CQ10-LPSp對紫花苜蓿幼苗內生細菌多樣性及其根瘤菌的影響

黃 榮， 姚 博， 王曉芬， 德吉卓瑪， 吳菁菁， 張振粉

(甘肅農業大學草業學院， 草業生態系統教育部重點實驗室， 中-美草地畜牧業可持續發展研究中心， 甘肅 蘭州 730070)

植物內生細菌是指在其生活史的一定階段或全部階段生活于健康植物的各種組織和器官的細菌[1]，它可以通過維管束系統進入種子，也可以通過禾谷類花粉通道、成熟種子的種臍、種皮的裂縫開口、種皮背部索狀細胞和種脊進入種子，成為種子內生細菌，即植物種帶細菌[2-3]。換言之，種帶細菌是下一代新植株內生細菌的重要來源。其中植物根系作為植物獲取養分、水分和礦質營養物質的重要器官，定殖著大量的細菌，是植物分解轉化污染物和抵御病原菌入侵的重要場所，為宿主提供了豐富的生態位，所以植物根系內生細菌是植物內生細菌的重要來源。植物根系內生細菌在植物體內與宿主協同進化發揮各種生物學作用，如促進宿主植物生長[4-5]、防控植物病蟲害[6-8]和提高植物抗逆性[9]等。目前關于植物根系內生細菌的研究多集中在其次級代謝產物的生物功能測定及農業、生物防治和醫藥領域等方面的應用[10]。

一般來說，植物內生細菌中絕大部分屬于革蘭氏陰性細菌(Gram negative bacteria，G-)[11-13]。脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)作為革蘭氏陰性細菌細胞外膜的主要成分和次生代謝產物之一，覆蓋40%左右的細菌細胞表面，對植物、動物和多種真核生物體有極強的免疫刺激的作用[14]，可以引起植物葉綠體損傷和活性氧(Reactive oxygen species，ROS)迸發等反應[15]，在植物生長發育調控過程中起到重要作用。其次，脂多糖也是一種重要的微生物相關分子模式(Microbe-associated molecular patterns，MAMP)，植物可以通過模式識別受體(Pattern recognition receptor，PRR)感知MAMP并激發的免疫反應，被稱為模式觸發的免疫(Pattern-triggered immunity，PTI)反應[16]。冷靜[17]報道成團泛菌脂多糖(Pantoeaagglomeranslipopolysaccharide，LPSp)是一種低毒性、安全性良好和純度活性高的免疫增強劑，在調控植物周圍環境微生物種類和組合中起著重要作用[18]。本實驗室前期研究表明，0.267 0 EU·mL-1成團泛菌脂多糖會促進紫花苜蓿的生長和結瘤[19]。其中根瘤菌(Rhizobium)作為紫花苜蓿共生固氮體系中一種典型的革蘭氏陰性細菌[20]，其共生體系中的細菌脂多糖是如何影響寄主紫花苜蓿根系中的根瘤菌等內生細菌的機理仍未明確，需開展相關研究。為此，本試驗以‘巨能551’紫花苜蓿品種為試驗材料，探究不同濃度成團泛菌CQ10脂多糖(PantoeaagglomeransCQ10 Lipopolysaccharide，CQ10-LPSp)對紫花苜蓿幼苗內生細菌多樣性及其根瘤菌的影響，其結果可為挖掘和開發促進根瘤菌生長的外源添加脂多糖制劑提供理論和實踐依據。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株：紫花苜蓿種帶成團泛菌(Pantoeaagglomerans)CQ10菌株由甘肅農業大學草業學院牧草病理實驗室提供。

供試品種：紫花苜蓿‘巨能551’(Medicagosativa‘Juneng 551’)種子由甘肅農業大學牧草種質資源實驗室提供。

1.2 供試培養基

營養瓊脂/液體培養基(Nutrient agar，NA/NB)，配方參考《植病研究方法(第三版)》[21]。

酵母甘露醇瓊脂/液體培養基(Yeast mannitol agar，YMA/YMB)，配方參考劉盧生等人的[22]的方法。

1.3 紫花苜蓿種帶細菌的分離

采用常規稀釋法分離培養。稱取‘巨能551’紫花苜蓿種子0.25 g，先用質量濃度75%的酒精浸泡2 min，后轉入3%的NaClO浸泡5 min，無菌水沖洗3～4次，轉至盛有10 mL無菌水的研缽研磨。靜置10 min后，將原液依次稀釋為10-4～10-1的梯度稀釋液。每個梯度稀釋液分別吸取200 μL上清液均勻涂布到NA和YMA培養基上，以無菌水涂布的NA和YMA培養基為空白對照，n=3。涂板后轉置28℃恒溫箱中培養3 d，通過形態觀察挑選單菌落進行分離純化，記錄菌落數及菌落的形態特征。菌株純培養保存于—80℃冰箱中。

1.4 細菌的16S rDNA鑒定

細菌DNA提取使用天根生化科技(北京)有限公司TIANamp Bacteria DNA Kit細菌基因組DNA提取試劑盒(離心柱型,目錄號DP302)，具體方法參見試劑盒說明書。

細菌基因的擴增，參照夏秀東的方法[23]，將擴增產物送到武漢金開瑞生物工程有限公司進行檢測。

1.5 構建根瘤菌的系統發育樹

將測序后的根瘤菌DNA序列提交到NCBI-Blast進行在線比對，后選用同源性最高的菌株的序列作為參比對象，運用MEGA6.0軟件Neighbor-Joining法構建系統樹，確立根瘤菌的系統發育地位。

1.6 CQ10-LPSp對紫花苜蓿生長的影響

1.6.1CQ10-LPSp的提取 CQ10菌株復蘇后在NA培養基上培養48 h并提取其脂多糖備用，提取方法參照文獻[19]。

1.6.2CQ10-LPSp的濃度設置 試驗設置6個濃度，即0，0.133 5，0.200 3，0.267 0，0.333 8，0.400 5 EU·mL-1。濃度按照CQ10-LPSp的活性[19]進行配制。

1.6.3接種試驗 向生長瓶中加入200 mL蒸餾水和不同濃度(0，0.133 5，0.200 3，0.267 0，0.333 8，0.400 5 EU·mL-1)的CQ10-LPSp，高溫高壓(121℃，0.11 Mpa)滅菌21 min后待用。后挑選籽粒飽滿、無病蟲害的內含根瘤菌紫花苜蓿品種的干凈種子600粒。將種子等距置于上述滅好菌的發芽瓶的發芽床上，每瓶25粒，每個處理4個重復。接入種子后將發芽瓶放置于溫度23℃、濕度45%、光照(18 Klx)18 h、黑暗6 h的生長室進行培養，期間需觀察無菌水組和處理組種子的結瘤狀況，于第21 d取樣分離研磨紫花苜蓿根系內生根瘤菌。

1.7 CQ10-LPSp對紫花苜蓿根系內生根瘤菌數量的影響

以100 mLYMA固體培養基為基礎培養基，分別添加不同濃度的脂多糖(0.133 5，0.200 3，0.267 0，0.333 8，0.400 5 EU·mL-1)CQ10-LPSp，并以空白的YMA固體培養基為對照。培養基分裝后121℃高溫滅菌后倒平板待用。后挑取根瘤菌單菌落接種到培養基上，每個處理4個重復，27℃恒溫培養箱培養3 d，觀察根瘤菌的生長形態。

1.8 CQ10-LPSp對紫花苜蓿根系幼苗內生細菌多樣性的影響

超凈工作臺中分離6個不同濃度下紫花苜蓿根系的內生細菌。分別稱取不同濃度下的幼苗根系0.1 g，消毒研磨稀釋涂板，方法與1.3相同。比較純化后的細菌分離物和‘巨能551’紫花苜蓿種帶細菌分離物的種類和數量。

1.9 數據分析

試驗數據用SPSS 23.0軟件進行統計分析，采用單因素方差分析檢驗不同CQ10濃度對紫花苜蓿幼苗根系根瘤菌數量的影響，用Duncan法進行多重比較，顯著性水平a為0.05；采用Microsoft Excel 2010進行數據整理和繪圖。

2 結果與分析

2.1 紫花苜蓿種帶細菌多樣性

根據顏色、大小和形態等菌落形態特征的不同分類可知，從‘巨能551’紫花苜蓿品種中共得到17株細菌分離物，分別為NA培養基上9株，細菌的總數量約為1.38×108cfu·g-1；YMA培養基上8株，細菌的總數量約為1.07×107cfu·g-1，表明‘巨能551’種帶內生細菌豐富多樣。根據其形態特征的差異，提取其DNA、擴增16S rDNA序列，與NCBI的BLAST比對，鑒定結果如表1所示，代表菌屬在培養基上的形態見圖1。17株細菌分離物分別隸屬于歐文氏菌屬(Erwiniasp.)、腸桿菌屬(Enterobactersp.)、芽孢桿菌屬(Bacillussp.)、假單胞菌屬(Pseudomonassp.)、埃希氏菌屬(Escherichiasp.)、亞特蘭大桿菌屬(Atlantibactersp.)和中華根瘤菌屬(Sinorhizobiumsp.)。其中革蘭氏陽性細菌(Gram-positive bacteria，G+)有79株，革蘭氏陰性細菌179株，革蘭氏陰性細菌多于陽性細菌，表明種子內部分布著大量的脂多糖。

表1 ‘巨能551’紫花苜蓿種帶細菌的種群、數量、菌落特征及屬名Table1 Population,quantity,colony characteristics and generic name of bacteria in ‘Ju neng 551’ alfalfa

圖1 代表菌屬在培養基上的形態Fig.1 The morphology of representative bacteria on the culture medium注：Dfz15(歐文氏菌屬)；Dfz8(芽孢桿菌屬)；Dfz6(埃希氏菌屬)；Dfz3(腸桿菌屬)；Dfz9(假單胞菌屬)；Dfz16(亞特蘭大桿菌屬)Note:Dfz15(Erwinia sp.)；Dfz8(Bacillus sp)；Dfz6(Escherichia sp.)；Dfz3(Enterobacter sp.)；Dfz9(Pseudomonas sp.)；Dfz16(Atlantibacter sp.)

其中編號為Dfz17菌株的16S rDNA序列，通過MEGA6.0構建菌株的系統發育樹見圖2。系統發育樹結果表明，菌株Dfz17與Sinorhizobiummeliloti(FM178842.1)、Sinorhizobiummeliloti(FM178844.1)在系統發育樹上聚在一起，且相似度為100%，初步將其鑒定為中華根瘤菌屬(Sinorhizobiumsp.)。

圖2 Dfz17的系統發育樹Fig.2 Phylogenetic tree of Dfz17 bacteria

2.2 CQ10-LPSp對‘巨能551’根系內生根瘤菌的數量影響

不同CQ10-LPSp濃度下，‘巨能551’紫花苜蓿生長和結瘤現象不同，其中僅0.267 0 EU·mL-1CQ10-LPSp下紫花苜蓿根有結瘤。研磨幼苗根系內生細菌，結果表明隨著CQ10-LPSp濃度的增大，紫花苜蓿根系內生根瘤菌的數量呈先上升后下降的趨勢，且在0.267 0 EU·mL-1CQ10-LPSp下達到最大；而在0.333 8 EU·mL-1CQ10-LPSp和0.400 5 EU·mL-1CQ10-LPSp下，未分離到根瘤菌(表2)。

表2 6個不同CQ10-LPSp濃度下‘巨能551’根系內生根瘤菌的數量Table 2 The number distribution of Sinorhizobium in the root system of ‘Juneng 551’ at 6 different CQ10-LPSp concentrations

通過觀察添加不同濃度的CQ10-LPSp培養基上根瘤菌的生長形態，發現添加不同濃度CQ10-LPSp對根瘤菌的生長影響不同。僅添加0.267 0 EU·mL-1CQ10-LPSp的培養基上根瘤菌的單菌落較對照分布較多，其余濃度下均未觀察到根瘤菌的生長。該結果表明0.267 0 EU·mL-1CQ10-LPSp可以促進根瘤菌的生長，且其可以提高幼苗內生根瘤菌的數量與植物內生細菌多樣性有關。

2.3 CQ10-LPSp對紫花苜蓿根系幼苗內生細菌多樣性的影響

另外，分離0.267 0 EU·mL-1CQ10-LPSp處理下紫花苜蓿的根系內生細菌，還得到了其他8株菌株，種群、數量及菌落征(表3)和菌落形態(圖3)。根系內生細菌種類比種帶細菌少。其中，編號Rn1和Dfz13，Rn3和Dfz17，Rn4和Dfz4，Rn2和Dfz10，Rn6和Dfz5細菌種類是一樣的，且Rn1，Rn3和Rn4數量大于Dfz13，Dfz17和Dfz4，Rn2數量小于Dfz10，Rn6數量等于Dfz6；而Rn5，Rn7和Rn8菌株未在種帶細菌中發現，經16S rDNA鑒定和NCBI比對，鑒定Rn5為副球菌屬(Paracoccussp.)，Rn7和Rn9為芽孢桿菌屬(Bacillussp.)，Rn6為志賀氏菌屬(Shigellasp.)。

圖3 9株細菌分離物在YMA和NA培養上的生長形態Fig.3 Growth morphology of 9 strains of bacteria isolate on YMA and NA culture

表3 0.267 0 EU·mL-1 CQ10-LPSp下紫花苜蓿根系內含細菌的種群、數量及菌落征Table 3 Population,quantity and colony characteristics of bacteria in the roots of 0.267 0 EU·mL-1 CQ10-LPSp alfalfa

3 討論

3.1 CQ10-LPSp對紫花苜蓿內生細菌多樣性的影響

經過長時間的協同進化，內生細菌與宿主植物之間形成了穩定的共生體。一方面，內生細菌能夠為植物提供生物活性代謝物(如營養物質、礦物質、酶和植物激素等)，并促進這些資源的再分配，從而有助于宿主植物抵抗外界的逆境脅迫[24-25]；另一方面，宿主植物在自身生長繁殖正常的情況下為內生細菌提供了一個穩定的生長和繁殖場所，從而與其形成共生互利的生命體[26]。本研究采用NA和YMA培養基，對‘巨能551’紫花苜蓿品種內生細菌進行多樣性分析，得到17株內生細菌，分別隸屬于歐文氏菌屬、芽孢菌屬、腸桿菌屬、假單胞菌屬、埃希氏菌屬、亞特蘭大腸桿菌屬和中華根瘤菌屬。在全程無菌條件下再用0.267 0 EU·mL-1CQ10-LPSp處理紫花苜蓿的根系，分離得到了新的兩屬細菌(副球菌屬和志賀菌屬)，但未能重復分離得到紫花苜蓿種帶的歐文氏菌屬、亞特蘭大腸桿菌屬和埃希氏菌屬，而芽孢桿菌屬等其余細菌仍然存在于在脂多糖處理后的紫花苜蓿根系中。王志偉等[1]報道種子內微生物群不僅是種子中群落組裝的終點，也是新幼苗中群落組裝的起點。植物種子隨著儲藏年限的延長，細菌的種群數量會相應縮減[27]，這就說明在存儲中植物種帶細菌會死亡，而革蘭氏陰性細菌死亡后將裂解出脂多糖，本試驗證明脂多糖處理紫花苜蓿后，紫花苜蓿根系的細菌種群和種子的細菌種群表現出多樣性差異。這可能是脂多糖處理紫花苜蓿后根瘤菌種群數量由種帶細菌中的1.05×106cfu·g-1增加至根系中的6.98×107cfu·g-1，相應占據了紫花苜蓿根系中更多的生態位，從而影響了部分其它細菌在紫花苜蓿根部的生長。植物種子和根系中的細菌多樣性差異也可能是由于傳統培養方法存在局限性，不能充分展示紫花苜蓿內生細菌的多樣性[28]，應進一步利用微生物組學方法進行研究。但至于脂多糖是如何調控植物種子中細菌菌群的多樣性進而影響儲藏年限和萌發，均需進一步的試驗探究。

3.2 CQ10-LPSp對紫花苜蓿根系內生根瘤菌數量的影響

大多數植物都有高功效的PAMP感知系統，能迅速啟動PTI信號傳導，誘發免疫反應。細菌PAMP主要有鞭毛蛋白、熱不穩定延伸因子、脂多糖、冷激蛋白和harpin蛋白。PAMP激活的免疫反應包括早期氫離子、鈣離子內流和鉀離子外流，迅速激活下游的MAPK信號級聯反應，誘導ROS爆發、被侵染部位細胞壁上的胼胝體的沉積，以及免疫反應基因表達等一系列防衛反應[15]。這一系列免疫反應在調控植物周圍環境的微生物種類和組合中起著重要作用[18]，且細菌的PAMP和植物PRR的多樣化組合也是調控與不同細菌互作的一個關鍵因素[29]。本試驗結果顯示，不同濃度CQ10-LPSp處理‘巨能551’后紫花苜蓿的結瘤現象不同，對其根系內生根瘤菌數量影響也不同。隨著CQ10-LPSp濃度的增大，內生根瘤菌的數量先上升后下降，且在0.267 0 EU·mL-1CQ10-LPSp下達到最大，且紫花苜蓿根有結瘤。以往研究表明，革蘭氏陽性和陰性細菌的細胞壁的成分肽聚糖能夠特異性識別含有Lysin基因序列的細胞表面受體(受體樣激酶LYKs和受體蛋白LYPs)，從而觸發宿主的先天免疫反應[30]。脂多糖具有和肽聚糖在植物免疫調節上類似的功能[14]，是與植物受體識別后而激發的結瘤等免疫響應有關。然而，截至目前除了擬南芥外的其它植物識別細菌脂多糖的受體尚未被鑒定[31]。一方面，紫花苜蓿根系中的根瘤菌種群數量增加是保證根系結瘤的物質基礎；另一方面，根瘤菌種群數量的提升也相應影響了植物根系周圍環境的細菌種類及數量；兩者相互制約且相互調控。CQ10-LPSp對中華根瘤菌屬在紫花苜蓿結瘤過程中的作用及其機理需要進行進一步的研究。

4 結論

本試驗研究了CQ10-LPSp對紫花苜蓿細菌多樣性及其根瘤菌的影響，結果表明隨著CQ10-LPSp濃度的增大，紫花苜蓿內生根瘤菌的數量呈先升高后降低的變化趨勢，在0.267 0 EU·mL-1CQ10-LPSp下根瘤菌數量最高，為6.98×107cfu·g-1，該濃度下內生腸桿菌屬的細菌株數增多，假單胞菌屬株數減少，整體根系內生細菌種類較種帶可培養細菌多樣性減少。綜上所述，CQ10-LPSp會影響幼苗內生細菌的多樣性及數量，且能增加內生根瘤菌的數量。