外源H2O2對鹽堿脅迫下蘋果矮化砧木幼苗生理特性的影響

杜 蕾，楊建寧，王星星，張 德，趙 婷，張 瑞，王延秀*

(1 甘肅農業大學 園藝學院，蘭州 730070；2 天水市麥積區果品產業局，甘肅天水 741000)

鹽堿脅迫嚴重制約著西北黃土高原地區的農業發展[1]，生產中選擇種植耐鹽堿的植物是當地農業可持續發展和改善生態環境最為經濟有效的策略之一[2]。鹽堿逆境是制約植物生長發育的非生物脅迫[3]，主要通過滲透脅迫、離子毒害、高pH傷害以及活性氧脅迫等對植物造成傷害[4]，影響植物種子萌發、植株生長發育[5]、生理代謝[6]、光合作用[7]等多個生理活動。

利用外源物質誘導植物產生抗逆性已成為近年來緩解脅迫的有效方法之一[4]。過氧化氫(hydrogen peroxide, H2O2)作為一種重要的信號分子，高濃度下會對植物造成傷害，但在低濃度下可作為脅迫信號分子誘導多種防御基因和信號蛋白的表達[8]。研究表明，外源H2O2可以顯著緩解NaCl脅迫對小白菜[9]、番茄[10]和NaHCO3脅迫對燕麥幼苗生長的抑制[11]；可提高唐古特白刺呼吸速率，降低氧化脅迫和緩解膜脂過氧化作用，有效增強其對鹽漬環境的適應性[12]；還可增強漬水脅迫下小麥的光合性能，提高細胞抗氧化能力[13]。H2O2處理可以顯著提高鎘脅迫下水稻根系活力和葉綠素含量[14]，改善燕麥生理特性，提高其耐鹽性[15]。外源H2O2通過增強抗氧化系統活性和調控相關蛋白的表達來緩解NaCl脅迫[16]和干旱脅迫對黃瓜葉綠體膜的傷害[17]。然而，外源H2O2能否調控鹽堿脅迫下果樹幼苗的生理響應，增強其鹽堿耐性，目前鮮見相關研究報道。

矮化密植是世界蘋果栽培的主要方向，其中M9-T337砧木是世界各國應用最成功、最廣泛的脫毒矮化砧木[18]，近年來在西北黃土高原地區如甘肅寧縣得到廣泛發展，具有適應性廣、主干性強、易成花、豐產性好等特點[19]。但在生產中也存在由于該區域土壤含鹽量較高，尤其NaHCO3含量較高導致株體黃化、長勢較弱。砧木是果樹響應土壤脅迫的主要載體，因此利用具有發展前景的矮化砧木研究鹽堿脅迫下果樹幼苗對外源物質的生理效應具有重要意義。因此，本試驗以2年生M9-T337自根砧木苗為試材，通過盆栽試驗，研究鹽堿脅迫下噴施不同濃度H2O2對M9-T337幼苗生理特性的影響，旨在探討鹽堿脅迫下M9-T337幼苗對外源H2O2的生理響應機理，以期為H2O2在提高果樹耐鹽堿性領域的應用提供一定理論依據。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

2020年3月選取長勢一致的M9-T337二年生自根砧苗移入盛裝3.5 kg基質(20%蛭石，20%珍珠巖，60%泥炭)、重量為0.65 kg的花盆(內徑25 cm，深38 cm)中，每盆1株，移苗后澆透水，并置于甘肅農業大學園藝學院避雨棚(E 103°34′,N 36°10′)中進行統一管理，定期除草、施肥、澆水。

1.2 試驗處理

2020年6月選取長勢一致、無病蟲害的M9-T337二年生幼苗進行試驗，設0.1 mol/L NaCl + NaHCO3溶液為鹽堿脅迫[20]。試驗共設6個處理，即澆灌清水(CK)、鹽堿脅迫(T1)、鹽堿脅迫+0.2 mmol/L H2O2(T2)、鹽堿脅迫+0.4 mmol/L H2O2(T3)、鹽堿脅迫+0.6 mmol/L H2O2(T4)、鹽堿脅迫+0.8 mmol/L H2O2(T5)。鹽堿脅迫采用澆灌鹽堿水的方式進行，每天澆灌1次，每次500 mL，共澆灌3 d；鹽堿脅迫3 d后于每日18:00向葉面噴施不同濃度H2O2溶液，每盆均勻噴施50 mL，CK和 T1分別噴施50 mL蒸餾水，每天噴施1次，共噴施3 d；每個處理3次重復，每個重復3盆。處理期間，每隔5 d于17:00-18:00澆灌500 mL清水(水分剛好不外滲)，分別于脅迫處理0、7、14、21 d取樣進行各項指標的測定和分析。

1.3 測定指標及方法

1.3.1 光合參數采用便攜式光合儀(Li-6400，Li-COR，Linco ln，NE，USA)，于脅迫0、7、14、21 d上午9:00-11:00選取向陽枝條上的功能葉片測定其凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、胞間CO2(Ci)、氣孔導度(Gs)，每處理選取3株。使用光合儀系統控制葉片溫度于25 ℃，測定系統采用開放式氣路，自然光源，光合有效輻射為400～600 μmol·m-2·s-1，葉室內空氣流量設定為500 mL·min-1，室內CO2濃度為(385±10)μL·L-1。

1.3.2 葉綠素含量采集脅迫處理0、7、14、21 d的葉片，用蒸餾水沖洗表面污物并去除葉脈部分，稱取0.2 g新鮮樣品剪碎于試管中，加入10 mL 80%的丙酮進行24 h提取。在波長645 nm、663 nm下測定吸光度。計算葉綠素a(Chl a)和葉綠素b(Chl b)的含量，二者之和為葉綠素總量(Chl t)。

1.3.3 生理指標于脅迫處理后0、7、14、21 d取植株中上部功能性葉片，剪掉葉脈并洗凈磨碎，用于相關生理指標的測定。其中，相對電導率(REC)測定采用電導儀法[21]，游離脯氨酸(Pro)含量測定采用酸性茚三酮法[22]，可溶性總糖(TSS)含量測定采用蒽酮比色法[23]，可溶性蛋白(SP)含量測定采用考馬斯亮藍法[23]，丙二醛(MDA)含量測定采用硫代巴比妥酸法[24]，超氧化物歧化酶(SOD)活性的測定采用氮藍四唑光化還原法[21]，過氧化物酶(POD)活性的測定采用愈創木酚法[23]，過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性的測定采用紫外吸收法[23]。

1.4 數據處理與分析

用Excel 2013及Origin 8.0進行數據處理及做圖，并用SPSS 22.0進行方差分析和主成分分析。統計分析采用單因素ANOVA的LSD法比較處理間差異顯著性(α=0.05)。

2 結果與分析

2.1 鹽堿脅迫下外源H2O2對M9-T337幼苗葉片表型的影響

在鹽堿脅迫處理21 d時，各處理M9-T337幼苗葉片表型如圖1所示。其中，與CK相比，單獨鹽堿脅迫處理(T1)下葉片黃化嚴重，邊緣枯萎；與T1相比，不同濃度外源H2O2處理(T2-T5)效果不同， T2處理下葉片稍有恢復但仍明顯發黃，T3處理下葉片已明顯復綠，生長狀態最好，T4處理葉片復綠狀況比T3稍差，T5處理葉片復綠狀況較差，稍優于T2處理。可見，T3處理對鹽堿脅迫傷害的緩解效果最佳，隨后依次為T4、T5、T2處理。

CK.澆灌清水；T1. 0.1 mol/L NaCl + NaHCO3溶液(鹽堿脅迫)；T2.鹽堿脅迫+0.2 mmol/L H2O2；T3.鹽堿脅迫+0.4 mmol/L H2O2；T4.鹽堿脅迫+0.6 mmol/L H2O2；T5.鹽堿脅迫+0.8 mmol/L H2O2圖1 鹽堿脅迫下外源H2O2對M9-T337幼苗葉片表型的影響CK. Irrigation water; T1. 0.1 mol/L NaCl + NaHCO3 solution (saline-alkali stress); T2. Saline-alkali stress+0.2 mmol/L H2O2; T3. Saline-alkali stress+0.4 mmol/L H2O2; T4. Saline-alkali stress+0.6 mmol/L H2O2; T5. Saline-alkali stress+0.8 mmol/L H2O2Fig.1 Effect of exogenous H2O2 on leaf phenotype of M9-T337 seedlings under saline-alkali stress

2.2 鹽堿脅迫下外源H2O2對M9-T337幼苗葉片葉綠素含量的影響

圖2顯示，隨著鹽堿脅迫時間的延長，各脅迫處理M9-T337幼苗葉片葉綠素含量(Chl a、Chl b和Chl t)均呈現逐漸降低的趨勢，但降幅存在差異；在相同處理時間下，各鹽堿脅迫處理幼苗葉片的葉綠素含量均顯著低于同期對照；各濃度H2O2處理(T2-T5)又不同程度高于同期單獨鹽堿脅迫處理(T1)，且大多達到顯著水平，同時隨著H2O2濃度增加呈現出先升后降的趨勢，并均在T3或者T4處理下達到最大值。其中，鹽堿脅迫至21 d時，M9-T337幼苗葉片Chl a、Chl b和Chl t含量在T1處理下分別比CK顯著降低41.74%、35.72%和39.30%，在T3處理下分別比CK顯著降低23.37%、20.35%和22.15%，降幅顯著低于其余鹽堿脅迫處理。可見，鹽堿脅迫顯著降低了M9-T337幼苗葉片葉綠素含量，葉面噴施不同濃度的H2O2能顯著緩解葉綠素含量降低的趨勢，并以T3處理(0.4 mmol/L H2O2)效果最佳。

同期不同小寫字母表示處理間在0.05水平差異顯著。下同圖2 外源H2O2對鹽堿脅迫下M9-T337幼苗葉片Chl a、Chl b和Chl t含量的影響Different normal letters within same stage indicate significant difference among treatments at 0.05 level. The same as belowFig.2 Effect of exogenous H2O2 on Chl a, Chl b and Chl t contents in leaves of M9-T337 seedlings under saline-alkali stress

2.3 鹽堿脅迫下外源H2O2對M9-T337幼苗葉片光合氣體交換參數的影響

由圖3可知，隨著鹽堿脅迫的持續，M9-T337幼苗葉片的Pn、Tr和Gs均呈顯著下降趨勢，而Ci呈上升趨勢；處理組Pn、Tr和Gs在同時期表現出隨H2O2濃度增加而先升后降的趨勢，Ci則呈現先降后升的趨勢；各鹽堿脅迫處理組(T1-T5)Pn、Tr和Gs均大幅顯著低于同時期對照，噴施H2O2處理組(T2-T5)又顯著高于同時期T1處理；同時，T1-T5處理組Ci則顯著高于同時期對照，T2-T5處理組又顯著低于T1處理。其中，脅迫處理至21 d時，各處理M9-T337幼苗葉片的Pn、Tr和Gs分別比同期CK顯著降低42.20%(T4)～62.71%(T1)、46.74%(T4)～73.49%(T1)、35.97%(T3)～56.84%(T1)，葉片Ci比同期CK顯著升高92.49%(T3)～128.06%(T1)，即以上各光合參數均在T3或者T4處理下升降幅度最小。可見，鹽堿脅迫顯著降低了M9-T337幼苗葉片的Pn、Tr和Gs，升高了Ci，葉面噴施不同濃度的H2O2均能顯著緩解Pn、Tr、Gs降低和Ci升高的趨勢，并以T3處理(0.4 mmol/L H2O2)或T4處理(0.6 mmol/L H2O2)效果最佳。

2.4 鹽堿脅迫下外源H2O2對M9-T337幼苗葉片滲透調節物質含量的影響

圖4顯示，隨著鹽堿脅迫時間的延續，各處理M9-T337幼苗葉片的可溶性總糖和脯氨酸含量均呈逐漸上升趨勢，而其可溶性蛋白含量呈逐漸下降的趨勢；在相同脅迫時間內，處理組可溶性總糖、脯氨酸和可溶性蛋白含量均隨H2O2濃度增加而先升后降，并均在T3處理下達到最大值；T1-T5處理的可溶性總糖和脯氨酸含量均顯著大幅高于同期對照，而其可溶性蛋白含量始終顯著低于同期對照；與同期單獨鹽堿脅迫(T1)相比，噴施H2O2處理組(T2-T5)可溶性總糖、脯氨酸和可溶性蛋白含量均不同程度升高，且大多達到顯著水平。其中，脅迫處理至21 d時，各處理M9-T337幼苗葉片的可溶性總糖和脯氨酸含量分別比同期CK顯著增加109.63%(T3)～65.58%(T1)和102.10%(T1)～148.14%(T3)，葉片可溶性蛋白含量比同期CK顯著降低33.46%(T3)～47.13%(T1)。由此可見，鹽堿脅迫顯著提高了M9-T337幼苗葉片的可溶性總糖和脯氨酸含量，顯著降低了葉片可溶性蛋白含量，葉面噴施不同濃度的H2O2均能增加幼苗葉片各滲透調節物質含量，并均以T3處理(0.4 mmol/L H2O2)效果最佳。

圖3 外源H2O2處理對鹽堿脅迫下M9-T337幼苗葉片Pn、Ci、Gs和Tr的影響Fig.3 Effect of exogenous H2O2 treatment on Pn, Ci, Gs and Tr in leaves of M9-T337 seedlings under saline-alkali stress

2.5 鹽堿脅迫下外源H2O2對M9-T337幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

由圖5可知，隨著鹽堿脅迫時間的延長，M9-T337幼苗葉片的SOD、POD活性呈先升高后降低的趨勢，在脅迫7 d時達到峰值，且各鹽堿脅迫處理在脅迫7 d時均顯著高于對照，在其余時間顯著低于對照；CAT和APX活性則表現出不斷升高的趨勢，在脅迫21 d時達到峰值，且各鹽堿脅迫處理均顯著高于同期對照。隨著H2O2濃度的升高，葉片4種抗氧化酶活性在同一脅迫時期內均呈現先升高后降低的趨勢，且噴施H2O2處理大多顯著高于同期單獨鹽堿脅迫處理(T1)。其中，脅迫至21 d時，與同期CK相比較，各鹽堿脅迫處理葉片的SOD和POD活性分別顯著降低32.64%(T2)～56.86%(T1)和20.09%(T3)～43.93%%(T1)，而其CAT和APX活性分別顯著升高143.20%(T1)～188.80%(T4)和146.34%(T1)～187.80%%(T3)。由此可見，外源H2O2可有效提高鹽堿脅迫下M9-T337幼苗葉片中4種抗氧化酶活性，并多以T3處理(0.4 mmol/L H2O2)效果較佳。

圖4 外源H2O2處理對鹽堿脅迫下M9-T337幼苗葉片可溶性總糖、可溶性蛋白和脯氨酸含量的影響Fig.4 Effect of exogenous H2O2 treatment on total soluble sugar, soluble protein and proline contents in leaves of M9-T337 seedlings under saline-alkali stress

圖5 外源H2O2處理對鹽堿脅迫下M9-T337幼苗葉片SOD、POD、CAT、APX活性的影響Fig.5 Effect of exogenous H2O2 treatment on SOD, POD, CAT and APX activities in leaves of M9-T337 seedlings under saline-alkali stress

圖6 外源H2O2處理對鹽堿脅迫下M9-T337幼苗葉片REC和MDA含量的影響Fig.6 Effect of exogenous H2O2 treatment on REC and MDA content in leaves of M9-T337 seedlings under saline-alkali stress

2.6 鹽堿脅迫下外源H2O2對M9-T337幼苗葉片細胞膜透性的影響

從圖6來看，各脅迫處理M9-T337幼苗葉片的相對電導率(REC)和丙二醛(MDA)含量隨脅迫時間的延長均呈逐漸升高趨勢，且在不同處理下增幅不同；除脅迫前(0 d)以外，各時間點REC和MDA含量均隨H2O2濃度增加而表現出先降后升的趨勢，并均在T3處理下達到最低值，且鹽堿脅迫處理均顯著高于同期對照，各噴施H2O2處理又顯著低于單獨鹽脅迫處理(T1)。其中，當脅迫處理至21 d時，相比CK而言，各處理的REC和MDA含量分別顯著增加40.50%(T3)～91.61%(T1)、92.50%(T3)～118.74%(T1)，均以T3處理增幅最小，并與其余處理差異顯著。說明外源H2O2處理能有效緩解鹽堿脅迫下M9-T337幼苗葉片細胞膜透性的增大趨勢，其中T3處理效果最好。

2.7 外源H2O2對鹽堿脅迫下M9- T337幼苗葉片生理效應的綜合評價

2.7.1 相關性分析為反映不同處理下M9-T337幼苗葉片各項指標的關系，將上述16個葉片生理生化指標進行相關分析。結果(表1)表明， M9-T337幼苗葉片的Pn與Tr、Gs、Chl a、Chl b、Chl t、SP、SOD、POD均呈極顯著正相關(P<0.01)，與Ci、MDA呈極顯著負相關(P<0.01)，與CAT、APX、REC呈顯著負相關(P<0.05)；葉片Chl t含量與Tr、Gs、SP、SOD、POD均呈極顯著正相關(P<0.01)，與Ci、MDA、REC均呈極顯著負相關(P<0.01)。

2.7.2 主成分分析對表1中指標標準化，其中的負相關指標數值進行1-X處理，然后進行主成分分析，提取特征值大于1的2個主成分，其特征值分別為14.336和1.373(表2)，方差貢獻率分別為89.602%和8.584%，累計方差貢獻率達到98.186%，符合分析要求。其中第一主成分(PC1)綜合了Pn、Tr、Gs、Chl a、Chl b、Chl t、SOD、POD、SP等指標的信息，第二主成分(PC2)綜合了Ci、TSS、Pro、CAT、APX、REC、MDA等指標的信息。

2.7.3 綜合得分排名對上述2個主成分代表的指標進行總得分排名，F1、F2分別代表第一、第二主成分。綜合得分(F)是每個主成分得分與對應貢獻率的乘積之和，即：F=F1×89.602%+F2×8.584%。由表3可知，M9-T337幼苗葉片在不同處理下的綜合得分分別為1.7517(CK)、-0.8279(T1)、-0.3208(T2)、-0.0070(T3)、-0.2065(T4)、-0.3895(T5)，因此，不同處理對M9-T337幼苗葉片生理特性的效應依次為：CK、T3、T4、T2、T5、T1。

表2 主成分分析方差解釋

3 討 論

葉綠素是植物光合作用中光、電轉換的載體，其含量高低反映了植物葉片光合作用水平的高低[25]。本試驗中，隨著鹽堿脅迫時間的延長，M9-T337幼苗葉片的Chl a、Chl b、Chl t含量均呈不同程度下降趨勢，可能是細胞內過量的Na+直接置換葉綠體中的Mg2+，致使葉綠素的分子結構遭到破壞而降低了葉綠素含量[26]。通過不同濃度H2O2處理緩解了葉綠素含量的下降，這與劉建新[27]在裸燕麥幼苗中的研究結論相一致，可能是外源H2O2通過保護葉綠素分子結構從而促進了M9-T337幼苗葉片光合色素的積累。Pn、Tr、Gs和Ci是評價光合作用強弱的4個重要指標。本研究中，Pn、Tr、Gs隨脅迫時間的延長均呈不同程度的下降趨勢，噴施一定濃度的H2O2可緩解這種下降趨勢，而Ci的變化趨勢與Pn、Tr、Gs恰好相反，且在同一時間點隨著H2O2濃度的增加，Pn、Tr、Gs呈先升后降的趨勢，而Ci呈先降后升的趨勢，這可能是鹽堿脅迫下M9-T337幼苗葉片在噴施不同濃度H2O2后合成有機物、抑制光合細胞活性、減弱蒸騰速率和增強光合作用的能力存在差異。有研究表明，Pn下降主要包括氣孔限制因素和非氣孔限制因素。在本研究中，隨著葉片Pn下降，其Gs下降，而Ci上升，則說明光合細胞機構和功能受到損害等非氣孔因素是引起M9-T337幼苗光合速率下降的主要原因[28-29]。

表3 M9-T337幼苗在不同處理下的綜合得分排名

表1 不同處理下M9-T337幼苗葉片各項指標的相關性分析

可溶性蛋白、可溶性總糖與脯氨酸等滲透調節物質的積累能有效減緩逆境脅迫對植物造成的傷害[30]。本研究中, M9-T337幼苗葉片可溶性總糖和脯氨酸含量隨著脅迫的持續均呈上升趨勢，可溶性蛋白含量則逐漸下降，這與劉建新等[31]在裸燕麥中的結論不符，而與郝鳳等[32]在紫花苜蓿中的研究結論相一致?？赡苁且驗槊{迫條件和植物種類不同，不同滲透調節物質積累存在差異。外源H2O2處理促進了鹽堿脅迫下M9-T337幼苗葉片可溶性總糖、脯氨酸和可溶性蛋白的積累。可溶性總糖與脯氨酸的積累可能與H2O2對碳同化力的提高和脯氨酸合成酶的激活有關[27]?？扇苄缘鞍缀可仙脑?，除與外源H2O2能促進抗逆蛋白表達有關外，還與外源H2O2抑制活性氧產生，從而影響蛋白酶活性升高，抑制可溶性蛋白降解有關[32-33]。

植物體內存在的酶促保護體系可清除鹽堿脅迫下產生的大量活性氧[34-36]，其中包括超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)、過氧化氫酶(CAT)和抗壞血酸過氧化物酶(APX)等[37]。本試驗中，隨著脅迫時間的延長，M9-T337幼苗葉片的SOD 和POD活性呈先升后降的趨勢，與趙婷等[38]在垂絲海棠幼苗和李曉榮等[39]在藜異型性種子后代植株中的研究結果一致，可能是由于M9-T337幼苗能在短期內啟動保護體系及時清除活性氧，隨著脅迫的持續或加劇，蛋白分解大于合成，SOD 和POD活性下降；同時，本試驗中CAT和 APX活性呈不斷上升的趨勢，與閆淳[40]在西伯利亞白刺中的研究結果不一致，可能的原因是 M9-T337自身合成了大量CAT和APX以避免過多的活性氧積累對植物造成傷害。噴施不同濃度H2O2處理后，4種抗氧化酶的活性均不同程度提高，可能與H2O2能夠上調活性氧清除酶的編碼基因表達，提高酶活性有關，這與前人研究中外源H2O2可通過提高抗氧化系統防御能力增強植物耐鹽性[41]的結論一致。

相對電導率的變化可表示植物在逆境脅迫條件下質膜透性的變化[42]，而MDA含量高低可反映植物細胞膜膜脂過氧化程度[43-44]。本研究中，M9-T337幼苗葉片的相對電導率和MDA含量隨脅迫時間的延長而呈不斷升高趨勢，可能是鹽堿脅迫導致細胞膜受損，進而引起細胞內電解質外滲[45]，這與邢曉琳在紫花苜蓿[46]中的研究結論一致。同時，不同濃度外源H2O2處理后，各處理幼苗葉片的相對電導率和MDA含量相對于單獨鹽堿脅迫處理均有不同程度下降，可能的原因是外源H2O2可減緩鹽堿脅迫下M9-T337幼苗葉片細胞膜透性的增大和膜脂過氧化產物的增加，這與李素芝在番茄中的研究結果相似[47]。

綜上所述，外源H2O2對鹽堿脅迫下M9-T337幼苗葉片的影響是多個生理活動相互作用的結果，本實驗通過測定16個相關生理指標并進行相關性和主成分分析，通過綜合得分排名得出，不同濃度外源H2O2對鹽堿脅迫下M9-T337幼苗葉片生理特性的影響排名依次為：T3> T4> T2> T5> T1，這與實際觀察到的M9-T337幼苗葉片的表型相符合。因此，外源H2O2通過緩解鹽堿脅迫下M9-T337幼苗葉片光合作用的減弱，提高抗氧化酶活性和滲透調節物質含量，降低膜脂過氧化程度來改善植株光合能力、維持抗氧化酶系統和膜內外環境的相對穩定，進而清除過量活性氧，抑制鹽堿脅迫對其造成的傷害，并具有濃度效應，以0.4 mmol/L的H2O2緩解作用效果最佳。