SD大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及高糖模型建立

楊 曼，譚 薇，劉 暢

0引言

視網(wǎng)膜神經(jīng)節(jié)細(xì)胞(retinal ganglion cells，RGCs)是視網(wǎng)膜的唯一輸出神經(jīng)元，對于視覺功能和晝夜節(jié)律至關(guān)重要[1]。RGCs及其視神經(jīng)軸突神經(jīng)退行性改變是引起嚴(yán)重視覺損害的多種疾病的基礎(chǔ)，探索RGCs的病理改變和簡單高效的RGCs體外原代培養(yǎng)模型的建立尤為重要。

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)可導(dǎo)致嚴(yán)重的視力喪失。有研究已經(jīng)證實，在DR發(fā)展早期，沒出現(xiàn)視網(wǎng)膜微血管病變之前就已經(jīng)出現(xiàn)糖尿病性視神經(jīng)病變[2-3]。因此，探索DR早期視網(wǎng)膜神經(jīng)元的變化對DR的病理發(fā)生發(fā)展過程有著重要意義。與糖尿病動物模型實驗相比，在體外建立原代RGCs高糖模型，不僅可以排除機(jī)體可能存在的其他干擾因素，還可以更直觀地觀察高糖誘導(dǎo)特定階段的RGCs的變化。RGCs為高度分化細(xì)胞，不會增殖，所以只能進(jìn)行原代培養(yǎng)，使得RGCs體外培養(yǎng)難度加大。目前針對RGCs細(xì)胞培養(yǎng)方法以及高糖處理的細(xì)胞模型建立仍十分有限，本文旨在通過體外實驗探索出更為簡單有效的RGCs細(xì)胞培養(yǎng)方法以及高糖處理的細(xì)胞模型建立，為研究DR導(dǎo)致的RGCs病變體外細(xì)胞建模提供一定基礎(chǔ)。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物實驗中使用的所有新生(1～3d)SD大鼠均由遵義醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供，實驗SD大鼠飼養(yǎng)濕度：50%～65%，溫度：20℃～25℃，環(huán)境安靜，避免強(qiáng)光照射,通風(fēng)換氣：每小時8～12次，雌雄不限，符合國家醫(yī)用動物使用標(biāo)準(zhǔn)，SPF級，遵守《ARVO眼科和視覺研究中動物的使用聲明》并通過《遵義市第一人民醫(yī)院動物倫理審查》。

1.1.2主要試劑磷酸緩沖鹽溶液(phosphate buffer saline，PBS)、L-谷氨酰胺、4’,6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)均購于美國Sigma公司；B-27 Serum-Free Supplement(美國Invitrogen公司)；Neurobasal Medium、0.25%胰蛋白酶均購于美國Gibco公司；100×青霉素/鏈霉素、甲苯胺藍(lán)染液購于北京索萊寶公司；胸腺細(xì)胞抗原-1(Thymus cell antigen-1，Thy-l)抗體、Mouse Anti Brn-3a monocloal Antibody(Brn-3a)、CD11b抗體、熒光二抗[熒光(Cy3)標(biāo)記羊抗小鼠IgG]均購于英國Abcam公司；多聚賴氨酸-D(大連美侖生物技術(shù)有限公司)；75%乙醇(南京醫(yī)用試劑)；濃縮型正常山羊血清(封閉)(武漢博士德生物工程有限公司)；一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測試劑盒(綠色FITC標(biāo)記檢測法)(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；CCK8試劑盒(南京凱基生物科技發(fā)展有限公司)；抗熒光淬滅封片劑(美國SouthernBiotech公司)；0.3% Triton X-100(上海碧云天公司)。主要試劑配制見表1。

表1 主要試劑配制

1.2方法

1.2.1器械準(zhǔn)備將實驗操作所需的顯微手術(shù)器械進(jìn)行高壓滅菌消毒；細(xì)胞培養(yǎng)間、光學(xué)顯微鏡、耗材、超凈工作臺等提前并不低于30min紫外燈照射滅菌。

1.2.2培養(yǎng)板/培養(yǎng)瓶及爬片的包被用CD11b溶液、Thy-1抗體(稀釋比為1∶500)及0.01%多聚賴氨酸-D室溫下包被培養(yǎng)瓶或預(yù)先放好無菌爬片的培養(yǎng)板，放入37℃恒溫箱2h(或者放入37℃恒溫箱包被過夜，包被好的培養(yǎng)板可放于4℃冰箱，用PBS洗3次，每次5min，超凈工作臺晾干備用。

1.2.3RGCs的分離和接種及純化培養(yǎng)(1)細(xì)胞分離：取出生后1～3d的SD大鼠，用75%乙醇浸泡消毒15～20min后在顯微鏡下無菌取眼球，并將眼球放于加入適量100×青霉素/鏈霉素的PBS液玻璃培養(yǎng)皿中，浸泡15min后，在解剖顯微鏡下用眼科顯微剪沿角膜緣后0.5mm剪開眼球，用眼科顯微鑷去除新生鼠晶狀體和玻璃體，剝離視網(wǎng)膜神經(jīng)層組織并用顯微剪剪碎，加入適量0.25%胰蛋白酶(10只眼球約需3mL)放入37℃，5%CO2恒溫箱消化15～20min(每隔3～5min拿出來用玻璃吸管輕輕吹打懸液5～8次)，待大鼠視網(wǎng)膜組織完全消化后，1 500r/min離心5min，去除上清液。加入與胰蛋白酶等量的Neurobasal Medium溶液震蕩1～2次，終止消化，1 500r/min離心5min去除上清液。(2)細(xì)胞純化：終止消化離心去上清液后加入2mL配制好的CD11b溶液，輕輕振蕩3～5min，使膠質(zhì)細(xì)胞等充分與抗體結(jié)合，1 500r/min離心5min去除上清液。加入適量Neurobasal Medium，40μm濾網(wǎng)過濾細(xì)胞到預(yù)先用山羊抗大鼠IgG抗體包被過的培養(yǎng)瓶中，37℃，5%CO2恒溫孵育20～25min，使細(xì)胞懸液中結(jié)合了CD11b抗體的細(xì)胞通過抗原抗體反應(yīng)沉積在培養(yǎng)瓶底部。再將細(xì)胞懸液倒入預(yù)先用Thy-1抗體(稀釋比為1∶500)包被過的培養(yǎng)瓶，37℃，5%CO2恒溫孵育30min，讓RGCs充分與抗體結(jié)合，吸出上清液，PBS漂洗培養(yǎng)瓶3～5次，適量0.25%胰蛋白消化5～10min，等量的Neurobasal Medium溶液震蕩1～2次，終止消化，1 500r/min離心5min去除上清液，完成細(xì)胞純化。(3)細(xì)胞接種：細(xì)胞純化后加入適量的配置的培養(yǎng)基，使用細(xì)胞濾網(wǎng)(70μm)均勻的接種于培養(yǎng)板中，在加入適量培養(yǎng)液，調(diào)整細(xì)胞數(shù)為1×105cell/mL，并對培養(yǎng)板做好標(biāo)記后放入5%CO2細(xì)胞孵育箱(37℃)中孵育。每天在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞生長情況(細(xì)胞大小、形狀、軸突長短等)并拍照，3d左右對其進(jìn)行培養(yǎng)基全量換液。

1.2.4甲苯胺藍(lán)染色鑒定視網(wǎng)膜神經(jīng)元提取3～5d在體外純化培養(yǎng)的細(xì)胞，將已長有細(xì)胞的爬片用PBS浸洗3次，每次5min；加入適量4%多聚甲醛剛好浸沒爬片，固定30min后用PBS浸洗3次，每次5min；加入尼式染色試劑后將爬片置于50℃～60℃干燥箱浸染30～40min，PBS浸洗爬片3次，每次5min，95%乙醇分化脫水3～5s，PBS浸洗爬片3次，每次5min，顯微鏡下觀察采集圖像。

1.2.5體外純化培養(yǎng)細(xì)胞的鑒定細(xì)胞在體外培養(yǎng)3～5d后，在培養(yǎng)板中將已長有細(xì)胞的爬片用PBS浸洗3次，每次5min；用4%多聚甲醛固定爬片30min，PBS浸洗爬片3次，每次5min。固定完成后的爬片用配制好的Triton X-100對細(xì)胞進(jìn)行通透20min(室溫)后用PBS浸洗爬片3次，每次5min。細(xì)胞完成通透后，室溫下在玻片上滴加足量的封閉液(山羊血清)對爬片進(jìn)行封閉30min；吸水紙吸干每張爬片上的山羊血清后在滴加足已浸沒爬片的一抗(稀釋比為1∶50)放入濕盒，4℃孵育過夜。第2d加熒光二抗：PBS浸洗爬片3次，每次5min，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加稀釋好的熒光二抗，濕盒中37℃孵育1h，PBS浸洗切片3次，每次3min(注意：從加熒光二抗起，后面所有操作步驟都盡量在較暗處進(jìn)行)；適量DAPI浸染爬片5min后(注意避光)用PBS浸洗爬片3次，每次5min；吸水紙吸干爬片上多余的PBS，用抗熒光淬滅劑的封片液封片，在熒光顯微鏡下觀察采集圖像。

人工智能人才培養(yǎng)要重視應(yīng)用驅(qū)動。當(dāng)今人工智能已經(jīng)滲透于各行各業(yè)，正不斷提高實體經(jīng)濟(jì)發(fā)展的質(zhì)量和效益。在人才培養(yǎng)過程中要特別重視以應(yīng)用為導(dǎo)向，在豐富場景下推動人工智能人才的成長。

1.2.6RGCs高糖模型的建立細(xì)胞培養(yǎng)2～3d時，對細(xì)胞進(jìn)行換液并隨機(jī)將細(xì)胞分為正常對照組(5.5mmol/L)及不同葡萄糖濃度(20、25、30、35、40mmol/L)干預(yù)的高糖模型組。分別用CCK8及TUNEL檢測換液后連續(xù)培養(yǎng)24、48、72h細(xì)胞的活力及凋亡率，根據(jù)實驗結(jié)果，確定葡萄糖干預(yù)的最適濃度及干預(yù)時間，為后續(xù)實驗提供依據(jù)。

1.2.7CCK8法檢測原代RGCs的存活率(1)實驗分組：正常對照組(5.5mmol/L)，不同濃度高糖組(20、25、30、35、40mmol/L)。(2)CCK8檢測細(xì)胞存活率：原代分離細(xì)胞，以5×103個/孔，接種在96孔板上，同時設(shè)空白組，37℃培養(yǎng)過夜(在細(xì)胞孔周圍孔內(nèi)加入100μL無菌PBS減少檢測液揮發(fā))。細(xì)胞培養(yǎng)3d左右，按照實驗分組加入不同濃度的葡萄糖，空白組加入等體積的細(xì)胞培養(yǎng)基，設(shè)置3個復(fù)孔，在細(xì)胞孔周圍加入100μL PBS；分別處理24、48、72h。加入10μL CCK8，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～4h。加入10μL CCK8，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2～3h。酶標(biāo)儀測定在波長為450nm下各組的吸光光度值(OD值)，重復(fù)3次，取平均值。按照存活率公式：細(xì)胞存活率=[(As-Ab)/(Ac-Ab)]×100%(As：實驗孔；Ac：對照孔；Ab：空白孔)進(jìn)行計算。

1.2.8TUNEL法檢測原代RGCs的凋亡率(1)在培養(yǎng)板中將已長有細(xì)胞的爬片用PBS浸洗3次，每次5min；用4%多聚甲醛固定爬片30min(室溫)，PBS浸洗爬片3次，每次5min。細(xì)胞浸入Triton X-100通透液，通透5min(室溫)；隨后，PBS浸洗爬片3次，每次5min。配制TdT酶反應(yīng)液：每張爬片用量45μL(Equilibration Buffer 加入1.0μL biotin-11-dUTP和4.0μL TdT Enzyme，即用即配，注意避光)。(2)樣本周圍用吸水紙吸干，每個樣本上滴加50μL TdT酶反應(yīng)液，放入溫盒中，37℃，避光反應(yīng)60min，隨后用PBS漂洗3次，每次5min。(3)細(xì)胞爬片周圍吸水紙吸干，每張爬片滴加50μL Streptavidin-Fluorescein標(biāo)記液(Streptavidin-Fluorescein試劑按每張爬片5μL用量與45μL Labeling-Buffer混勻，計算所需的總量后，即用即配，注意避光)放入濕盒，37℃，避光反應(yīng)30min，隨后用PBS漂洗3次，每次5min，注意避光。(4)用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在熒光顯微鏡下(激發(fā)波長450～500nm，發(fā)射波長515～565nm)觀察采集圖像。熒光顯微鏡下組織切片上凋亡的細(xì)胞呈綠色熒光，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。通過Image J對細(xì)胞凋亡數(shù)目進(jìn)行計數(shù)，最終通過公式計算出各組細(xì)胞凋亡率。凋亡率(%)=陽性細(xì)胞凋亡數(shù)/所有細(xì)胞總數(shù)×100%。

2結(jié)果

2.1成功培養(yǎng)SD大鼠原代RGCs 離體培養(yǎng)的RGCs接種在包被好的培養(yǎng)基或培養(yǎng)瓶中立即觀察，細(xì)胞呈圓形或橢圓形，可見部分細(xì)胞聚集成團(tuán)，4～6h細(xì)胞開始貼壁，大約1d后細(xì)胞基本完全貼壁。RGCs培養(yǎng)1d后可見部分胞體聚集生長，并開始漸長出幾十微米的軸突(圖1A)；RGCs培養(yǎng)第2～5d，細(xì)胞生長狀態(tài)良好，細(xì)胞胞體明顯，可見相互交錯成網(wǎng)絡(luò)樣的軸突，小片狀融合聚集生長，胞體周圍可見神經(jīng)細(xì)胞特有的光暈(圖1B～E)；培養(yǎng)至6d左右發(fā)現(xiàn)細(xì)胞開始凋亡(圖1F)；第7～8d可見較多RGCs凋亡，胞質(zhì)中可見呈凋亡改變的細(xì)胞核，存活下來的胞體可見較長的軸突，長度約細(xì)胞胞體的5～6倍，軸突之間相互交錯(圖1G、H)。

圖1 倒置顯微物鏡下體外培養(yǎng)1～8d的細(xì)胞圖片 A：RGCs體外培養(yǎng)1d；B～E：RGCs體外培養(yǎng)3～5d；F：RGCs體外培養(yǎng)6d；G、H：RGCs體外培養(yǎng)7～8d。

2.2體外純化培養(yǎng)細(xì)胞鑒定

2.2.1神經(jīng)元鑒定甲苯胺藍(lán)著染的細(xì)胞胞體中可見神經(jīng)細(xì)胞特征性的清晰地著染成藍(lán)紫色結(jié)構(gòu)清晰的結(jié)節(jié)為尼式小體，非神經(jīng)元細(xì)胞胞體不著色，著染神經(jīng)元陽性率達(dá)95%以上(圖2)。

圖2 細(xì)胞甲苯胺藍(lán)染色染色圖片。

圖3 特異性抗體Thy-1染色結(jié)果 A：Thy-1陽性表達(dá)于細(xì)胞軸突(紅色熒光)；B：DAPI著染細(xì)胞核(藍(lán)色熒光)；C：細(xì)胞形態(tài)呈典型的神經(jīng)元細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可見軸突相互交錯生長，大部分細(xì)胞呈紅藍(lán)雙色著染。

圖4 特異性抗體Brn-3a染色結(jié)果 A：Brn-3a陽性表達(dá)于細(xì)胞核(紅色熒光)；B：DAPI著染細(xì)胞核(藍(lán)色熒光)；C：大部分細(xì)胞呈紅藍(lán)雙色著染。

2.3CCK8檢測細(xì)胞存活率不同濃度葡萄糖分別作用于體外純化培養(yǎng)的RGCs 24、48、72h后，用CCK8法檢測純化培養(yǎng)的RGCs的OD值；不同葡萄糖濃度在不同時間體外純化培養(yǎng)RGCs的OD值差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，隨著時間及葡萄糖濃度的增加，各組細(xì)胞的存活率降低(OD值下降)。在不同葡萄糖濃度干預(yù)細(xì)胞24h時，各分組之間OD值均小于正常對照組，但與正常對照組相比較OD值大小的差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；但隨著時間延長，35、40mmol/L葡萄糖濃度干預(yù)RGCs 48h和30、35、40mmol/L干預(yù)RGCs 72h時的OD值較正常對照組OD值明顯降低，且與正常對照組相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.01)，見表2。

表2 不同葡萄糖濃度在體外純化培養(yǎng)RGCs不同時間點的OD值

2.4TUNEL檢測細(xì)胞凋亡通過對TUNEL結(jié)果分析(圖5)可見隨著葡萄糖濃度增加及時間延長，RGCs的凋亡數(shù)量明顯增加。不同濃度葡萄糖干預(yù)細(xì)胞48h時，如圖濃度為30、35、40mmol/L細(xì)胞凋亡數(shù)量(凋亡率)較濃度為5.5mmol/L細(xì)胞凋亡數(shù)量(凋亡率)明顯增加(圖5)，且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05，圖6，表3)。同理，不同濃度葡萄糖干預(yù)細(xì)胞72h時如圖濃度為30、35、40mmol/L細(xì)胞凋亡數(shù)目(凋亡率)較濃度為5.5mmol/L細(xì)胞凋亡數(shù)目(凋亡率)明顯增加，且差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，見圖6，表3。

表3 不同濃度不同時間下細(xì)胞凋亡率

圖5 隨著時間延長不同濃度葡萄糖對RGCs凋亡影響 綠色熒光為著染的凋亡細(xì)胞。

圖6 各組細(xì)胞凋亡率 aP<0.05 vs 5.5mmol/L。

3討論

視網(wǎng)膜發(fā)育遵循脊椎動物中保守的神經(jīng)源性程序，以連續(xù)但重疊的波協(xié)調(diào)多能視網(wǎng)膜祖細(xì)胞產(chǎn)生特定類型的細(xì)胞。在該程序中，RGCs是第一個生成的細(xì)胞類型[1,5]。在視網(wǎng)膜中，RGCs是視網(wǎng)膜神經(jīng)細(xì)胞中唯一輸出神經(jīng)元，主要將視覺信息進(jìn)行整合傳到大腦視覺中樞[6]。在哺乳動物中，RGCs及其視神經(jīng)軸突神經(jīng)退行性改變是引起嚴(yán)重視覺損害的多種疾病的基礎(chǔ)。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)在糖尿病性視網(wǎng)膜病變早期，在出現(xiàn)視網(wǎng)膜血管病變之前就已經(jīng)出現(xiàn)了RGCs的變性[7]。青光眼、外傷性視神經(jīng)損傷，缺血性損傷，脫髓鞘和遺傳性視神經(jīng)病變等這些病變均會損傷RGCs導(dǎo)致不可逆的視力喪失[8-10〗。RGCs作為多種疾病的靶細(xì)胞，為探索各種疾病的發(fā)病機(jī)制，簡單高效的RGCs體外培養(yǎng)模型的建立尤為重要。在小鼠中，RGCs是最不豐富的視網(wǎng)膜細(xì)胞類型之一，僅包含約50 000個細(xì)胞[11]，且RGCs為高度分化細(xì)胞不會增殖，只能進(jìn)行原代培養(yǎng)，因此，使得RGCs體外培養(yǎng)難度加大。

有學(xué)者在RGCs培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)[12]，出生后3～5d大鼠的RGCs存活率低，建議采用胚胎期、生后早期大鼠來進(jìn)行體外RGCs提取培養(yǎng)，胚胎或新生期組織的神經(jīng)元連接較弱，因此可以在不造成細(xì)胞嚴(yán)重?fù)p傷的情況下進(jìn)行分離和培養(yǎng)。且胚胎期及新生期，細(xì)胞增殖和分化能力強(qiáng)，但胚胎期的胎鼠，需對孕鼠進(jìn)行剖腹取胚胎鼠，整個過程無菌操作難度較大，操作及取材困難，因此本實驗選擇1～3d新生SD大鼠來提取RGCs。

原代培養(yǎng)常用的方法有組織塊直接培養(yǎng)法和胰酶消化分散細(xì)胞法，其中胰酶消化分散細(xì)胞法是目前原代培養(yǎng)RGCs是最常用的方法，尹小磊等[13]采用1.25g/L胰蛋白酶濃度對分離的視網(wǎng)膜進(jìn)行消化20min。本實驗采用0.25%胰蛋白酶消化15～20min，胰蛋白酶濃度更小，對細(xì)胞傷害小，且操作簡單方便。

尼式體或尼式小體是分布于神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的三角形或者橢圓形小塊狀物質(zhì)，能被堿性染料如甲苯胺藍(lán)、硫堇、亞甲藍(lán)和焦油紫等燃料染成紫色，尼式染色常用于神經(jīng)元的染色，尼式小體的存在和消失是神經(jīng)細(xì)胞是否受損的重要指標(biāo)。尼式染色也是區(qū)別神經(jīng)細(xì)胞及非神經(jīng)細(xì)胞的染色方法。神經(jīng)元的胞體和樹突中均有尼氏小體，但軸突和軸丘中沒有。在我們離體純化培養(yǎng)的細(xì)胞胞體中可看到著染成藍(lán)紫色的尼式小體，余軸突為藍(lán)色，非神經(jīng)細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)幾乎不著染，神經(jīng)元陽性率在95%以上，證實我們離體純化培養(yǎng)的細(xì)胞為神經(jīng)細(xì)胞。

Thy-l可特異表達(dá)在嚙齒動物視網(wǎng)膜的RGCs上，而在其他神經(jīng)元上不表達(dá)。Thy-l表達(dá)的差異可能反映了RGCs和其他視網(wǎng)膜神經(jīng)元的功能差異。RGCs與其他視網(wǎng)膜神經(jīng)元的不同之處在于，它們的軸突是有髓鞘的(盡管嚙齒類動物的軸突不在眼睛內(nèi))，它們投射的距離更遠(yuǎn)，并且它們能傳導(dǎo)動作電位。Thy-l為RGCs陽性和陰性選擇的有用標(biāo)記物[14]。目前Thy-l已廣泛用于RGCs標(biāo)記鑒定及分離純化。Brn-3a是POU(Pit-Oct-Une, POU)家族的轉(zhuǎn)錄因子，又稱為轉(zhuǎn)錄因子-1，Brn-3，POU4F1。Brn-3a在鼠類視網(wǎng)膜的發(fā)育過程中，尤其無論在體內(nèi)、體外的神經(jīng)元分化，均有高表達(dá)，Brn-3a在RGCs的存活、分化及軸突延伸發(fā)揮著關(guān)鍵作用，是RGCs可靠的標(biāo)記物[15]。總之，無論是Thy-l還是Brn-3a均可證實我們離體純化培養(yǎng)的細(xì)胞為RGCs，是比較理想的實驗?zāi)Ｐ汀?/p>

長期高血糖，是DR發(fā)生發(fā)展的重要致病因素，研究表明，體外培養(yǎng)時25～30mmol/L的葡萄糖濃度，可近似地等同于糖尿病時體內(nèi)的高糖狀態(tài)[16]。國外研究建立的神經(jīng)元高糖模型[17]，葡萄糖濃度多為15～35mmol/L，張鳳久等[18]通過Wister大鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元高糖模型建立，最終選擇葡萄糖濃度為25mmol/L，與本研究均稍有差異，可能是由實驗動物種屬、使用的培養(yǎng)基、視網(wǎng)膜神經(jīng)元的純度、實驗環(huán)境及條件的不同所導(dǎo)致。本實驗對提取的RGCs在體外培養(yǎng)采用Neurobasal培養(yǎng)基，Liu等[19]研究同樣使用Neurobasal培養(yǎng)基培養(yǎng)視網(wǎng)膜神經(jīng)元干預(yù)，他們最終選擇的葡萄糖最佳干預(yù)濃度為35mmol/L。這與本研究結(jié)果是一致的。本研究還考慮到神經(jīng)元的自然死亡，故在細(xì)胞培養(yǎng)長至3d左右，予以不同濃度葡萄糖對細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，干預(yù)時間不超過72h，保證整個實驗觀察過程都處于神經(jīng)細(xì)胞活性最佳的時候，實驗數(shù)據(jù)更具說服力。

本實驗不同葡萄糖濃度的分別干預(yù)培養(yǎng)細(xì)胞24、48、72h，CCK8檢測結(jié)果提示，隨著時間及葡萄糖濃度的增加，各組細(xì)胞的存活率降低。在不同葡萄糖濃度干預(yù)24h時，各分組之間OD值均小于正常對照組，但與正常對照組相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(均P>0.05)；但在35、40mmol/L葡萄糖濃度干預(yù)RGCs 48h，30、35、40mmol/L葡萄糖濃度干預(yù)72h時細(xì)胞活力與正常對照組細(xì)胞活力相比，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。隨著葡萄糖濃度及時間的增加，RGCs凋亡率增加，且與正常對照組相比，葡萄糖濃度為30、35、40mmol/L干預(yù)培養(yǎng)RGCs 48、72h，RGCs的凋亡率差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(均P<0.05)。過高的葡萄糖濃度和長時間高糖干預(yù)都有可能對培養(yǎng)的細(xì)胞產(chǎn)生不可預(yù)計的影響，故本實驗通過對兩種檢測方法的進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，最終確定35mmol/L葡萄糖濃度干預(yù)RGCs 48h可為有效誘導(dǎo)RGCs建立高糖模型最佳干預(yù)濃度及時間。