西藏野生垂穗披堿草EnPLA1基因克隆與表達分析

姜惠娜， 敬 松， 李晗玉， 佘木子， 張新飛, 呼天明， 付娟娟*， 苗彥軍

(1. 西北農林科技大學草業與草原學院， 陜西 楊凌 712100； 2. 西藏農牧學院動物科學學院， 西藏 林芝 860000)

溫度是影響植物生長發育和產量形成的重要環境因子[1]。在全球氣候變暖的大趨勢下，氣溫變化異常，極端天氣頻繁出現，植物的寒凍災害也日趨嚴重。細胞膜是植物感受外部環境刺激并作出反應的部位，同時也參與細胞感受外界環境刺激和信號傳遞[2]。低溫脅迫導致細胞膜透性增大，膜脂過氧化作用加劇，細胞內活性氧積累，細胞代謝紊亂，嚴重時會造成植物的死亡[3-4]。

垂穗披堿草(ElymusnutansGriseb.)是寒冷地區草牧業發展的重要草種，廣泛分布于青藏高原的野生居群,是研究抗逆機理的理想材料[5-6]。α-亞麻酸是ω-3系統的不飽和脂肪酸，在響應植物生長發育和生物與非生物脅迫應答方面具有重要的作用[7-8]。許多研究表明α-亞麻酸是茉莉酸合成的前體物質，茉莉酸能夠通過核心轉錄因子(C-repeat binding factors，CBFs)依賴的信號途徑誘導細胞內保護性物質如多胺、谷胱甘肽、花青素等積累，從而積極地調控植物的低溫應答[9-10]；而且茉莉酸也可能與乙烯、脫落酸、赤霉素等其他植物激素相互作用調控植物的非生物脅迫響應[11-12]。前期研究發現，α-亞麻酸(18∶3)代謝通路和茉莉酸信號在西藏當雄野生垂穗披堿草低溫應答中發揮重要作用，其中磷脂酶A1(Phospholipase A1，PLA1)是該信號通路中的重要酶，可水解磷脂的sn1位置生成不飽和脂肪酸α-亞麻酸(18∶3)[13]，該不飽和脂肪酸積極地調控植物的低溫和干旱等非生物脅迫應答[7,14]。然而關于高寒植物西藏野生垂穗披堿草中EnPLA1基因調控的α-亞麻酸(18∶3)在植物非生物脅迫應答中的機理尚不明晰。

本研究從當雄野生垂穗披堿草中克隆了EnPLA1基因的編碼序列(Coding sequence,CDS)全長序列，對其進行生物信息學、基因表達模式和亞細胞定位分析，并采用外源添加的方法分析α-亞麻酸在西藏野生垂穗披堿草低溫適應中的作用，為后續研究EnPLA1調控植物α-亞麻酸(18∶3)通路在植物非生物脅迫應答中的機理奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及處理

本研究供試野生垂穗披堿草種子于2016年10月采自西藏當雄縣(30°28.535′ N，91°06.246′ E，海拔4 618 m)。垂穗披堿草種子用2.5% NaClO消毒5 min后，蒸餾水清洗4～5次，播種到育苗盤上，待幼苗長至3 cm左右時，轉移到培養缽中，每缽5株，于人工氣候箱內培養(光強12 000 lx，光周期16 h/8 h，晝/夜溫度23℃/20℃，相對濕度60%)，期間每2 d更換一次Hoagland營養液。將培養28 d的幼苗于低溫培養箱進行低溫(4℃)處理，取樣時間點為低溫脅迫0 h，12 h，24 h，48 h，72 h和1周，設置3次重復。

1.2 基因克隆與亞細胞定位載體構建

亞細胞定位載體pCAMBIA1302由本實驗室保存，采用EcoRI單酶切線性化載體。根據普洛麥格Eastep?Super總RNA提取試劑盒(NO. LS1040)的方法提取垂穗披堿草葉片中RNA，采用酶標儀測定OD260/280，檢測RNA提取效果。采用TAKARA反轉試劑盒(NO. 6210A)將RNA反轉成cDNA模板。根據RNA-Seq獲得的序列，利用NCBI官網上的BLAST進行同源比對；采用primer 5軟件設計引物(EcoR1-EnPLA1-F:5′-tcgagctcaagcttcgaattcATGTCGTTCCTC-CCGATCCC-3′；EcoR1-EnPLA1-R:5′-gtaccgtcgactgcagaattcGATGTGCTTGAAGTCTTGGAGCG-3′)；以上述cDNA為模板，采用諾唯贊phanta高保真酶(No. P511-01)進行片段擴增。反應液包括2 μL上游引物(10 μM)，2 μL下游引物(10 μM)，2 μL模板cDNA，25 μL 2×Phanta Master Mix和19 μL ddH2O。PCR程序為預變性95℃ 3 min，然后30個循環的變性95℃ 10 s、退火60℃ 30 s、延伸72℃ 90 s，最后徹底延伸72℃ 5 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，回收目的條帶，重組到pCAMBIA1302 載體上，轉化大腸桿菌DH5α感受態，挑單克隆，采用1300GFP-F:5′-CGCACAATCCCACTATCC-3′和1300GFP-SEQ-R:5′-CGCCCTTGCTCACCAT-3′引物進行菌檢PCR，菌檢正確后，送菌液測序，測序和引物合成由擎科生物技術有限公司完成。

1.3 生物信息學分析

利用ORF Finder(http://www.bioinformatics.org/sms2/orf_find.html)查找目的基因的開放閱讀框，應用TMpred (https://embnet.vital-it.ch/software/TMPRED_form.html)預測EnPLA1蛋白質可能存在的跨膜區，利用Protparam (https://web.expasy.org/protparam/)來分析其理化性質，根據NCBI中的Conserved Domains (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/docs/cdd_search.html)分析其功能結構域。將EnPLA1基因的cDNA序列在NCBI數據庫中的BLASTx進行同源性比對，利用DNAMAN和MEGA6軟件分析EnPLA1蛋白與其他植物的PLA1蛋白的進化關系，構建分子進化樹。

1.4 EnPLA1在低溫脅迫下的表達模式分析

生長至28 d的幼苗分別進行低溫(4℃)處理0 h，12 h，24 h，48 h，72 h和1周，以不進行脅迫處理為對照，每個處理設置3個重復。采用Light Cycler 480實時熒光定量PCR儀進行實時定量PCR擴增。采用primer 5軟件設計F和R引物(F:5′-CACAATCTCGAGTGCTACCTAC-3′；R:5′-GCTATGTCACGGTCTACCTCTA-3′)，以根、根莖、葉片的cDNA為模板，采用諾唯贊定量酶(No. Q311-02)進行片段擴增，以Tublin作為內參基因。采用2-ΔΔCt方法計算EnPLA1基因的相對表達量。

1.5 EnPLA1亞細胞定位分析

利用ClonExpress? MultiS試劑盒(諾唯贊)將EnPLA1基因連接到經酶切線性化的GFP雙元表達載體(pCAMBIA1302)上，將構建好35S:EnPLA1-GFP融合基因的重組載體轉化農桿菌GV3101感受態細胞。通過注射法將農桿菌侵染4周齡的本氏煙草葉片上，暗培養24～48 h。在激光共聚焦顯微鏡下觀察亞細胞定位。初步確定亞細胞定位后，提取煙草葉片的原生質體，進一步確定EnPLA1的亞細胞定位。

1.6 α-亞麻酸處理及指標測定

將培養14 d的幼苗，進行根部注射不同濃度α-亞麻酸處理，早晚各注射一次，每盆幼苗共注射4 mL，對照注射蒸餾水，5 d后進行低溫(4℃)處理。每個處理設置3次重復，脅迫5 d后取樣分析各項指標。沿植株根莖部位將地上部剪下來，分別測定株高和根長，用分析天平稱其鮮干重；根據李合生[15]方法，采用電導率儀測定葉片相對電導率；氧自由基產生速率采用分光度法，測定OD530下的吸光度[16]。

1.7 數據分析

所有數據均用Microsoft Excel 2003 錄入并作圖，采用SPSS 22.0 軟件對數據進行單因素方差分析，采用Duncan’s法對平均值進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 EnPLA1基因的克隆

通過同源克隆我們獲得大約1 300 bp左右的目的片段(圖1)。將目的片段回收，連接pCAMBIA1302載體，挑選陽性克隆測序，結果表明EnPLA1的CDS序列為1 305 bp，與轉錄組測序結果一致。

圖1 垂穗披堿草EnPLA1基因的克隆Fig.1 Cloning of EnPLA1 gene in E.nutans

2.2 EnPLA1編碼的氨基酸序列比對及理化性質分析

利用ExPASyProt軟件分析發現EnPLA1編碼434個氨基酸(圖2A)。通過Protparam分析其理化性質，推測EnPLA1蛋白的分子式為C2128H3286N582O621S15，其相對分子量為47 439.93，等電點(Isoelectric point，pI)為6.05,不穩定系數為47.59，屬于不穩定蛋白。EnPLA1蛋白中相對含量較多的氨基酸是纈氨酸Val(10.4%，45個)，異亮氨酸Leu(9.0%，39個)和丙氨酸Ala(8.8%，38個)，親水性平均數(Grand average of hydropathicity，GRAVY)為—0.082，屬于親水性蛋白，其脂肪系數為86.45(圖2B)。應用TMpred對EnPLA1蛋白質跨膜區進行預測分析顯示其存在4個跨膜結構域(圖2C)，分別位于第120～146，252～278位氨基酸之間[方向為膜內側到膜外側(i→o)]和第117～146，253～279位氨基酸之間[方向為膜外側到膜內側(o→i)]，其中只有o→i的第117～146位氨基酸分數為694(分數>500為顯著跨膜結構)，為顯著跨膜結構。二級結構分析表明，EnPLA1中主要包括α-螺旋(Alpha helix，36.41%)、無規則卷曲(Random coil，43.32%)、延伸鏈(Extended strand,16.59%)和β-轉角(Beta turn，3.69%)(圖2E)。根據EnPLA1編碼氨基酸序列在NCBI中BLAST同源檢索與比對，獲得相似度較高的不同植物的氨基酸序列。利用DNAMAN6.0軟件將野生垂穗披堿草中的EnPLA1編碼氨基酸序列與與粗山羊草(Aegilopstauschiisubsp. Tauschii)，單倍體小麥(Triticumturgidumsubsp. Durum)，大麥(Hordeumvulgaresubsp.Vulgare)，二穗短柄草(Brachypodiumdistachyon)、南荻(Miscanthuslutarioriparius)，高粱(Sorghumbicolor)，柳枝稷(Panicumhallii)，谷子(Setariaitalica)，洋地黃(Digitariaexilis)，黍(Panicummiliaceum) 等多個物種的PLA1的氨基酸序列進行多重比對(圖3A)，結果顯示上述氨基酸序列的相似性高達80.76%，都含有1個高度保守的Lipase (class 3)功能結構域(圖2D，圖3A)。

圖2 垂穗披堿草EnPLA1的氨基酸序列(A)，親/疏水性(B)，跨膜結構域(C)，保守結構域(D)和二級結構(E)分析Fig.2 Analyses of amino acid sequence (A),hydrophilicity/ hydrophobicity (B)，transmembrane domain (C)，conserved domain (D) and secondary structure (E) of EnPLA1 in E.nutans

2.3 EnPLA1的系統進化樹構建

利用MEGA7.0構建系統進化樹，結果顯示，西藏野生垂穗披堿草(E.nutans)PLA1基因編碼的氨基酸序列與單倍體小麥、粗山羊草和大麥親緣關系較近，高達80.76%，其次是二穗短柄草(圖3B)。

圖3 垂穗披堿草EnPLA1編碼的氨基酸與其他物種氨基酸序列的多重比對(A)和系統進化樹(B)Fig.3 Multiple alignments of amino acid sequences (A) and phylogenetic tree (B) between the amino acids encoded by EnPLA1 gene in E.nutans and other species

2.4 EnPLA1的亞細胞定位分析

在煙草中瞬時表達EnPLA1，激光共聚焦顯微鏡下觀察，發現EnPLA1-GFP融合蛋白的熒光信號主要定位在在細胞質(圖4A，B)，與通過WoLF PSORT(https://wolfpsort.hgc.jp/)進行亞細胞定位預測的結果基本一致。

圖4 EnPLA1蛋白在煙草葉片表皮細胞(A)和原生質體(B)中亞細胞定位分析Fig.4 Subcelllular localization analysis of EnPLA1 in epidermal cells (A) and a mesophyll protoplast (B) isolated from Nicotiana benthamiana leaves注：標尺為10 μmNote:Scale bar,10 μm

2.5 EnPLA1基因的表達分析

在不同組織中的實時定量表達分析結果顯示，EnPLA1在根、莖、葉中均有表達，其中在葉中表達高于莖和根中(P<0.05)；低溫脅迫誘導葉和莖中EnPLA1基因顯著上調表達，在低溫處理72 h時EnPLA1的表達量最高，與對照相比分別增加6 513.05%和7 681.33%(P<0.05)；而低溫對根系中該基因的表達影響較小，僅在低溫脅迫12 h時上調表達(圖5A,B)。

圖5 不同組織中EnPLA1相對表達量(A)及低溫脅迫下不同時長不同組織中EnPLA1相對表達量(B)Fig.5 Relative expression levels of EnPLA1 in different tissues (A) and in different duration under low temperature stress (B)注:不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)，下同Note:Different lowercase letters indicate significantly differences at the 0.05 level,the same as follow

2.6 α-亞麻酸對低溫脅迫下垂穗披堿草幼苗生長和細胞膜穩定性的影響

25～500 μM的α-亞麻酸處理能夠不同程度地改變低溫脅迫下垂穗披堿草幼苗的生長，其中株高、根長和鮮干重在濃度為25 μM時最大，與對照相比，分別增加11.91%，21.05%，54.55%和29.09%(圖6A-D)。

圖6 α-亞麻酸對低溫脅迫下垂穗披堿草幼苗株高(A)、根長(B)、鮮重(C)、干重(D)Fig.6 Effects of α-linolenic acid on plant height (A)，root length (B)，fresh and dry weight (C,D) of E.nutans seedlings under cold stress

低溫脅迫下不同濃度α-亞麻酸處理導致葉片相對電導率及自由基含量的影響也呈動態變化，25 μM的α-亞麻酸處理下葉片相對電導率和氧自由基含量與對照相比分別降低了18.71%和93.70% (圖7)。綜上表明，濃度為25 μM的α-亞麻酸能夠緩解低溫對垂穗披堿草幼苗的造成的氧化損傷。

圖7 α-亞麻酸對低溫脅迫下垂穗披堿草幼苗相對電導率(A)和氧自由基含量(B)的影響Fig.7 Effects of α-linolenic acid on the relative electrical conductivity (A) and oxygen free radical content (B) of E.nutans seedlings under cold stress

3 討論

細胞膜是植物感受外部環境刺激的首要部位，同時也參與細胞感受外界環境刺激和信號傳遞[2]。α-亞麻酸是細胞膜的重要組成物質，當植物遭遇生物與非生物脅迫時其水平增加，從而調節細胞膜的流動性[7-8]。本課題組前期的轉錄學研究發現α-亞麻酸在西藏野生垂穗披堿草低溫脅迫適應中具有積極的調控作用[17]，而且通過外源添加試驗表明25 μM的α-亞麻酸處理能夠顯著地提高垂穗披堿草的抗寒性。與之相似，Li等[7]和李東等[14]在山茶(Camelliajaponica)和水稻(Oryzasativa)上的研究也表明α-亞麻酸(18∶3)能積極地調控植物的低溫和干旱等非生物脅迫應答。為了進一步闡明高寒植物西藏野生垂穗披堿草中EnPLA1基因調控的α-亞麻酸(18∶3)通路在植物非生物脅迫應答中的機理，本試驗首次從西藏野生垂穗披堿草克隆了α-亞麻酸合成酶基因EnPLA1的全長CDS序列，生物信息學分析發現EnPLA1蛋白與粗山羊草、單倍體小麥、大麥、二穗短柄草、高粱、柳枝稷、谷子等禾本科植物的蛋白相似度高達80%以上，表明PLA1蛋白在禾本科植物進化上存在高度的保守性。

磷脂酶在植物中普遍存在，在植物生長、發育和脅迫應答等過程中都扮演著重要的角色[18]。其中，磷脂酶A1(PLA1)為α-亞麻酸(18∶3)合成途徑的關鍵酶[19]。Seo等[20]發現辣椒(CapsicumannuumL.)中CaPLA1蛋白在sn-1位點催化磷脂水解產生α-亞麻酸(18∶3)。本研究為進一步探究EnPLA1依賴的α-亞麻酸途徑調控西藏野生垂穗披堿草低溫適應的機制，分析了EnPLA1蛋白的亞細胞定位情況。研究結果表明EnPLA1蛋白定位在細胞質中，這與Singh等[21]研究結果一致，該研究指出PLA1分為I，II和III各亞型，其中PLA1-II亞型定位在細胞質。表達模式分析表明，EnPLA1基因主要在葉中表達，這與Park等[22]研究結果一致。隨著低溫時間的延長，低溫脅迫誘導葉和莖中EnPLA1基因顯著上調表達，而根中該基因表達受低溫影響較小，說明EnPLA1基因可能參與調控植物的低溫脅迫應答。本研究結果為深入闡明EnPLA1基因調控的植物非生物脅迫應答的機制提供理論支撐。

4 結論

綜上所述，本研究成功克隆了EnPLA1基因的CDS序列，發現其ORF為1 305 bp，編碼434個氨基酸，分子量為47.44 KD，等電點為6.05，該蛋白為親水性蛋白且偏酸性。EnPLA1編碼的蛋白與粗山羊草，大麥等具有較高的相似性，含有1個高度保守的Lipase (class 3)功能結構域，存在4個跨膜結構域，EnPLA1蛋白主要定位細胞質。EnPLA1基因在垂穗披堿草的根莖葉中均有表達，且葉莖中該基因能夠積極地響應低溫脅迫，表明PLA1可能參與調控植物的低溫脅迫應答。外源α-亞麻酸能夠顯著地提高垂穗披堿草的抗寒性，然而關于EnPLA1基因調控的α-亞麻酸通路在植物非生物脅迫應答中的機理需要進一步挖掘。