海島棉GbHCT13基因的功能驗證

滕 露，鄭 凱，曲延英，陳全家

(新疆農業大學 農學院/農業生物技術重點實驗室，烏魯木齊 830052)

棉花為錦葵科(Malvaceae)棉屬(Gossypium)植物的種籽纖維，是世界性重要經濟作物。世界主要棉產國有中國、美國、印度和巴基斯坦及中亞地區，主要栽培品種為陸地棉。在新中國成立70年以來的生產實踐中，棉花生產取得的長足進步為實現國家富強、改善和提高人民生活水平做出了巨大貢獻。依靠科技進步實現棉花生產的可持續發展尤為重要[1]。中國是世界上主要棉花生產和消費國之一，棉纖維作為其主要產品而倍受關注。然而，廣泛種植的陸地棉其纖維品質較差，不能滿足現代紡織工業對原棉多樣性的要求[2]，高品質棉纖維仍需進口，成為制約棉花相關產業發展的瓶頸之一。故改良纖維品質已成為棉花育種行業的主要目標。而海島棉纖維品質優良，研究其纖維發育相關基因，用以改善纖維品質并滿足生產需求具有重要理論意義和應用價值。

目前廣泛認同的棉纖維發育模式是由Jasdanwala于1977年提出的纖維起始、伸長、次生壁加厚和脫水成熟4個時期[3]，該時期的確定對后來纖維的發育調控研究具有重要指導意義[4]。棉花纖維發育是一個高度程序化的過程，期間經歷多種化學物質的復雜生理生化變化。該歷程也受到多種基因的調控[5-6]，纖維發育的4個時期沒有明顯的分界線又互相交疊，并且這種現象在品種間也存在差異。棉花纖維與人民生活緊密相關，纖維品質的優劣對于農業工業生產也影響巨大[7]，故研究棉花纖維發育的分子機制具有重要的生物學意義以及實踐生產價值。木質素是苯丙烷代謝途徑的重要產物之一[8]，是進行植物體物質運輸的重要場所，被稱為植物生理學的支柱[9]。其合成過程需要大量酶的參與，這些合成酶在植物不同組織中存在表達差異[10]，其中HCT基因位于合成木質素途徑中的上游位置，是G/S木質素單體合成的主要控制基因，因此可以通過調控HCT基因來實現木質素單體的生物轉化，從而達到改變植物木質素單體組成以及降低木質素含量的目的。HCT基因在木質素合成過程研究得較晚，隨著研究深入，該基因越來越受到重視。轉HCT的楊樹莖桿木質部細胞發生形態結構改變，細胞壁薄而中腔增大，纖維絲排列方向改變[11]；下調HCT引起植株木纖維細胞和導管分子細胞顯著減小[12]；前人通過沉默煙草中HCT探究該基因對植株木質化的影響發現，HCT蛋白在煙草莖稈中的活性較根和其他組織高，主要分布在木質化組織中，證實了HCT抑制對木質素合成有直接影響，其中莖稈和根組織中最幼嫩的組織受影響最大[13]。進一步研究了HCT基因沉默對木質素結構的影響發現，沉默植物木質素結構的變化主要是S單元的減少和H單元的增加，表明HCT在不同木質素單體轉化之間的作用。對成熟棉纖維中的木質素含量測定發現，不同發育時期單位棉鈴纖維的木質素含量變化具有一定規律性，木質素會隨著發育時期的變化逐步增加，同時在纖維的超微結構中，次生壁加厚也具有相同的趨勢，即木質素積累的變化與纖維素的沉積具有相同的趨勢[14]。范玲等[15]通過多種研究方法證實了棉花纖維發育過程中存在苯丙烷代謝途徑，并且證實了該代謝途徑的中間產物與細胞壁相關。棉纖維細胞壁的組分含量，直接關系到棉花纖維的品質和產量。因此，了解棉纖維發育過程及該過程中纖維細胞壁組分的變化對于正確認識棉纖維品質形成的分子生物學基礎有著重要的意義。

本研究通過克隆海島棉HCT基因，并構建過表達和基因沉默載體轉化擬南芥和棉花，觀察轉基因植株的表型并測定相關指標，進而分析HCT基因在棉花纖維發育中的表達情況，為了探索苯丙烷類化合物對發育中的棉纖維的影響，進一步檢測該途徑中關鍵基因在纖維中的表達情況，對研究纖維發育相關基因的作用及其分子機制奠定實驗基礎。

1 材料和方法

1.1 材 料

本實驗材料為海島棉‘新海21’、陸地棉ND203和哥倫比亞野生型擬南芥(col)，種子均保存于新疆農業大學農業生物技術重點實驗室。本研究所用大腸桿菌菌株是(Escherichiacoli)DH5α，載體轉化采用根癌農桿菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株GV3101，植物表達載體是pCAMBIA3301，VIGS基因沉默所用病毒載體pTRV1和pTRV2,以及CLA基因均由新疆農業大學農業生物技術重點實驗室保存。

1.2 方 法

1.2.1GbHCT13基因轉化擬南芥及棉花1)GbHCT13植物過表達載體構建。設計雙酶切引物GbHCT13-F和GbHCT13-R擴增GbHCT13基因(表1)，反應體系為：DNA 2 μL，10×HiFi-緩沖液 5 μL，上下游引物各1 μL，ddH2O 11 μL，dNTP混合物4 μL，HiFi酶1 μL。將測序結果正確的GbHCT13基因片段與pCAMBIA3301質粒經限制性內切酶BglⅡ和Eco91 Ⅱ經37 ℃酶切40 min，反應體系為：目的片段7 μL，酶均為1 μL，10×PCR 緩沖液 4 μL，ddH2O 7 μL。檢測后連接GbHCT13基因與載體大片段，并轉化DH5α。利用pCAMBIA3301載體通用引物bar-F和bar-R對轉化后的陽性菌落進行PCR檢測，將正確重組質粒命名為pCAMBIA3301-GbHCT13。

表1 實驗中所用引物序列表

2) 菌液的準備。將含有pCAMBIA3301-GbHCT13質粒的農桿菌菌液，于28 ℃、200 r/min恒溫搖床中培養至OD為0.6，培養時添加50 mg/mL的抗生素卡那霉素和利福平；轉接入新鮮LB培養基繼續培養至菌液OD為1.0～1.2；制備好的菌液4 000 r/min離心10 min，棄上清后用10%蔗糖溶液重懸菌體沉淀至OD為0.6～0.8。

3) 轉基因操作。轉化前一天標記即將開花的棉花花朵，次日上午對標記的花朵進行菌液噴施，保證噴霧覆蓋整個花冠，菌液能完全侵染花藥和柱頭；用小皮筋輕柔捆扎噴施后的花朵，以防止菌液快速蒸發。擬南芥轉化操作前修剪多余果夾，保留頂端花序用于侵染；目標菌液侵染植株整個花序時間不超過60 s；侵染完成后先經25 ℃黑暗培養24 h；再轉為16 h/8 h光照條件下正常培養至收獲種子；根據實際轉化情況，于1周之后開展第2次侵染，步驟同上。

4) 轉GbHCT13基因擬南芥與棉花植株篩選與鑒定。設置3種濃度(0.06%、0.07%和0.08%)的除草劑用于轉基因棉花抗性篩選及PCR樣品檢測，引物為bar-F/R。待轉化后的擬南芥T0代種子幼苗的2片子葉完全展開即可進行抗性篩選，將200 μL 10%的除草劑原液和400 μL表面活性劑吐溫20，溶于400 mL水中，連續噴施3次，1周后觀察幼苗表型，分離黃化與正常綠色植株，常綠植株移栽至新的營養土中培養至收獲種子。

5) 轉基因植株表型鑒定及相關檢測。轉基因棉花采取梳絨方法并測定纖維長度，纖維樣品送公司測定指標。對GbHCT13轉基因擬南芥進行表型拍照，統計其莖稈表皮毛數量、6～8葉期的葉片數量、抽薹數量。莖稈截取2～3 cm用FAA固定液保存，進行番紅-固綠染色，用ImageJ軟件進行圖片分析。利用qRT-PCR檢測苯丙烷代謝通路上相關基因的表達變化。

1.2.2 轉GbHCT13基因棉花VIGS沉默1)GbHCT13基因沉默載體構建。根據GbHCT13全長序列，選取非保守區大小為328 bp插入序列與pTRV2載體連接，設計帶酶切位點的特異性引物VIGS-GbHCT13-F和VIGS-GbHCT13-R(表1)進行PCR擴增(退火溫度為62 ℃)，分別用EcoRⅠ與BamHⅠ對質粒和PCR純化產物進行雙酶切，酶切產物經純化后，用T4連接酶將酶切產物于22 ℃連接20 min，將連接產物轉化大腸桿菌DH5α，菌液PCR檢測陽性克隆，再送至北京華大測序有限公司測序。

2)GbHCT13基因沉默操作步驟。將制備好的pTRV1、pTRV2、pTRV2-CLA和pTRV2-GbHCT13分別轉入農桿菌GV3101中，活化后離心重懸菌體，調節OD600為1.0～1.5；將3種菌液按照1∶1比例混合后注射完全展開的棉株子葉背面，注射菌液覆蓋葉片80%以上；注射的植株暗培養24 h后置于28 ℃恒溫培養。

3)GbHCT13基因沉默效率檢測。注射2周后隨機選取2個品種的基因沉默植株與對照植株，用植物多糖多酚RNA提取試劑盒提取新生葉片RNA(北京天根)，并用RNase-free DNase I試劑盒合成cDNA第一鏈，經1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后作為PCR模板。使用SYBR Green Master Mix(美國ABI)在ABI Prism7500系統中進行qRT-PCR，以棉花ubiquitin 7(UBQ7)基因作為內參，每個樣品進行3次重復檢測，結果采用2-ΔΔCt法進行數據分析。

4)GbHCT13沉默植株表型觀察。拍照觀察GbHCT13基因沉默植株長勢變化，采用體式顯微鏡觀察其莖稈和葉柄表皮毛數量及密度變化，數據統計和顯著性分析采用Graphpad Prism軟件。

5)GbHCT13沉默植株莖稈組織切片分析。截取GbHCT13基因沉默的2個品種植株子葉節點以上的整段莖稈，切分為2～3 cm的小段后保存于FAA固定液中，送至武漢賽維爾生物公司進行切片和番紅固綠染色處理。

6)GbHCT13沉默植株木質素含量測定。本實驗參考曹雙瑜等[16]的硫酸木質素(Klason)方法，在此基礎上略有改動。稱取待測植株莖稈各2 g，經緩沖液(50 mmol/L Tris-HCl，10 g/L Triton X-100，1 mol/L NaCl)清洗2次，80%丙酮洗2次，純丙酮洗1次，烘干備用；將定量濾紙用3%硫酸浸潤后烘干至恒重W1(g)；將烘干的莖稈樣品置于50 mL離心管內，加15 mL 4 ℃下預冷的72%硫酸，室溫靜止2 h，期間每隔10 min充分混勻1次，直至莖稈完全被降解；加水稀釋至硫酸終濃度為3%；經0.1 Mpa，121 ℃的滅菌鍋降解1 h；冷卻至室溫后用處理好的濾紙過濾殘渣；濾紙及殘渣烘干至恒重記為W2(g)；灼燒后測定過濾物的灰分W3(g)；計算酸不溶木質素量%=(W2-W1-W3)/2×100%。

2 結果與分析

2.1 擬南芥中GbHCT13基因功能驗證

2.1.1 pcAMBIA3301-GbHCT13重組載體檢測雙酶切驗證以前期克隆完成的T5-GbHCT13質粒為模板，連接GbHCT13與pCAMBIA3301載體，轉化根癌農桿菌GV3101后篩選含有正確連接GbHCT13片段的陽性重組載體菌液，結果表明重組載體成功轉化農桿菌(圖1，A)。采用BglⅡ和Eco91 Ⅰ酶對重組載體進行雙酶切驗證(圖1，B)，GbHCT13片段大小為1 311 bp，pCAMBIA3301載體大片段9 264 bp，將片段大小正確的重組載體命名為pCAMBIA3301-GbHCT13保存備用。

2.1.2 轉GbHCT13基因擬南芥植株篩選鑒定如圖2所示，轉GbHCT13基因的擬南芥經除草劑篩選，部分幼苗出現枯黃死亡現象，移栽正常生長的綠色幼苗至新鮮營養土(珍珠巖∶蛭石∶有機質=1∶2∶2)中繼續培養至收獲T2代種子，經50 mg/mL抗性培養基進一步篩選，移栽能夠正常生長的綠色幼苗，白化苗拔除。經過每次均單株收獲種子的多代篩選，獲得T3代植株，培養后開展表型及分子鑒定。

M.DL2000; A. 1-5. 重組載體；B. 1. 重組載體雙酶切圖1 pCAMBIA3301-GbHCT13重組載體篩選及雙酶切驗證M. DL2000; A. 1-5. Recombinant vectors； B. 1. Recombinant vector with double enzyme cutFig.1 pCAMBIA3301-GbHCT13 recombinant vector screening and double enzyme verification

2.1.3 擬南芥分子檢測及表型觀察qRT-PCR檢測結果表明，轉基因植株中目的基因表達量較野生型極顯著增加。T3代植株生長至6～8片蓮座葉時期，摘取葉片進行DNA分子檢測表明，4株苗均檢測到抗除草劑bar基因的目的條帶(圖3，A)，與pCAMBIA3301空載體質粒DNA對照相比，條帶清晰且單一，表明重組載體轉入擬南芥中，初步獲得轉基因陽性植株(圖3，B)。轉基因植株同一時期整體的生長情況較野生型旺盛，株形與野生型不同，在同一生長時期的葉片數、抽薹數和莖稈表皮毛的數量(圖3，C-E)較野生型存在差異。

分別對轉GbHCT13基因和野生型擬南芥植株進行2次抽薹、葉片和莖稈表皮毛等的數量統計，發現6葉期轉基因植株的抽薹數和葉片數量較野生型增加，達到極顯著差異，而8葉期則無顯著差異；轉GbHCT13基因植株花期的莖稈表皮毛數量也極顯著高于對照(圖4)。

2.1.4 轉GbHCT13基因擬南芥植株切片觀察及相關基因表達檢測為了進一步觀察GbHCT13基因在擬南芥中過表達對植株生長變化的影響，選取轉基因待測植株的莖稈進行切片及染色分析，觀察其內部組織變化，發現轉基因植株較野生型莖稈初生木質部生長活躍，次生木質部導管細胞壁橫截面積變大，表明GbHCT13基因在擬南芥中過量表達使導管增粗，髓質細胞無明顯變化。

基因的表達對植株生長變化的調控作用往往是通過多種基因的協調配合而實現的，通過觀察GbHCT13的過表達對該基因代謝途徑上相關基因的影響，對擬南芥篩選出HCT基因合成與代謝通路上的5個相關基因，檢測發現CAD、CCoAOMT、CCR、PAL和4CL這5個關鍵基因較對照存在不同的表達趨勢(圖5)，過表達擬南芥植株CAD、CCoAOMT、PAL和4CL的表達量分別是對照的25.28倍、1.57倍、3.12倍和4.29倍，其中CAD表達量極顯著增加，而CCR表達量顯著下降，表明擬南芥中GbHCT13基因過量表達使木質素合成途徑基因發生不同程度改變，其中CAD、CCoAOMT、PAL和4CL與GbHCT13基因的表達呈正相關。

2.2 GbHCT13基因在棉花中功能驗證

2.2.1 轉GbHCT13基因植株田間篩選與鑒定轉基因T1代成鈴率為26.5%，GbHCT13轉基因T2代植株田間種植350株，篩選后存活43株，存活率為12.29%，單株收獲種子，采用檢測到的陽性植株開展后續鑒定工作。

2.2.2 轉GbHCT13基因棉株分子檢測分別對T1、T2代轉GbHCT13基因植株進行隨機采樣，帶回室內提取葉片DNA進行PCR分子檢測，樣品中均檢測到包含抗除草劑bar基因的475 bp目的帶，做好標記待收獲單株種子。T3植株經半定量檢測到明亮單一的目的條帶，認為初步獲得轉基因植株(圖6)。

2.2.3 轉GbHCT13基因T2代植株纖維表型分析隨機選取轉GbHCT13基因的T2代棉花纖維，進行3組重復，每組5個樣本，梳理發現，對照棉纖維長度均值2.58 cm，轉基因棉纖維長度均值2.60 cm，并無明顯增長(圖7)。

纖維5項指標測定結果表明，GbHCT13轉基因T2代棉花纖維長度較對照無明顯增加，這與前期手工梳絨結果一致，但伸長率顯著增加，說明測定的轉纖維樣品較非轉基因而言，纖維有增長趨勢；轉基因前后纖維整齊度均良好；馬克隆值顯著降低，在纖維品質分類上可由原來的C2級達到B2級；斷裂比強度增加，但未達到顯著差異(圖8)。

2.2.4GbHCT13基因沉默載體構建將GbHCT13與pTRV2載體連接后通過菌液PCR篩選陽性克隆(圖9)，檢測到預期大小相符的328 bp目的基因插入序列，對檢測含有目的片段的陽性菌液提取質粒，經EcoRⅠ與BamHⅠ雙酶切驗證(圖10)，酶切正確的質粒送測序，將測序結果與所選片段序列完全吻合的質粒命名為pTRV2-GbHCT13。

A.T2代幼苗；B.T3代幼苗篩選前；C.T3代幼苗篩選后；D.轉基因存活植株移栽圖2 噴施除草劑后轉基因擬南芥幼苗狀態A. T2 generation seedlings； B. T3 generation seedlings before screening； C. Screening of T3 generation seedlings；D. Transplanting viable transgenic plantsFig.2 Seedling status of transgenic Arabidopsis thaliana after herbicide spraying

A. T3代轉基因擬南芥DNA檢測：M. DL2000；1. 陰性對照(野生型擬南芥)；2. 陽性對照(pCAMBIA3301空載體)；3. 空白對照(水)；4-7. 轉基因擬南芥；B. 轉基因擬南芥中GbHCT13基因表達檢測：WT. 野生型col(對照)；1-4. 轉基因擬南芥；*和** 表示處理與對照之間顯著(P<0.05)和極顯著差異(P<0.01)，下同；C. 植株表型；D. 莖稈表皮毛；E. 抽薹前植株葉片；C-E圖中左為對照(野生型col)，右為轉基因擬南芥(T3)圖3 轉基因擬南芥T3代分子檢測及表型分析A. DNA detection of transgenic T3 generation Arabidopsis thaliana： M. DL2000; 1. Negative control (wild-type Arabidopsis thaliana); 2. Positive control (pCAMBIA3301 empty plasmid DNA); 3. Blank control (water); 4-7. Transgenic Arabidopsis thaliana; B. Detection of GbHCT13 gene expression in transgenic Arabidopsis thaliana; col. Wild-type(control); 1-4. Transgenic Arabidopsis; * and ** indicate significant (P<0.05) and extremely significant differences (P<0.01) between control and treatment, the same as below; C. Phenotypic observation of the whole plant; D. Observation of stem surface fur; E. Observation of plant leaves before mossing; C-E Control on the left is wild Arabidopsis thaliana, experimental group on the right is transgenic Arabidopsis in FigureFig.3 Molecular detection and phenotypic analysis of transgenic Arabidopsis thaliana T3 generation

A. 6葉期抽薹數；B. 6葉期葉片數；C. 8葉期抽薹數；D. 8葉期葉片數；E. 花期莖稈表皮毛數量圖4 轉GbHCT13基因擬南芥T3代植株生物學統計A. Number of bolting at 6 leaf stage; B. Number of leaf at 6 leaf stage; C. Number of bolting at 8 leaf stage; D. Number of leaf at 8 leaf stage; E. Number of fur at stem in flossomFig.4 Biological statistics of T3 generation transgenic Arabidopsis thaliana with GbHCT13 gene

A.對照(野生型col)；B. 轉基因擬南芥； pi. 髓；s-Xy. 次生木質部；p-Xy. 初生木質部；標尺=100 μm; C. 相關基因表達圖5 轉GbHCT13基因擬南芥T3代植株切片觀察A. Control (wild type col); B. Transgenic Arabidopsis thaliana; pi. Pith; s-Xy. Secondary Xylem; p-Xy. Primary Xylem; Bar=100 μm; C. Related gene expressionFig.5 Section observation of T3 generation Arabidopsis thaliana transgenic with GbHCT13 gene

2.2.5GbHCT13基因沉默效率檢測基因表達檢測表明，實驗組GbHCT13基因表達量較對照極顯著降低，‘新海21’中沉默效率分別為63.05%、72.92%和80.04%(圖11，A)，ND203中沉默效率分別為63.11%、4.08%和45.80%(圖11，E)。沉默組較陰性對照植株株高明顯降低，陽性對照白化苗的株高低于陰性對照，可能由于CLA基因沉默影響葉綠色合成從而造成植株矮化與培養條件無關(圖11，B、F)。由于‘新海21’植株表皮毛極不明顯(圖11，C、D)，對更具有代表性的ND203品種進行莖稈表皮毛觀察與統計(圖11，G、H)，表明GbHCT13基因沉默使ND203植株莖稈和葉柄表皮毛數量顯著減少(圖12)。

A、B. T1和T2代植株DNA檢測：M. DL2000；1. 陰性對照(水)；2. 陽性對照(pCAMBIA3301)；3-17. 轉基因棉花; C. T3代植株半定量檢測：1. 陰性對照(水)；2. 陽性對照(pCAMBIA3301)；3-5. 轉基因棉花圖6 轉GbHCT13基因棉花后代PCR檢測A, B. DNA detection of T1 and T2 generation plants; M. DL2000; 1. Negative control (water); 2. Positive control (pCAMBIA3301); 3-17. Transgenic cotton; C. Semi-quantitative detection of T3 generation plants: 1. Negative control (water); 2. Positive control (pCAMBIA3301); 3-5. Transgenic cottonFig.6 PCR detection of transgenic cotton with GbHCT13 gene

A. 非轉基因棉纖維；B. 轉基因T2代棉纖維；C. 棉纖維長度比較：對照. 非轉基因棉花；處理. 轉基因棉花；下同圖7 轉GbHCT13基因棉花T2代纖維觀察A. Non-genetically modified cotton fibers; B. Transgenic T2 cotton fiber; C. Cotton fiber length compared： Control. Non-transgenic cotton; Treatment. Transgenic cotton； The same as belowFig.7 Observation of GbHCT13 transgenic T2 cotton fiber

A. 纖維上半部平均長度；B. 纖維整齊度；C. 馬克隆值；D. 纖維斷裂比強度；E. 纖維伸長率圖8 轉GbHCT13基因棉花T2代纖維指標測定A. Average length of the upper half of the fiber; B. Fiber uniformity; C. Incompatible micronaire; D. Fiber breaking strength; E. Elongation of fiberFig.8 Determination of fiber index of GbHCT13 transgenic T2 cotton

M. DL2000； 1-10為檢測菌液樣品圖9 VIGS-GbHCT13菌液PCR檢測M. DL2000; 1-10 For detecting the sample of the fungusFig.9 PCR detection of VIGS-GbHCT13 bacterial fluid

M1. DL15000；M2. DL2000；1. pTRV2載體大片段9 335 bp，VIGS-GbHCT13片段328 bp圖10 VIGS-GbHCT13重組載體雙酶切驗證M1. DL15000; M2. DL2000; 1. The pTRV2 vector is a large segment of 9 335 bp; VIGS-GbHCT13 segment of 328 bpFig.10 Determination of VIGS-GbHCT13 plasmid by double enzyme digestion

2.2.6 棉花莖稈組織切片分析為了進一步了解GbHCT13基因沉默對棉花植株內部組織結構的影響，對兩品種的棉花莖稈進行切片處理(圖13，A、B、D、E)，對照中木質部被染成紅色細胞數量是沉默植株的2.78倍，細胞壁染色厚度是沉默植株的1.56倍，差異極顯著，此外沉默植株中木質部管狀分子的排布不規則，導管細胞形狀發生明顯改變，整個木質部減小(圖13，B、E)。

A 和E.對照. 非轉基因棉花；1-3. 基因沉默棉花；A-D. ‘新海21’基因表達、植株表型、莖稈和葉柄；E-H. ND203基因表達、植株表型、莖稈和葉柄；C、D、G、H中左為對照，右為基因沉默棉花圖11 基因沉默效率檢測及2周后植株生長表型觀察與統計A and E. Control. Non-transgenic cotton; 1-3. Gene silenced cotton; A-D. Gene expression of XH21; Plant growth performance; Stem and Petiole of XH21; E-H. Gene expression of ND203; Plant growth performance; Stem and Petiole of ND203; C, D, G and H. The left is the control; The right is the gene silenced cottonFig.11 Detection and statistics of GbHCT13 gene silencing efficiency and observation of plant growth phenotype after two weeks

對照. 非轉基因棉花；1-3. 基因沉默棉花圖12 GbHCT13基因沉默ND203植株表皮毛數量統計Control. Non-transgenic cotton; 1-3. Gene silenced cottonFig.12 GbHCT13 gene silencing ND203 plant surface fur number statistics

ND203植株切片結果顯示，對照植株中木質部導管細胞排列規則整齊，被染色細胞數量及細胞壁厚度分別是沉默植株的4.29倍和1.71倍，差異極顯著，沉默GbHCT13基因之后植株的木質部染色面積減少，導管變細，排列較對照不規則(圖13，E)。

木質素測定結果表明，沉默GbHCT13基因的植株中木質素含量較對照極顯著降低(圖14，A)。檢測了GbHCT13沉默植株中HCT基因通路相關基因的表達量變化發現‘新海21’和ND203兩品種中CAD、CCoAOMT、CCR、PAL和4CL這5個關鍵基因均表現出相同的趨勢，除4CL基因表達量極顯著增加以外，其他4基因的表達呈現降低的趨勢(圖14，B、C)。GbHCT13基因沉默引起‘新海21’中4CL基因表達量增加到對照的10.29倍，兩基因的表達呈現極顯著負相關。

對照. 非轉基因棉花；處理. 基因沉默棉花；A-D. ‘新海21’對照、處理、染色細胞數量和細胞壁厚度；E-H. ND203對照、處理、染色細胞數量和細胞壁厚度；ca. 形成層；pi. 髓；te. 管狀分子；s-Xy. 次生木質部；p-Xy. 初生木質部；標尺=50 μm圖13 GbHCT13基因沉默對木質素影響的組織化學分析Control. Non-transgenic cotton; Treatment. Gene silenced cotton; A-D. Control and treatment plant of Xinhai 21; Statistics on the number of cells and cell wall thickness of Xinhai 21; E-H. ND203 control and treatment plant; Number of ND203 staining cells and cell wall thickness; ca. Cambium; pi. Pith; te: Tracheary element; s-Xy. Secondary Xylem; p-Xy. Primary Xylem; Bar=50 μmFig.13 Histochemical analysis of the effect of GbHCT13 gene silencing on lignin in cotton

A.木質素含量變化； B. 新海21；C. ND203；對照. 非轉基因棉花；處理. 基因沉默棉花圖14 棉花GbHCT13基因沉默植株的木質素含量變化及其代謝通路相關基因表達A. Change of lignin content; B. Xinhai 21; C. ND203; Control. Non-transgenic cotton; Treatment. Gene silenced cottonFig.14 Expression of GbHCT13 pathway related gene and the changes of lignin content

3 討 論

有研究表明棉花纖維發育中有苯丙烷類物質-木質素的合成，HCT基因在木質素合成中扮演關鍵作用。本研究對前期克隆的GbHCT13(GenBank 登錄號：MW048849)進行基因功能驗證，結果顯示，該基因在擬南芥中異位表達使其表型發生改變，轉基因擬南芥中GbHCT13基因表達量較野生型明顯增加，植株生長旺盛，能夠顯著增加擬南芥抽薹數和蓮座葉片數量，使其莖稈初生木質部細胞發生改變。棉花中過表達GbHCT13基因使纖維伸長率增加，比強度增加，馬克隆值降低，表明纖維品質有所提升。棉花中沉默GbHCT13基因使植株莖稈表皮毛數量減少，而植物表皮毛的形成受到苯丙烷途徑物質合成的影響[17]，暗示GbHCT13基因抑制了苯丙烷代謝；木質素含量減低，初生木質部生長受到抑制，導管數量減少，細胞壁染色厚度降低，通路上關鍵基因表達量出現不同表達變化，而植株株高未發生明顯矮化現象。鑒于HCT位于苯丙烷代謝通路的上游位置，它的抑制可能不僅影響木質素，而且影響其他代謝物，通過與該途徑上其他基因的協調配合實現纖維品質改變。由此可以推測HCT基因主要參與棉花纖維細胞次生壁的合成，并且能調控棉纖維中的木質素含量。本實驗中擬南芥植株木質素含量不便測定，后續有待選用合適的方法測定其含量。木質素由苯丙烷途徑產生，其上游調控主要涉及3種酶：PAL，C4H[18]和4CL[19]，它們表達活性的高低與木質素的總量密切相關[20]。在煙草中抑制PAL和C4H的表達均會不同程度降低木質素的含量，反義抑制PAL活性使木質素的含量下降并伴隨S/G比值升高，嚴重影響植物的生長發育[21]；抑制煙草中C4H的活性則發現S/G比值降低，但未對植物生長造成不良影響[22]。這種現象表明C4H可能參與S/G木質素單體的合成調控。Hu等通過反義RNA技術抑制黑楊4CL基因表達，90%以上的轉基因株系中木質素含量下降達45%，且伴隨纖維素含量增加了15%[23]；楊雪萍等將4CL1基因反義轉入到煙草中，發現植株的纖維素含量比對照提高了11.4%，而木質素含量比對照降低了19.1%[24]，證明4CL可能是木質素合成中的限速酶之一，并且植物體內木質素和纖維素的合成具有一定的內在聯系。植物本身的自我調節機制使其在改變某單一性狀時對其他性狀也產生影響。木質素合成的苯丙烷途徑中包含HCT在內的多種關鍵酶基因的表達差異對木質素合成存在影響，通過調控相關基因活性的改變來分析木質部微觀結構變化具有可行性。位于木質素合成途徑中的關鍵基因通過互相調節實現木質素的合成，其中PAL和4CL位于木質素合成上游，決定碳元素流向，CAD、CCoAOMT、CCR則通過對木質素單體含量的改變來影響其總含量。本研究分析GbHCT13沉默植株中木質素合成相關基因表達變化，4CL基因表達量極顯著增加，CAD、CCoAOMT、CCR降低，表明GbHCT13的沉默引起4CL補償性增加，而植株中木質素含量降低則是由于CAD、CCoAOMT、CCR引起的單體含量減少，這對于通過代謝手段探究GbHCT13功能提供理論基礎。

本研究表明，GbHCT13基因主要參與纖維發育伸長期，可能在胚珠纖維起始期促進棉纖維的生長，其他時期幾乎不表達。棉花中沉默GbHCT13基因結果表明，抑制GbHCT13使棉花生長代謝受阻，影響纖維發育起始。GbHCT13基因能增加棉纖維伸長率，增加纖維強度，進而改善棉纖維品質。通過對GbHCT13基因表達的調控，可實現在不影響棉花植株正常營養和生殖生長的情況下，改善纖維品質。本實驗為后續利用海島棉優良基因改善陸地棉纖維品質提供實驗基礎和理論支持。