不同濃度Fe2+與Zn2+對羊草幼苗生長和生理特性的影響

孟令博，趙 曼，亢 燕，祁 智

(內蒙古大學 生命科學學院/牧草與特色作物生物學教育部重點實驗室，呼和浩特 010031)

鐵(Fe)和鋅(Zn)是植物生長和發育需求量最大的兩種微量元素，常常是限制農作物產量，影響植物營養價值的主要因素。Fe主要參與植物體內葉綠素的合成、呼吸作用以及光合作用中電子傳遞的過程[1]；Zn 是植物體內眾多酶的組成成分，對蛋白質合成、細胞分裂、基因表達等過程具有重要作用[2]。環境中Fe2+或Zn2+缺乏或過量都會對植物的生長和品質造成不利的影響。M’sehli等[3]發現缺Fe會造成紫花苜蓿(MedicagosativaL.)葉片葉綠素含量、光合電子傳遞速率降低，MDA含量和SOD活性升高，POD、APX活性降低。JIN[4]研究表明較高濃度Fe2+會導致菠菜(SpinaciaoleraceaL.)葉片中可溶性糖和可溶性蛋白質濃度降低，影響菠菜的品質。G?khan[5]發現缺Zn會造成豆類植物根部伸長率降低、根尖生長減緩、幼葉變黃甚至壞死。另外，據報道過量Zn會造成植物產量下降和生長遲緩，同時干擾Fe、P、Mg和Mn的吸收[6]。同時由于Zn2+和Fe2+在結構上具有相似性，會存在競爭金屬離子蛋白結合位點的情況，導致植物體內礦質元素的失衡，對植物造成損傷。已有研究表明環境中過量Zn2+會抑制植物對Fe的吸收積累，而補充Fe又能夠減輕鋅過量造成的癥狀，并恢復植物中Fe元素的含量[7]。因此，植物中鐵鋅的相互作用對鐵鋅穩態有著重要影響，對鐵鋅同時研究有助于了解植物鐵鋅交叉穩態和耐受性。

羊草(Leymuschinensis)又名堿草，是禾本科賴草屬植物，主要分布于歐亞草原，對歐亞草原生產力有重要影響，其生長情況是草原生態系統和牧草產量的基礎[8]。羊草因其豐富的營養價值而被稱為“牲畜細糧”，據劉公社等[9]報道，羊草的粗蛋白質含量能占到干物質的11%以上，在其分蘗期可以高達18.53%，而胡蘿卜素含量能達到49.50～85.87 mg/kg。同時，羊草還具有很強的抗逆性，可以生存在含水量低至3.3%的土壤或pH 8.5～11.5的鹽堿地環境中，又可以在溫度低至-42 ℃的環境下安全越冬[10-11]。羊草是內蒙古天然草原上的主要建群種，草原土壤類型由東向西依次為黑鈣土、栗鈣土、棕鈣土、灰鈣土等[12]，土壤整體呈堿性，而堿性環境中能直接被植物根部吸收利用的Fe2+、Zn2+含量很低[13-14]，同時在草原礦區還存在局部高Fe高Zn的土壤，目前羊草適應草原土壤不同鐵鋅濃度環境的機制未知，而幼苗階段是植株對環境較為敏感的時期，幼苗的生長狀況直接關系到植物成苗的生長和產量。因此，本試驗選擇基于培養基的生長體系為研究手段，以幼苗期的羊草為研究對象，初步探究不同濃度Fe2+、Zn2+處理下羊草幼苗生長和礦質元素含量的變化，以及高濃度Fe2+對羊草幼苗抗氧化指標以及相關基因表達量的變化，為探究羊草鐵、鋅營養機理，提高羊草的鐵、鋅營養利用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 試驗材料及處理

參試的羊草種子于2018年9月采集自內蒙古自治區呼和浩特市和林格爾縣。本試驗的基礎培養基為MS培養基改良后的全營養培養基[15]，其中Fe2+濃度為0.05 mmol/L，Zn2+濃度為0.015 mmol/L。本研究根據實驗目的設計以下兩類實驗。

首先，為了探究不同濃度Fe2+、Zn2+對羊草幼苗生長的影響共設置如下處理。(1)CK(對照)，全營養培養基；(2)Fe0，其中Fe2+濃度為0，Zn2+濃度為0.015 mmol/L；(3)Fe10，其中Fe2+濃度為0.5 mmol/L(為基礎培養基10倍，下同)，Zn2+濃度為0.015 mmol/L；(4)Fe20，其中Fe2+濃度為1 mmol/L，Zn2+濃度為0.015 mmol/L；(5)Zn0，其中Zn2+濃度為0，Fe2+濃度為0.05 mmol/L；(6)Zn10，其中Zn2+濃度為0.15 mmol/L，Fe2+濃度為0.05 mmol/L；(7)Zn20，其中Zn2+濃度為0.3 mmol/L，Fe2+濃度為0.05 mmol/L。

其次，為了探究在高鐵培養基中補加其他元素對羊草幼苗生長的影響，依據以上處理的表現，于基本培養基上補加微量元素Zn和大量元素Ca、Mg、K，設置如下處理。(8)Fe10+Zn10，其中Fe2+濃度為0.5 mmol/L，Zn2+濃度為0.15 mmol/L；(9)CK+ Ca/Mg/K，其中Fe2+濃度為0.05 mmol/L，Ca2+濃度為10 mmol/L，Mg2+濃度為5 mmol/L，K+濃度為20 mmol/L；(10)Fe20+ Ca/Mg/K，其中Fe2+濃度為1 mmol/L，Ca2+濃度為10 mmol/L，Mg2+濃度為5 mmol/L，K+濃度為20 mmol/L。

1.2 羊草幼苗的培養

用純凈水于4 ℃條件下浸泡羊草種子5 d，使用NaClO(西隴科學股份有限公司)與純凈水(1∶1)的溶液，添加0.5% Triton X-100，室溫搖晃清洗30 min，超凈工作臺內使用無菌水洗至清澈，得到無菌羊草種子，以腹線朝上的方式播種到培養基上，22 ℃黑暗處理2 d，豎直光照培養，12 h光照/12 h黑暗，光照強度為220 μmol·m-2·s-1，培養6 d后進行生長指標和礦質元素含量測定。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 生長狀況在1.2條件下培養6 d后使用直尺和分析天平(Sartorius BSA124S-CW，德國)采集羊草幼苗根長、葉長、鮮重數據，每株幼苗為1次重復，共40次重復。

1.3.2 礦質元素含量收集生長6 d的羊草幼苗，105 ℃殺青30 min，80 ℃烘干至恒重并記錄，使用高通量組織研磨器(寧波新芝生物 SCIENTZ-192)研磨后，加入5% HNO3，37 ℃振蕩48 h，4 ℃、12 000 r/min離心提取上清液，使用電感耦合等離子體發射光譜儀(ICP-OES，Ananlytikjena-PQ9000，德國)測定Ca、Fe、Zn、Mg、K含量，每種處理5次重復。

1.3.3 抗氧化酶活性和抗氧化物質含量羊草無菌幼苗在CK培養基生長至根長2～3 cm時，分別轉移至Fe20和CK培養基處理48 h，收集緊貼培養基生長的根段，轉移至充分預冷的研缽中并加入提取液，在冰上充分研磨后，4 ℃高速離心，收集待測液，使用試劑盒(購買自蘇州科銘生物技術有限公司)以分光光度法測定根部過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽還原酶(GR)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性以及丙二醛(MDA)、還原型谷胱甘肽(GSH)、抗壞血酸(AsA)含量，每種指標3次重復。

1.3.4 基因差異表達的分析采用與1.3.3相同處理方法獲取根部材料，經液氮充分研磨，TRIzol提取液充分混勻，離心提取上清后加入氯仿，再次離心提取上清后加入等體積異丙醇-20 ℃保存[16]。將RNA提取液干冰打包寄送北京貝瑞和康生物技術有限公司進行轉錄組學測序，每種處理3次重復。通過MQA-Fe20和MQA-CK測序結果中基因表達量均值的比值(平均變化倍數)來區分上調(比值>1)基因和下調(比值<1)基因，根據T檢驗結果保留差異顯著(P<0.05)的基因，再按照平均變化倍數排序，列出上調、下調前20基因進行分析。

1.4 數據處理

實驗數據使用Excel 2010進行統計分析，通過StudentT-test進行差異顯著性檢測。

2 結果與分析

2.1 不同Fe、Zn濃度條件對羊草幼苗生長的影響

羊草幼苗的根長在缺鐵(Fe0)和高濃度鐵(Fe10、Fe20)處理下分別比對照(CK)極顯著降低17.3%、14.8%、60.8%(P<0.01)，而在缺鋅(Zn0)和高濃度鋅(Zn10、Zn20)處理下均無顯著變化(圖1，A、D)；幼苗葉長在缺鐵和缺鋅處理下均無顯著變化，在高濃度鐵處理下分別比對照極顯著降低18.5%和33.4%，在缺鋅處理下分別極顯著升高9.6%、13.9%(圖1，B、D)；幼苗鮮重也在缺鐵和高濃度鐵處理下均比對照極顯著降低，降幅分別為13.5%、49.4%和58.3%，而在缺鋅處理下比對照顯著降低10.4%(P<0.05)，但在增加鋅處理下無顯著變化(圖1，C)。同時，由圖1，E可以看出，缺鐵對幼苗的根毛發育無明顯影響，而高濃度鐵處理(Fe10、Fe20)顯著抑制羊草幼苗的根毛發育，同樣隨濃度的升高抑制作用增強；缺鋅和高濃度鋅對羊草幼苗根毛發育均無明顯影響。可見，羊草幼苗生長發育在缺鐵和高濃度鐵條件下均受到顯著抑制作用，且抑制作用隨濃度的升高而增強，而在缺鋅和高濃度鋅條件下沒有受到顯著影響。

處理間差異顯著性檢測采用Student T-test分析，*、**、***分別表示處理與對照間在0.05、0.01和0.001水平存在顯著性差異。下圖同圖1 不同濃度Fe2+、Zn2+培養基中羊草幼苗生長指標和根毛形態The significance analysis between control and treatments conducted by Student T-test, while *, ** and *** indicate significant difference between control and treatment at 0.05, 0.01 and 0.001 levels, respectively. The same as belowFig.1 The growth phenotypes and root hair morphology of L. chinensis seedlings in medium with different concentrations of Fe2+ and Zn2+

2.2 不同Fe、Zn濃度條件對羊草幼苗礦質元素含量的影響

羊草幼苗Ca含量在缺鐵、缺鋅及高濃度鋅(Zn20)處理下均與對照無顯著差異，在高濃度鐵(Fe10、Fe20)處理下分別顯著降低40.9%和52.0%，在高濃度鋅(Zn10)處理下顯著增加17.0%，說明高濃度Fe2+顯著抑制羊草幼苗Ca含量積累，且抑制作用隨濃度的升高而增強，高濃度Zn有顯著促進Ca含量積累的趨勢(圖2，A)。同時，羊草幼苗Fe含量在缺鋅、高濃度鐵(Fe10、Fe20)處理培養下得到顯著促進，分別比對照顯著增加15.2%、188.3%、395.2%，在缺鐵處理培養下顯著降低23.2%，Fe元素積累受到顯著抑制，即隨著培養基中Fe2+濃度的升高，羊草幼苗體內的Fe元素含量逐漸升高(圖2，B)。羊草幼苗Zn含量在缺鐵、高濃度鋅(Zn10、Zn20)培養下分別比對照顯著增加156.4%、538.7%、915.1%，促進了Zn積累，而在缺鋅、高濃度鐵(Fe10、Fe20)培養下受到顯著抑制，分別比對照顯著降低34.5%、29%、34.5%(圖2，C)。羊草幼苗Mg含量在缺Fe和高濃度鋅(Zn10)培養下分別比對照顯著增加10.2%、15.4%，積累量得到顯著促進，在高濃度鐵(Fe10、Fe20)培養下分別比對照顯著降低17%、37%， Mg元素積累受到顯著抑制(圖2，D)。另外，羊草幼苗K含量僅在高濃度鐵(Fe10、Fe20)培養下受到顯著抑制，分別比對照顯著降低43.9%和65.6%，其余處理均無顯著變化(圖2，E)。以上結果說明含高濃度Fe2+培養基顯著抑制羊草幼苗對Ca、Zn、Mg、K元素的吸收積累，顯著促進Fe的吸收積累，且羊草對Fe和Zn的吸收有明顯的拮抗作用。

2.3 高濃度Fe2+條件下補加其他離子對羊草幼苗生長的影響

以上實驗結果顯示，高濃度鐵(Fe10、Fe20)培養基顯著抑制羊草幼苗的根葉生長、根毛發育以及Ca、Zn、Mg、K元素積累，現進一步探究是否可以通過補加Ca、Zn、Mg、K抑制元素來恢復高濃度鐵對羊草生長的抑制。

首先，在Fe10培養基中補加0.15 mmol/L Zn2+(Fe10+Zn10)后，羊草幼苗的根長、葉長和鮮重分別比對照顯著降低19.6%、17.9%、26.1%，根毛發育也不及對照和Zn10培養基，但均與Fe10培養無顯著差異，即在Fe10培養基中補加0.15 mmol/L Zn2+無法恢復高濃度Fe對幼苗生長的抑制作用(圖3)。

其次，在Fe20培養基中補加10 mmol/L Ca2+、5 mmol/L Mg2+、20 mmol/L K+(Fe20+ Ca/Mg/K)后，羊草幼苗根長、葉長、鮮重分別比對照顯著降低60.5%、43.1%、50%，根毛發育也明顯不及對照，所有指標也不同程度地低于Fe20培養基；在對照培養基中添加同樣濃度的Ca、Mg、K元素，羊草幼苗生長和根毛發育也顯著比對照差，但明顯優于Fe20培養基(圖4)。可見，培養基中添加額外的Ca、Mg、K元素不僅明顯抑制了羊草幼苗生長，也無法恢復高濃度鐵(Fe20)對羊草幼苗生長的抑制作用。

圖2 不同濃度Fe2+、Zn2+培養基中羊草幼苗礦質元素含量Fig.2 The element contents of L. chinensis seedlings in medium with different concentrations of Fe2+ and Zn2+

2.4 高濃度Fe2+對羊草幼苗根部氧化還原相關酶活性和化合物含量的影響

以上實驗結果表明高濃度Fe2+(Fe20)對羊草幼苗生長發育以及礦質元素含量均有顯著的抑制作用，而植物在逆境脅迫下會產生過量的活性氧(ROS)物質，導致細胞質膜的過氧化，嚴重時甚至會導致植株的死亡。因此本實驗針對高濃度Fe2+(Fe20)處理下羊草幼苗根部抗氧化系統的響應情況進行探究。表1顯示：高濃度Fe2+處理羊草幼苗48 h后，其根部過氧化物酶(POD)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽還原酶(GR)、抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性顯著上升，增幅分別為13.5%、27%、44.4%、32.9%、34.2%，而其根部丙二醛(MDA)、還原型谷胱甘肽(GSH)、抗壞血酸(AsA)含量也顯著上升，增幅分別達到62.7%、46%、114.8%。這說明環境中高濃度Fe2+脅迫雖然能誘導羊草幼苗根部抗氧化系統活性和抗氧化物質含量顯著增加，但并不能消除高鐵脅迫的影響，仍致使根部遭受到嚴重的過氧化傷害。

圖3 Fe10+Zn10培養基中羊草幼苗生長指標和典型苗根毛形態Fig.3 The growth and typical root hair morphology of L. chinensis seedlings cultured in Fe10 +Zn10

圖4 Fe20+Ca/Mg/K培養基中羊草幼苗生長指標和典型苗根毛形態Fig.4 The growth and typical root hair morphology of L. chinensis seedlings cultured in Fe20 +Ca/Mg/K

2.5 高濃度Fe2+對羊草幼苗根部相關基因表達量的影響

為進一步探究高濃度Fe2+(Fe20)處理下羊草幼苗根部相關基因的響應情況，對轉錄組測序差異表達分析數據進行整理，根據基因表達量變化倍數列出表達量顯著上調和下調排名前20的基因(表2和表3)。其中，表達量顯著上調基因中有2條植物類萌發素蛋白基因，均上調30倍以上；表達量顯著下調基因中主要為煙酰胺合成酶基因和過氧化物酶基因，均至少下調10倍以上。

表1 高濃度Fe2+(Fe20)處理羊草幼苗48 h后根部氧化還原相關酶活性和化合物含量的變化

表2 高濃度Fe2+(Fe20)處理羊草幼苗48 h根部表達量上調前20的基因

表3 高濃度Fe2+(Fe20)處理羊草幼苗48 h表達量下調前20的基因

3 討 論

3.1 羊草幼苗生長和礦質元素含量對不同濃度Fe2+、Zn2+的響應

本研究發現高濃度Fe2+顯著抑制羊草幼苗根葉生長發育以及Ca、Zn、Mg、K元素積累，這與趙燕等[17]報道的過量Fe2+會導致植株中Ca、P、K、Zn、Mg、Mn等營養元素的嚴重缺乏，植株生長發育、株高、根系長度、干物質量等受到抑制的現象相同。表明高濃度Fe2+脅迫是多種礦質元素失衡的過程，造成植物其他必需營養元素的不足，進一步加劇了脅迫對植物的毒害，使得生長發育過程無法正常進行，這是Fe2+過量導致羊草幼苗根葉生長、根毛發育嚴重受阻的重要原因。

本試驗中Zn10、Zn20處理均表現出促進羊草幼苗葉片生長的趨勢。而鄒文桐[18]、俞明惠等[19]的研究都發現隨著環境中Zn2+濃度的升高，植物生長都表現出先促進再抑制的趨勢，這與本試驗結果不一致，這可能是因為羊草幼苗階段對較高濃度的Zn2+有一定的耐受性，所以并未表現出抑制作用。段曉暉的研究表明低濃度Zn緩解了Fe處理對植物幼苗根的毒害作用，而高濃度Zn會與Fe協同作用，使毒害作用加強[20]。這與本試驗中補加高濃度的Zn2+無法恢復高濃度Fe2+對羊草幼苗抑制作用結果相同，同樣這可能也是補加Ca、Mg、K無法恢復抑制作用的原因。

本研究發現在缺Fe2+(Fe0)培養下羊草幼苗體內Zn元素含量顯著升高，在缺Zn2+(Zn0)培養下幼苗體內Fe元素含量顯著升高，這是由于Fe2+和Zn2+有著相似的離子半徑，二者在轉運載體上有著相同的轉運位點，從而在轉運中形成競爭[21]。在轉運中有競爭關系的兩種離子其中一種缺乏后，從而促進羊草幼苗轉運吸收另一種。

3.2 羊草幼苗根部抗氧化防御系統對高濃度Fe2+的響應

植物作為好氧生物，體內有眾多氧氣參與的反應，活性氧(reactive oxygen species，ROS)的產生是不可避免的。正常情況下，植物體內的ROS處于動態平衡的狀態，當ROS的產生與清除失衡時，就會對植物產生氧化脅迫，造成損傷，嚴重時還會引起細胞甚至植物的死亡[22]。根是植物從環境中吸收養分的重要器官，當環境發生改變不適宜植物生長，根的生理響應往往最直觀和迅速。本試驗中羊草幼苗根部經高濃度Fe2+處理48 h后，根部 POD、SOD、CAT活性和MDA含量顯著升高，另外抗壞血酸-谷胱甘肽循環中AsA、GSH含量和GR、APX活性也顯著升高。當環境中存在高濃度Fe2+時，植物吸收入體內的過量Fe可以通過Fenton反應等生命活動產生大量的ROS[23]，ROS含量的升高，導致羊草幼苗根部細胞質膜過氧化程度加深，MDA含量升高，同時誘導羊草體內抗氧化防御系統做出響應，POD、SOD、CAT活性顯著升高，提高ROS的清除能力，減少自身損傷；植物體內另一條ROS清除途徑抗壞血酸-谷胱甘肽循環同樣做出響應，GR、APX活性和GSH、AsA含量升高，其中AsA含量的升高表明羊草幼苗整體抗氧化能力并未衰退[24]。基于以上結果證實高濃度Fe2+對羊草幼苗造成氧化脅迫，產生大量的ROS物質，為應對脅迫羊草體內酶促反應防御系統中關鍵酶活性升高，非酶類防御系統中抗氧化化合物含量升高，大大提升了羊草體內ROS的清除能力，實現過量Fe2+環境下的防御響應。

3.3 羊草幼苗根部脅迫相關基因表達對高濃度Fe2+的響應

植物在遭受逆境脅迫下，會通過調節體內脅迫相關基因的表達量來控制相關蛋白的合成，從而使機體能更快地適應脅迫環境。王靜等[25]研究表明植株在受到脅迫后，POD表達量在6 h達到最大，并在24 h后表達量低于對照組，而本研究中高濃度Fe2+處理羊草幼苗48 h后，可能由于處理時間較長，POD表達量顯著下調。Douchkov等[26]發現煙酰胺對植物體內金屬離子的吸收和穩態的維持起著重要的作用，在煙草(NicotianatabacumL.)中過表達擬南芥(Arabidopsisthaliana)的煙酰胺合成酶(NAS)基因，可以提高葉片中Fe元素含量。本試驗發現在高濃度Fe2+處理下，羊草受到了過量Fe的毒害，為維持體內Fe穩態，下調了NAS表達量，減少煙酰胺的合成，從而降低植株對環境中Fe的吸收，保護羊草幼苗適應脅迫條件。另外，類萌發素蛋白(GLPs)是廣泛存在于各種陸生植物中的植物糖蛋白，許多定位于細胞壁，是植物在脅迫響應下細胞壁強化的輔助因子[27]。當植物受到逆境脅迫時，GLPs能夠通過發揮其結構蛋白的功能，來幫助植物度過不利的環境條件，降低脅迫對植物的傷害[28]。本試驗中羊草幼苗在高濃度Fe2+處理后，根部通過上調GLPs的表達量，提高自身在高濃度Fe2+下的適應性，降低受損傷的程度。

4 結 論

本試驗初步研究了不同鐵鋅濃度對羊草幼苗生長和礦質元素含量的影響，發現缺Zn2+(Zn0)和高濃度Zn2+(Zn20)處理下對生長無明顯影響；缺Fe2+(Fe0)和高濃度Fe2+(Fe20)對生長均有抑制作用，尤其是高濃度Fe2+培養下對羊草幼苗根葉生長、根毛發育以及Ca、Zn、Mg、K元素含量有顯著的抑制，表明羊草幼苗對Zn2+濃度變化不敏感，而對Fe2+濃度變化敏感。進一步研究發現高濃度Fe2+(Fe20)會導致羊草幼苗根中POD、SOD、CAT、APX、GR活性和MDA、AsA、GSH含量顯著升高；NAS、POD表達量顯著下調，GLPs表達量顯著上調。從而證實高濃度Fe2+會對羊草幼苗造成嚴重的氧化脅迫。本研究結果填補了羊草鐵鋅脅迫方面研究的空白，可為了解羊草及相關植物對鐵鋅的適應特性提供依據，為提高羊草的鐵鋅營養利用提供重要參考。