為：

式中：M為氣體累計排放量，ng·g?1；N為采樣次數；t為采樣時間（距離第一次采樣的天數），d；F為氣體排放速率，ng·g?1·h?1。

1.3.2 土壤樣品的測定

采用 PowerSoil?DNA Isolation kit 強力土壤 DNA提取試劑盒法提取土壤樣品全基因組。使用Nano?Drop2000 超微量紫外分光光度計測定提取出的土壤總DNA 濃度，并將所有樣品的DNA 濃度調節為10 ng· μL?1，然 后 使 用 Applied?Biosystems Real?Time PCR 儀采用實時熒光定量PCR 技術測定各功能基因豐度。PCR 擴增采用20 μL 反應體系，包括：10 μL 擴增酶混合物 SYBR Premix ExTaqTM（2×）；6.8 μL ddH2O；2 μL DNA 模板；0.4 μL ROX Reference Dye（50×）；0.4 μL Forward Primer（10 μmol·L?1），0.4 μL Reverse Primer（10 μmol·L?1），即正反向引物各 0.4μL。引物及相應擴增程序見表1。

表1 目的基因的引物序列Table 1 Primer set for the target genes

1.4 數據統計與聯合效應判斷

采用Excel 2019 和SPSS Statistics 21.0 軟件進行數據統計分析，采用Origin Pro 2021 軟件作圖。當二因子方差分析Cu 和SMZ 交互影響顯著時，將Cu 和SMZ 的個體效應[即CH4減排率或基因豐度降低率=（1－T單/TCK）×100，T單代表 Cu 或 SMZ 單一處理]加和（M1=RCu+RSMZ，RCu和RSMZ分別代表Cu和SMZ單一處理CH4減排率或基因豐度降低率）或計算獨立作用效應結果[M2=RCu+RSMZ×（1－RCu/100）]來判斷復合污染處理的聯合效應[Mx=（1?T復/TCK）×100，T復代表 Cu 和 SMZ復合處理）]。經t檢驗，若Mx與M1或M2有顯著差異（P<0.05），則Mx>M1為協同作用，反之為拮抗作用；當Mx與M1或M2無顯著差異（P>0.05）時，Mx≈M1為加和作用，Mx≈M2為獨立作用[22]。

2 結果與分析

2.1 Cu 和SMZ 單一及復合污染對土壤CH4排放動態變化及累積排放的影響

模擬淹水狀況下，各處理土壤CH4排放速率動態變化如圖1 所示。從動態圖可以看出，各處理CH4排放速率在培養前期動態變化趨勢基本一致，培養后期出現分化，單一添加SMZ的處理CH4排放速率有升高趨勢（圖1a），而添加Cu 的處理則逐步降低，Cu100+SMZ0.1 處理除外（圖1b~圖1d）。經培養時間與處理二因子方差分析發現，培養前期（0~12 d）處理間CH4排放速率無顯著差異（P>0.05），僅每次測定之間有顯著差異（P<0.05）。培養后期（13~71 d），每次測定之間以及處理之間CH4排放速率皆有顯著差異（P<0.05）。

進一步計算各處理CH4累積排放量及CH4減排率，并判斷其聯合效應，結果如圖2 所示。培養前12 d 的各處理CH4累積排放量之間總體上無顯著差異，總累積排放量的差異性主要取決于第13~71 d 的差異性。無Cu 添加條件下，單一SMZ 處理存在明顯的低促高抑濃度效應：相對于CK，Cu0+SMZ0.1 的CH4總累積排放量增加了19.7%，而SMZ1 和SMZ5 的CH4總累積排放量分別顯著減少了16.8%和40.6%（P<0.05）。無 SMZ 添加條件下，單一 Cu 處理與 CK 相比，CH4總累積排放量均顯著減少了77%左右（P<0.05），且沒有表現出明顯的濃度效應。不同濃度SMZ 和Cu復合污染均顯著降低CH4累積排放（P<0.05），但交互效應比較復雜。

SMZ和Cu的二因子方差分析結果表明（表2），二者不同濃度組合下對CH4排放有極顯著的聯合效應（P<0.001）。除了SMZ 和Cu 雙低濃度復合污染時（Cu100+SMZ0.1）為簡單的加和作用以及低濃度SMZ與中濃度的Cu（Cu500+SMZ0.1）組合時為協同作用外，其他濃度SMZ 和Cu 組合交互效果不同。隨著SMZ 濃度的增加，這種交互作用變為獨立作用。當SMZ濃度達到5 mg·kg?1時，無論Cu濃度的高低，皆是拮抗效應（圖2）。

2.2 Cu 和SMZ 單一及復合污染對土壤CH4排放的相關功能基因豐度的影響

不同處理在培養至第5、39 d 和第71 d 的16S rRNA?CH4、mcrA 和pmoA 基因豐度變化分別如圖 3~圖5 所示。單因子方差分析表明，3 個培養期16 個處理間 16S rRNA?CH4、mcrA 和pmoA 基因豐度差異均極顯著（P<0.01）。Cu 和SMZ 單一及復合污染對與產甲烷菌有關的16S rRNA?CH4和mcrA 基因豐度的影響規律比較類似：在培養前期（第5 d），Cu0+SMZ5、Cu100+SMZ1、Cu500+SMZ1 和 Cu1500+SMZ1 處理顯著提高了此二者的豐度（P<0.05），其他處理與CK 相比均無顯著差異（P>0.05）。在培養中期（第39 d），不同濃度 SMZ 單一污染對 16S rRNA?CH4和mcrA 基因豐度均無顯著影響（P>0.05）。不同濃度Cu 單一污染均顯著降低16S rRNA?CH4基因豐度（P<0.05），而對mcrA基因豐度無顯著影響（P>0.05）。Cu和SMZ復合污 染 中 ，0.1 mg·kg?1SMZ 與 各 濃 度 Cu 組 合 以 及Cu100+SMZ1、Cu500+SMZ1 的組合均顯著降低16S rRNA ?CH4基因豐度（P<0.05），減少幅度為 50%~82%；除Cu500+SMZ1 顯著降低mcrA 基因豐度11.7%外（P<0.05），其他復合處理對基因豐度都無顯著影響。在培養后期（第71 d），中高濃度SMZ（1、5 mg·kg?1）單一污染均顯著降低 16S rRNA?CH4和mcrA 基因豐度（P<0.05）。此外，中高濃度Cu 單一污染顯著降低 16S rRNA?CH4基因豐度（P<0.05），無論單一Cu 濃度高低，其對mcrA 基因豐度均無顯著影響（P>0.05）。復合處理中，無論Cu 濃度高低，中高濃度SMZ（1、5 mg·kg?1）以及高 Cu 低 SMZ 處理（Cu1500+SMZ0.1）均顯著降低16S rRNA?CH4和mcrA 基因豐度（P<0.05）。

Cu 和SMZ 單一及復合污染對與甲烷氧化菌有關的pmoA基因豐度在不同培養階段的影響規律比較一致，基本表現為SMZ 單一污染，在培養前中期低濃度無影響、高濃度降低，培養后期3 個SMZ 濃度均有顯著影響（P<0.05）；3 種Cu 濃度單一處理，無論在哪個培養階段均顯著降低pmoA基因豐度；復合處理中，除前期含低濃度 SMZ（0.1 mg·kg?1）處理組合外，其余所有處理均顯著降低pmoA基因豐度（P<0.05）。

總之，SMZ單一污染對三大基因豐度有明顯的濃度效應（低增或無影響、高降）和輸入時間效應（前增、中無影響、后降），而Cu 單一污染對16S rRNA?CH4基因也有類似SMZ 單一污染的濃度及輸入時間效應，表現為低無影響高降、前無影響后降的規律，但對mcrA 和pmoA 基因豐度無明顯濃度規律。Cu 和SMZ復合污染對16S rRNA?CH4和mcrA 基因豐度影響程度更多取決于SMZ濃度的高低。相比16S rRNA?CH4和mcrA 基因豐度，pmoA 基因豐度對 Cu 和 SMZ 單一及復合污染的響應更敏感，且主要表現為降低效應。

進一步進行Cu 和SMZ 二因子方差分析，結果見表2。SMZ 和Cu 交互效應有一個明顯的規律，即都是在培養的前后期對三大基因豐度有顯著影響（P<0.05），培養中期均沒有顯著影響（P>0.05）。對于16S rRNA?CH4基因豐度（圖3），培養前期不同濃度SMZ 和Cu 組合的交互效應以獨立和相加作用為主，僅在SMZ濃度較高情況下（5 mg·kg?1）出現拮抗效應，但Cu1500+SMZ5 處理除外，為獨立作用；培養末期中低濃度以獨立作用為主，SMZ 和Cu 均為最高濃度的組合（Cu1500+SMZ5）為拮抗效應。對于mcrA 基因豐度（圖4），無論培養前期還是后期，低濃度以協同和相加作用為主，中高濃度以拮抗效應為主。對于pmoA 基因豐度（圖5），培養前期，除了最高濃度組合為獨立作用外，其他SMZ 和Cu 組合的交互效應均是拮抗效應；在培養后期，除Cu100+SMZ5 為拮抗效應外，其他各復合污染處理均為獨立作用。總之，兩者復合污染的聯合作用比較復雜，主要取決于兩污染物的起始濃度及SMZ輸入土壤的時間。

表2 CH4累積排放總量及相關功能基因豐度的SMZ和Cu處理二因子方差分析結果（P值）Table 2 Results of two?way ANOVA on cumulative CH4emissions，and the abundance of 16S rRNA?CH4，mcrA and pmoA genes in experiment with SMZ and Cu singly or in combination（P values）

經相關分析，未能發現CH4排放速率與各相關微生物功能基因豐度之間在第5 d 有顯著相關關系（P>0.05），但在培養的第 39 d 和第 71 d，CH4排放速率與16S rRNA?CH4和pmoA 基因豐度的對數值皆呈顯著正相關（P<0.05），僅在第39 d，CH4排放速率與mcrA基因豐度呈顯著正相關（P<0.05）。

3 討論

3.1 CH4排放對SMZ單一污染的響應及其機制

本研究供試土壤為酸性土，在SMZ 單一污染條件下，不同濃度SMZ對土壤CH4排放的影響有明顯的濃度效應，存有低促高抑現象（圖2），尤其反映在培養的中后期（圖1），這與徐佳迎[23]在堿性土上的研究結果一致。SHI等[15]的研究也表明高濃度磺胺類抗生素（250、500 mg·kg?1）在豬糞厭氧消化中顯著降低CH4累積排放。即便是含5 mg·kg?1SMZ的豬糞，在厭氧堆肥過程中也表現出對CH4排放的明顯抑制效應[24]。田間原位研究結果也證實SMZ 影響CH4排放在不同的環境條件下表現不一，10、30 mg·kg?1SMZ對水稻生長季CH4排放有明顯的前抑后促特征，尤其與豬糞協同作用下水稻生長中后期促進作用比較明顯[25]。這種前抑后促或低促高抑現象的產生，與SMZ在土壤中的降解轉化有關。田間原位試驗及室內機理研究表明低濃度的SMZ 更易被土壤微生物降解轉化成小分子物質，從而可作為新的碳源利用；高濃度的SMZ 通過影響土壤微生物群落結構直接或間接降低產甲烷菌活性，表現為在培養后期明顯降低了16S rRNA?CH4、mcrA 和pmoA 基因豐度（圖3~圖5），進而減少了CH4的排放[23]。中、高濃度SMZ 進入土壤后母體去除較快，中間降解產物卻種類較多，即便輸入稻田土壤47 d和61 d后，依舊存有一環或二環類中間產物，其中以2?氨基?4，6 二甲基嘧啶和4?（2?亞氨基?4，6?二甲基嘧啶?1（2H）?基）苯胺為主[26]。而SMZ 的降解產物本身如2?氨基?4，6?二甲基嘧啶也能促進CH4排放，這是SMZ影響CH4排放前抑后促的原因[23]。

3.2 CH4排放對Cu單一污染的響應及其機制

在本研究Cu 單一污染濃度條件下，各Cu 處理均顯著降低了CH4的排放（圖2），主要反映在培養的中后期，減排尤其明顯，甚至出現負值（圖1），這可能是因為本研究中Cu 的濃度較高，導致土壤中微生物活性降低的緣故，反映在本研究結果中就是培養中后期中高濃度明顯降低了16S rRNA?CH4和pmoA 基因豐度（P<0.05）（圖3 和圖5），濃度越高，降低程度越大；但對mcrA基因豐度的影響不明顯（圖4），也不存在濃度效應。MISHRA 等[27]在室內培養研究中也發現，即便是低濃度的Cu2+（20μg·g?1）添加（以CuCl2形式）也會對3 種不同水稻土CH4的產生有抑制作用，然而也有報道證實低濃度的Cu2（+<10 mg·L?1）可以促進畜禽廢水厭氧消化過程中產CH4速率[28]。最近的報道發現，添加26μmol·L?1Cu2（+以CuSO4形式）在較短的培養周期（96 h）內促進了濕地土壤（背景值Cu2+為37.8 mg·kg?1）CH4的排放，對mcrA 基因豐度的影響不顯著（P>0.05）[29]，與本研究條件下，無論Cu 濃度高低均未顯著影響mcrA基因豐度的結果一致。XU等[30]將Cu2+以CuSO4形式添加至農田土壤（Cu2+背景值為20.15 mg·kg?1），在 40% 最大田間持水量條件下培養 28 d 的研究發現，低濃度Cu2（+20 mg·kg?1）僅在培養前期（0~14 d）降低了土壤微生物的活性，而在培養后期顯著增加了土壤微生物的活性（P<0.05），高濃度（200 mg·kg?1）的Cu2+在整個培養周期均顯著降低了土壤微生物的活性（P<0.05）。MOHANTY 等[31]同樣在室內培養中發現，添加較低濃度的 Cu（25 mg·kg?1）僅在土壤60%田間持水量條件下顯著促進了水稻土的甲烷氧化菌活性，而在淹水條件下卻是輕微的抑制作用。重金屬抑制CH4氧化的濃度效應與土壤中的氧氣含量有關[32]，進一步說明Cu 的生物有效性或毒理效應取決于土壤環境狀況，如水分、pH 等，對土壤微生物活性以及CH4產生也存在低促或無影響以及高抑現象。低濃度Cu 對土壤CH4產生的影響不顯著可能是土壤有機質對Cu 有吸附及固定作用，以及Cu 本身可作為土壤酶活性位點之一的緣故[33]。目前關于重金屬影響土壤微生物及土壤碳轉化的結果通常基于室內模擬研究以及重金屬添加后的短期效應，尤其是已有研究通常是人為模擬添加CuSO4或CuCl2化學試劑進行污染條件的設定，高硫或高氯離子的存在對碳氮轉化的影響尚沒有定論，這也是目前室內毒理效應結果不能夠外推到田間實際污染情況下的主要原因之一[34]。如何確定田間重金屬逐步積累污染條件下碳的轉化變化以及不同重金屬對CH4排放的影響，進而判定畜禽糞便中重金屬的輸入在土壤中的風險值是今后進一步研究的方向。

3.3 Cu 和SMZ 復合污染對CH4排放的影響及其交互效應

Cu 和SMZ 分屬于無機物和有機物，二者進入土壤后會有何反應，尚不清楚。MOREL 等[35]曾報道過當土壤pH=6 時Cu2+的存在會使土壤中磺胺甲惡唑（SMX）的吸附作用強烈增加（增加了6 倍），這一發現有力地支持了酸性土壤中可能會形成三元SMX?Cu?土壤復合物的假設。SMZ 與SMX 同屬于磺胺類藥物，結構相似，只是基團不同，其是否也能夠在酸性環境中與Cu 形成新的螯合物，尚需進一步研究。但本研究證實，不同濃度SMZ 和Cu 復合污染對CH4排放以及相關產甲烷菌的功能基因豐度在培養前后期都有顯著的交互效應（表2），尤其培養后期濃度較高時，拮抗效應越強（圖2~圖5），這可能與形成新的螯合物有關。也可能是因為SMZ 在土壤環境中更易被降解，而Cu 在土壤中具有更高的持久性。有報道證實施用豬糞6個月后，土壤中Cu各形態含量較1個月時無明顯變化[36]。本研究僅分析了SMZ 和Cu 復合污染對整個培養周期CH4累積排放的交互效應，因不同培養期SMZ 在土壤中的降解情況不同，可能SMZ 和Cu 復合污染的交互效應也不相同。劉愛菊等[37]的研究也表明不同濃度磺胺甲基嘧啶（0、5、25、50、100 mg·kg?1）與Cu（0、100、500 mg·kg?1）復合污染處理下，低劑量 Cu（100 mg·kg?1）的協同污染對土壤微生物呼吸，土壤微生物量碳、氮以及土壤脲酶等指標的活性均明顯增加，而 Cu 為 500 mg·kg?1時與磺胺甲基嘧啶對土壤各微生物指標則基本表現為協同抑制作用。YANG 等[20]發現，同一濃度 Cu（1.6 mmol·kg?1Cu2+）和不同濃度的 SMZ（0、0.05、0.2、0.8 mmol·kg?1）復合污染對土壤酶活性的交互影響并不是一種單一的相加效果，不同組合比以及不同培養周期對不同酶活性的影響都不相同。對于蔗糖酶活性，低濃度SMZ 和Cu復合污染時為拮抗作用，隨著SMZ 濃度的增加，這種拮抗作用變為協同作用。在SMZ 和Cu 摩爾比為1∶32 時（0.05 mmol·kg?1SMZ+1.6 mmol·kg?1Cu），Cu 和SMZ 復合污染在培養7、14、21、28 d 中對脲酶均有協同作用，隨著SMZ 濃度的增加，拮抗作用逐漸顯現出來。對于磷酸酶則是在第7 d和第14 d觀察到協同作用，在第21 d 和第28 d 時有拮抗作用。對于RubisCO酶的活性，不同濃度SMZ 和Cu 復合污染在不同培養周期均為協同作用。這說明磺胺類抗生素和Cu復合污染對土壤微生物結構與功能以及土壤酶活性的影響比單一污染結果復雜，對CH4排放的影響機制尚需進一步研究。規模化養殖業產生的大量非有機畜禽糞便還田使得土壤中抗生素和重金屬濃度均較高[7，11]，土壤抗生素和重金屬的引入不容忽視，本研究結果雖然明確了在此濃度范圍的SMZ和Cu復合污染降低了CH4排放，但在實際情況下畜禽糞便還田后的環境效應或風險評價尚需通過田間長期定位試驗來進一步判定。

4 結論

（1）單一SMZ 污染對土壤CH4排放及三大關聯基因 16S rRNA?CH4、mcrA 和pmoA 基因豐度具有明顯的低增或無影響、高降的濃度效應及前增或無影響、后降的輸入時間效應。

（2）單一Cu 污染除了對16S rRNA?CH4基因豐度有類似SMZ的濃度和輸入時間效應外，對CH4排放及其他兩基因豐度均未表現出明顯的濃度與時間效應。

（3）SMZ 和 Cu 復合污染對土壤 CH4排放及相關基因豐度作用的聯合效應取決于兩污染物的起始濃度與輸入時間。

（4）三大關聯基因中，pmoA 基因豐度對Cu 和SMZ單一及復合污染響應更敏感，且主要表現為降低效應。