角膜新生血管中細胞與分子的研究進展

高月蘭，潘玉苗，楊燕寧

0引言

多種角膜損傷如感染、角膜移植排斥、創傷、炎癥、自身免疫病、先天無虹膜、腫瘤和缺血等可誘導形成角膜新生血管(corneal neovascularization，CNV)，CNV通過輔助清除感染因子和提供營養來加速傷口愈合，但因滲出等可致角膜水腫、視力受損，甚至失明，據估計每年有140萬人出現CNV，其中12%因此視力喪失，此外角膜移植術前存在CNV使排斥風險增加1倍以上、移植失敗可能性增加30%[1]。因此研究CNV發病機制有助于尋找抑制靶點，延緩疾病進展并降低角膜損傷。炎癥是CNV形成的關鍵病理過程，遷移至角膜的炎性細胞與角膜細胞均可產生血管因子，打破促血管生成因子與抗血管生成因子的平衡而促使CNV發生，最終造成角膜水腫及視力下降。本文就CNV形成過程中細胞與分子的作用及可能的治療靶點進行論述。

1炎性細胞

大量研究表明，多種炎性細胞如巨噬細胞和中性粒細胞等主要通過產生血管因子調節CNV，不同炎性細胞的致病機制不同(表1)，同種炎性細胞在不同原因所致CNV中的作用也不完全一致[2-4]。

表1 CNV中炎性細胞及調節機制

巨噬細胞通過吞噬碎片、降解結締組織并作為血管因子主要來源等在堿燒傷CNV中發揮重要作用，已有研究表明多種凋亡調節因子可通過調節巨噬細胞而影響CNV。Liu等比較凋亡調節基因BCL-10敲除和野生型堿燒傷小鼠，發現BCL-10敲除小鼠通過抑制角膜巨噬細胞浸潤來下調堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)和血管內皮生長因子(VEGF)而降低堿燒傷后CNV，表明BCL-10可能是CNV的潛在臨床干預靶標[5]。Tian等發現另一凋亡調節因子caspase-8促進F4/80+巨噬細胞募集，且caspase-8抑制劑可減少巨噬細胞募集而治療CNV[6]。然而近年研究指出巨噬細胞的整體耗竭對堿燒傷后CNV形成可能無明顯影響，選擇性抑制某種巨噬細胞也許是抑制炎性CNV的有效治療方案，Lu等[7]通過免疫染色等觀察缺乏巨噬細胞趨化因子受體CCR2和缺乏CX3CR1的堿燒傷小鼠，發現CCR2缺陷小鼠CNV形成減少，而CX3CR1缺陷小鼠CNV形成增加，說明表達CCR2與CX3CR1的巨噬細胞在血管生成中作用相反，選擇性抑制表達CCR2的巨噬細胞有望抑制炎性CNV。

在小鼠角膜移植后CNV中，Di Zazzo等[4]發現同種異體移植宿主T細胞可能通過VEGE-A、VEGF-C等促進血管內皮細胞生長，表明T細胞是角膜移植后血管形成的關鍵介質；而Li等[8]研究表明小鼠自體角膜移植后消耗巨噬細胞可抑制CNV，因此抑制T細胞和巨噬細胞均有助于角膜移植后CNV的治療。

2角膜細胞

早前研究已證明角膜細胞通過分泌血管因子顯著影響CNV形成，其中上皮細胞分泌VEGF-A和上皮膜蛋白2等，基質細胞分泌VEGF-A、轉化生長因子-β(TGF-β)和基質金屬蛋白酶-13(MMP-13)等，且損傷后角膜細胞分化為成纖維細胞，IL-1β等刺激后者分泌多種基質金屬蛋白酶家族(MMPs)而調節CNV，但并未確定其中的關鍵調節因子[5-6]。近年Yu等[6]通過免疫印跡和ELISA等方法篩選人體CNV形成的關鍵調節因子，發現角膜上皮細胞產生的MMP-9、基質細胞產生的MMP-2和α-晶狀蛋白A鏈、內皮細胞產生的MMP-2和半乳糖凝集素8，可能是炎性CNV形成的關鍵潛在蛋白，為靶向治療炎性CNV提供理論依據。

3血管因子

血管因子失衡是CNV形成的關鍵機制，其中促血管因子包括VEGF、堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、MMPs、TGF-β、IL、血小板衍生因子、血管生成素(Ang)、NO和肝細胞生長因子等，抑血管因子包括色素上皮衍生因子、可溶性VEGF受體-1(sVEGFR-1)、血管抑素、血小板反應蛋白1等[2,9-10]。

3.1VEGF 血管內皮生長因子家族(VEGFs)包括VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D等。既往認為VEGF-A是血管形成的關鍵調節劑，VEGF-B血管生成活性有限甚至抗血管生成,VEGF-C和VEGF-D調節淋巴管生成，而近年研究表明VEGF-A、VEGF-C和VEGF-D均參與血管及淋巴管形成，VEGF-A可刺激淋巴內皮增殖、促進巨噬細胞募集并釋放VEGF-C等促淋巴管生成因子，VEGF-C則可能通過RhoA誘導CNV[11-13]。VEGF是CNV形成的關鍵血管因子，正常眼存在大量VEGF，但由于與sVEGFR-1結合故活性受抑，病理情況下VEGF-A結合VEGFR而激活下游通路[如絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)，NO和PI3K-Akt/PKB通路]以促進CNV[10]。

VEGF-A受體包括VEGFR1及VEGFR2等。多數研究認為VEGFR1抗血管生成，因為VEGFR2酪氨酸激酶活性雖比VEGFR1高，但VEGFR1與VEGF-A更親和，因此VEGFR1可能通過與VEGFR2競爭VEGF-A來防止下游啟動，而VEGF/VEGFR2已被證明是CNV形成的關鍵通路，其可上調信號轉導和活化轉錄因子3(STAT3)核定位和蛋白磷酸化等途徑激活PI3K/Akt通路，是VEGF調節CNV的主要通路[14-15]。然而近年越來越多研究發現VEGFR1在眼部病理血管形成中也起重要作用。Huang等通過對激光誘導的脈絡膜新生血管和缺氧誘導的視網膜新生血管小鼠分別或聯合使用VEGFR1和VEGFR2的特異性中和抗體來阻斷VEGFR1和/或VEGFR2信號轉導，發現新生血管形成過程中VEGFR1和VEGFR2表達上調，而阻斷VEGFR1和/或VEGFR2均可抑制多種眼部病理血管的形成及血管滲漏，且聯合使用VEGFR1和VEGFR2抗體的抑制效果優于單獨使用一種抗體，表明單獨或同時抑制VEGFR1和VEGFR2可抑制眼部病理性血管的形成，且聯合抑制效果更佳[16]。

VEGF作為CNV形成的關鍵血管因子，是抑制各種原因所致CNV的重要靶點，目前多種抗VEGF藥物療效已得到細胞、動物和臨床水平的證實，Papathanassiou等[17]經系統回顧和Meta分析發現臨床貝伐單抗治療后CNV明顯減少，CNV面積總體抑制36%，其中結膜下注射抑制32%，局部應用抑制48%，因此尋找抑制VEGF的靶點具有重要臨床意義，VEGF可被多種因子調控而影響CNV(表2)[2-3,9-10,18-24]。近年研究發現VEGF和sVEGFR-1平衡的破壞是多種臨床背景所致CNV的關鍵致病機制，包括單純皰疹病毒性角膜基質炎(HSK)和角膜移植等。Suryawanshi等[25]發現感染1型單純皰疹病毒(HSV)后VEGF-A表達上調且sVEGFR-1下調，使用抑制sVEGFR-1分解的MMP抑制劑或提供外源sVEGFR-1后CNV均減少，表明臨床上促進sVEGFR-1的形成和活性將顯著抑制HSK患者CNV[26]。另有研究發現角膜移植中調節VEGF及VEGFR和補充sVEGFR均可抑制CNV，推測VEGF與sVEGFR平衡破壞可能影響角膜移植后CNV，但尚需研究驗證[27]。

表2 調節VEGF的分子及調節機制

3.2MMPs MMPs是廣泛表達于人體的鋅依賴性蛋白水解酶，先前研究已表明MMP通過雙重作用調節CNV：(1)發揮蛋白水解酶活性水解細胞外基質(ECM)而為CNV生長提供空間；(2)產生血管抑素和內皮抑素等抗血管生成[28]。MMP-2及MMP-9已被證明在HSK患者CNV形成中作用顯著，二者是控制HSK相關CNV的重要靶點。Lee等[29]觀察到MMP-9活性與HSK病變嚴重程度高度相關，MMP-9基因敲除小鼠CNV生成減少、HSK嚴重程度降低，且使用MMP-9抑制劑基質金屬蛋白酶組織抑制劑-1(TIMP-1)可抑制MMP-9活性從而抑制VEGF誘導的CNV生成。

近年研究著力于MMP-14，有學者發現MMP-2突變小鼠中bFGF仍可誘導CNV，而MMP-14缺失小鼠bFGF完全抑制CNV，表明MMP-14而非MMP-2在CNV的過程中起著關鍵作用[1]。MMP-14在CNV中的作用機制包括:(1)裂解ECM；(2)上調血管因子如VEGF、bFGF；(3)與細胞黏附分子如CD44作用；(4)降解抗血管因子如Decorin；(5)激活MMP-2并結合其抑制劑；(6)結合并裂解VEGFR1但不結合VEGFR2，從而促進VEGF/VEGFR2軸[10]。然而最后一種作用有爭議，少數學者認為裂解VEGFR1產生的片段可結合VEGF并抑制其誘導的內皮細胞有絲分裂而抑制CNV，MMP-14與VEGFR1結合對CNV的影響機制有待進一步研究[9,14]。

3.3TNF-α 生理情況下腫瘤壞死因子-α(TNF-α)在血漿中無法測出，當機體發生炎性反應或免疫應答時由炎性細胞分泌，其在CNV中的作用存在爭議,可能取決于濃度、時間及靶細胞類型等[30]。先前觀點認為TNF-α抑制CNV，有學者發現巨噬細胞表達的TNF-α是預防CNV所必需的,其可抵消血管內皮細胞TGF-β和VEGF的活性,且堿燒傷角膜TNF-α基因缺乏可加重眼部血管[31]。而近年研究表明TNF-α通過誘導巨噬細胞募集并產生VEGF等促進角膜移植后CNV形成，Cade等[32]進一步對比TNF-α抑制劑和IgG同型抗體處理的堿燒傷小鼠，發現TNF-α抑制劑組CNV形成減少，因此抑制TNF-α有助于減輕多種臨床背景CNV。

3.4血管生成素血管生成素(Ang)是受體酪氨酸激酶的配體，Tie是血管內皮細胞上的酪氨酸激酶受體，Ang/Tie通路對正常血管分化及人體新生血管形成起關鍵作用，Ang-1促進內皮增殖遷移并阻斷VEGF誘導的內皮通透性增加，激活Ang-1/Tie2通路可促進PI3K/Akt通路而促進CNV，而Ang-2通過促進血管退化參與血管重塑并拮抗Ang-1，阻斷Ang-2/Tie2通路可促進炎性CNV[33]。近年研究發現Ang可通過抑制角膜成纖維細胞的免疫應答來減少CNV，但Ang種類有待進一步確定[34]。

血管生成素樣蛋白(angiopoietin-like proteins,ANGPTLs)是與Ang高度同源的分泌性糖蛋白，參與調節人體脂質代謝、血管生成及炎性反應等，其中Angptl2通過促進巨噬細胞浸潤和IL-1β的過表達驅動CNV，而Angptl7通過刺激I型膠原蛋白合成來阻止血管發芽進入角膜而抑制CNV[35-36]。

4血管因子調控通路

核轉錄因子κB(NF-κB)、Wnt/β-catenin和Notch通路通過調節VEGF和MMP等血管因子介導CNV形成。

4.1NF-κB通路NF-κB是廣泛分布于人體細胞內的核轉錄因子，通過調節各種靶基因參與細胞增殖、凋亡、炎癥等過程，研究表明其作為VEGF/MAPK及PI3K/Akt途徑的下游,可上調VEGF和MMP而促進CNV，是CNV形成的關鍵轉錄因子途徑，Lennikov等發現使用IκB激酶2選擇性抑制NF-κB可致縫線大鼠CNV形成顯著減少[37]。近年研究發現NF-κB激活還導致其他促CNV靶基因如IL-8、趨化因子CXCL5、CCL2及HIF-1α等表達，而內源性配體SLURP1可阻斷NF-κB核易位以抑制其激活而抗血管生成[18,38]。此外，Tang等[39]發現四甲基吡嗪處理后的堿燒傷小鼠CXCR4、NFκB和核呼吸因子-1(NRF-1)表達下調，CNV生成減少，提出NF-κB促進CNV的新機制即刺激NRF-1/CXCR4通路。

4.2Wnt/β-catenin通路Wnt是一類富含半胱氨酸的分泌性糖脂蛋白，經典Wnt/β-catenin通路結合細胞表面受體和低密度脂蛋白受體相關蛋白5/6(LRP5/6)，激活并上調非磷酸化β-連環蛋白(β-catenin)，入核后促進下游血管因子靶基因表達，近年研究發現Wnt/β-catenin通路調節靶基因包括VEGF和TNF-α等，并可調節多種MMPs而影響CNV[23]。低密度脂蛋白受體相關蛋白6(LRP6)是Wnt通路的重要調控因子，Zhou等[40]連續7d每天3次局部施用絲氨酸蛋白酶抑制劑SERPINA3K后發現縫線大鼠CNV形成及角膜炎癥顯著受抑，進一步分析發現其主要是通過結合LRP6來阻斷Wnt/β-catenin通路而抑制CNV。

4.3Notch/Dll4通路Notch通路與細胞增殖、分化、凋亡等密切相關，Dll4是其唯一在血管內皮細胞表面表達的配體，大量研究證明Notch/Dll4通路在腫瘤新生血管形成中發揮重要作用，近年有學者提出Notch/Dll4通路可能影響CNV，但具體機制仍待確定。Xie等[24]表明VEGF可誘導Notch/Dll4通路，抑制后者會負反饋增加VEGF-A并促進bFGF誘導更多CNV。另有研究表明Notch通路可上調MMP-9和MMP-14并激活MMP-2以調節內皮細胞形態從而參與角膜細胞增殖和分化，還可調節MMP-14對血小板衍生因子的下調作用，推測Notch通路可能通過影響MMPs調節CNV[9-10]。

5非編碼RNA

近年CNV發病機制中非編碼RNA為VEGF外的一大研究熱點，其中MicroRNA(miRNA)及長鏈非編碼RNA(LncRNA)備受關注，為治療CNV提供新思路。

5.1miRNAs miRNAs是長約22個核苷酸的非編碼小RNA，可在后轉錄水平通過抑制配對mRNA的翻譯來調控基因表達而參與許多疾病的發生，研究發現miRNA通過多種機制參與CNV形成，據其對CNV的影響可分3類(表3)[19,41-44]。靶向作用于某些miRNA可有效緩解CNV，其中miR-132及miR-155促進HSK后CNV已在動物模型中得到證實。Mulik等[45]發現眼部感染HSV后miR-132上調10～20倍，sVEGFR-1阻斷VEGF-A可明顯降低HSV感染后miR-132的水平，體內沉默miR-132的HSV感染小鼠CNV和HSK病變減輕。Bhela等[37]發現HSV感染可提高巨噬細胞和CD4+T細胞中miR-155的水平，且沉默miR-155的HSK小鼠模型CNV形成受抑。

表3 CNV中miRNAs及調節機制

5.2LncRNA LncRNA是生物體內長度超過200個核苷酸的非編碼RNA，主要調節細胞周期和分化等病理生理過程，近年LncRNA對CNV的作用備受關注，不同LncRNA在CNV中的作用各異(表4)[20,46-48]。早前研究已確定H19在腫瘤血管生成中的重要作用，并且其可通過結合miR-199a和上調VEGFA來促進間充質干細胞的血管生成能力[24]。近年Sun等通過聚合酶鏈式反應(PCR)等發現LncRNA H19在縫合誘導的CNV和bFGF處理的臍靜脈內皮細胞中過表達，其可促進人臍靜脈內皮細胞的增殖、遷移和管腔形成，并且沉默或過表達H19可導致CNV中VEGF-A相應地減少或增加，表明H19與CNV中VEGF-A的表達呈正相關，提示H19可能通過作用于VEGF-A而促進CNV[24]。miR-29c已被證明可通過調節VEGF-A抑制腫瘤血液供應，該研究小組通過生物信息學分析發現H19可結合miR-29c，進一步PCR等實驗顯示人臍血靜脈內皮細胞中H19與miR-29c的表達呈負相關，miR-29c在縫合誘導的CNV和bFGF處理的臍靜脈內皮細胞中表達下調，且其與VEGF-A在bFGF處理的臍靜脈內皮細胞中表達呈負相關，因此H19可能通過抑制miR-29c來上調VEGF-A，從而促進CNV，LncRNA H19/miR-29c/VEGFA途徑的調控可能是CNV的潛在治療靶標。Bai等[47]通過酶聯免疫吸附測定(ELISA)等發現LncRNA NEAT1在堿燒傷大鼠CNV中表達上調，并通過RNA免疫沉淀及PCR等方法發現LncRNA NEAT1靶向miR-1246誘導NF-κB介導的炎癥因子的分泌從而促進CNV，為CNV的治療提供新見解。

表4 CNV中LncRNA及調節機制

5.3circRNA circRNA是近年發現的含閉合環狀結構的非編碼RNA，其可通過結合miRNAs來抑制后者結合mRNA。近年發現circRNA可能是CNV的治療新靶點,但相關研究仍匱乏，具有很大的研究潛力。既往研究表明抑制cZNF609可減少視網膜血管的丟失并抑制體內病理性血管生成，Wu等[19]通過PCR等發現角膜縫合大鼠術后角膜上皮cZNF609顯著穩定上調和miR-184顯著持續下調，而后以環狀RNA相互作用數據庫分析確定cZNF609可能作為miR-184的海綿而抑制后者的功能，進而通過RNA免疫沉淀分析確定miR-184特異性結合cZNF609-wt序列而非cZNF609-mut序列。該研究小組進一步通過蛋白質印跡分析等實驗顯示敲除miR-184后p-Akt、β-連環蛋白和VEGF表達增加，過表達miR-184可降低p-Akt、β-catenin和VEGF，并且上調cZNF609可逆轉縫合誘導的大鼠CNV模型中miR-184介導的抑制作用，從而證明cZNF609結合miR-184上調Akt/β-catenin/VEGF而促進CNV，干預此通路可作為病理性角膜新生血管治療的潛在策略。此外Zhou等[49]通過微陣列分析確定小鼠無血管角膜和血管化角膜中229個差異表達的circRNA，并推測cKifap3可能通過影響內皮血管生成而抑制CNV。

6細胞外基質蛋白

ECM在CNV發病機制中的研究相對較少，先前研究揭示ECM通過調節血管因子活性、被MMP降解并釋放可溶因子調節CNV[50]。近來研究發現ECM中蛋白通過多種機制影響CNV形成(表5)，可能成為治療的新靶點[12,50]。

表5 CNV中ECM蛋白及致病機制

7小結

隨著研究不斷發展，CNV相關發病機制已得到一定證明，但目前CNV的臨床治療包括抗VEGF藥物等療效仍不理想，進一步挖掘潛在發病機制具有重要意義。近年CNV發病過程中細胞及因子的相關研究取得一定進展，尤其非編碼RNA是近年研究熱點，為CNV的臨床治療及科學研究提供新的思路。由于不同疾病所致CNV的發病機制不完全相同，未來探索不同疾病所致CNV的主要致病機制是研究CNV發病機制的重要方向，有助于針對不同眼部損傷形成的CNV采取對應的靶向治療手段以提高治療效果。