百合LbCAT和LbGPX基因的克隆與表達(dá)分析

遲博文，劉 立，謝 天，閻俊卉，趙子賢，文錦芬

(昆明理工大學(xué) 建筑與城市規(guī)劃學(xué)院，昆明 650500)

過(guò)氧化氫酶 (catalases，CAT) 是一種含有亞鐵血紅素的四聚體催化酶，作為抗氧化酶系統(tǒng)中重要的一員，在過(guò)氧化物酶體中將H2O2分解成H2O和O2[1]。CAT在植物逆境、衰老以及生長(zhǎng)發(fā)育等過(guò)程中起著關(guān)鍵作用[2]。研究表明擬南芥中AtCAT1參與消除各種脅迫產(chǎn)生的 H2O2[3]。在桃樹(shù)葉片也觀察到中度干旱脅迫誘導(dǎo)CAT、SOD和GR等抗氧化酶活性呈上升趨勢(shì)[4]。不僅干旱、高鹽、重金屬等非生物脅迫都可以影響CAT基因的表達(dá)[5-7]，而且過(guò)表達(dá)該基因可以提高植物抗性[8-9]。

在植物抗氧化酶系統(tǒng)中另一個(gè)重要的成員是谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase，GPX)[10]，屬于非血紅素硫醇過(guò)氧化物酶，通過(guò)催化還原型谷胱甘肽(GSH)轉(zhuǎn)化為氧化型谷胱甘肽(GSSG)，使H2O2分解進(jìn)而保護(hù)植物[11]。擬南芥中有8個(gè)GPX基因，對(duì)不同的非生物性脅迫均有應(yīng)答[12]。在番茄中表達(dá)LePHGPX基因明顯增強(qiáng)了其對(duì)鹽、高溫等非生物脅迫的耐受性[13]。

百合(Liliumbrowniivar.viridulum)為百合科(Liliaceae)百合屬(Lilium)多年生單子葉草本球根類(lèi)植物，主要分布在北半球的溫帶與寒帶地區(qū)[14]。百合不僅有很好的觀賞性，還能作為食材、藥材，具有極好的市場(chǎng)前景。中國(guó)百合切花種植面積約為933.33 hm2，主要集中在云南，每年增幅在20%以上，昆明是中國(guó)百合切花種植面積最大且質(zhì)量最好的產(chǎn)地之一[15-16]。但切花百合在采后及隨后的長(zhǎng)距離干運(yùn)輸中均會(huì)受到失水脅迫，從而可能導(dǎo)致花的畸形及早衰；因此，對(duì)于百合抗性基因資源的深入研究，并且從分子生物技術(shù)層面增強(qiáng)其抗逆性具有極重要的意義。本研究從百合中分別克隆了1個(gè)CAT基因和1個(gè)GPX基因，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并對(duì)這2個(gè)基因在百合的不同器官、花蕾不同發(fā)育時(shí)期、PEG模擬干旱處理及獨(dú)角金內(nèi)酯(SLs)處理下的表達(dá)進(jìn)行了分析，為進(jìn)一步研究百合中這2個(gè)基因的作用機(jī)制提供理論基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料和材料處理

實(shí)驗(yàn)材料為‘卡瓦納’紅色香水切花百合。在研究百合花蕾生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中基因的表達(dá)情況時(shí)，將百合花蕾劃分為5個(gè)階段取材。現(xiàn)蕾期：植株剛開(kāi)始出現(xiàn)花蕾；綠蕾期：植株開(kāi)始出現(xiàn)大部分花蕾，并且整個(gè)花蕾呈現(xiàn)為綠色；紅蕾期：植株的所有花蕾都會(huì)變成紅色，花蕾蓬松、不緊實(shí)，花瓣剛剛開(kāi)始彼此分離但尚未完全開(kāi)放；開(kāi)花期：植株的花瓣都已經(jīng)完全開(kāi)放，花瓣顏色最鮮艷，具有典型的百合花冠花瓣形狀和顏色特點(diǎn)；枯萎期：植株部分花瓣開(kāi)始枯萎。

(1)取盆花百合的不同器官(根、鱗莖、葉和花)和不同發(fā)育期花蕾(其中包括綠蕾期、紅蕾期、開(kāi)花期和枯萎期)的花瓣，取材后立即置于液氮中，然后保存在-80 ℃的超低溫冰箱中備用。

(2)實(shí)驗(yàn)挑選花莖長(zhǎng)而挺直，處于開(kāi)花期、花蕾直徑約8～9 cm的百合切花，分別置于蒸餾水(CK)、10%PEG-6000培養(yǎng)液(PEG)和5 μmol/L SLs+10% PEG-6000培養(yǎng)液(PEG+SLs)中處理。分別在0 d、1 d、3 d、5 d收集花瓣樣品，立即液氮速凍并于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 方 法

1.2.1 RNA提取和cDNA第一鏈合成百合RNA使用trizol法提取[17]，cDNA鏈合成用賽默飛世爾公司(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)試劑盒，參照說(shuō)明書(shū)的步驟進(jìn)行。

1.2.2 基因克隆根據(jù)前期轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果和在NCBI上的同源比對(duì)，用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物序列，引物序列見(jiàn)表1。PCR擴(kuò)增用大連寶生物公司Taq酶(TaKaRa TaqTM)。PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性5 min，94 ℃變性30 s，退火30 s(退火溫度分別為55和53 ℃)，72 ℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將PCR產(chǎn)物送生物公司測(cè)序。

表1 基因克隆和qRT-PCR的引物序列

1.2.3 序列分析用NCBI網(wǎng)站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov)中的ORF Finder(https://blast.ncbi.nlm. nih.gov/orffinder)找出基因的開(kāi)放式閱讀框架(Open reading frame；ORF)和用NCBI網(wǎng)站(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/)的Blastp功能，對(duì)序列進(jìn)行同源性和保守結(jié)構(gòu)域分析。用生物學(xué)軟件DNAMAN7.0 以及ClustalX2.0.11對(duì)核酸進(jìn)行翻譯和多序列比對(duì)。用MEGA7.0軟件的Neighbor-joining(NJ)計(jì)算方法，進(jìn)行進(jìn)化樹(shù)的系統(tǒng)構(gòu)建與應(yīng)用分析。

1.2.4 qRT-PCR分析根據(jù)克隆結(jié)果設(shè)計(jì)引物，內(nèi)參基因?yàn)長(zhǎng)baction，引物序列見(jiàn)表1。實(shí)時(shí)熒光定量PCR使用愛(ài)必夢(mèng)生物科技有限公司的qRT-PCR熒光定量試劑盒(EvaGreen 2X qPCR MasterMix)。反應(yīng)體系為：10 μL EvaGreen 2× qPCR MasterMix，0.6 μLLbCAT(LbGPX)-qF與0.6 μLLbCAT(LbGPX)-qR，2 μL cDNA模板，加6.8 μL dd H2O至20 μL體系。qRT-PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性 10 min，95 ℃變性15 s，退火 60 s(退火溫度分別為59和60 ℃)，60 ℃延伸 60 s，40個(gè)循環(huán)。在Bio-Rad CFX96 Optics Module系統(tǒng)上進(jìn)行反應(yīng)。每個(gè)材料進(jìn)行3次或多次獨(dú)立重復(fù)。利用2-ΔΔCT算法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量，用SPSS進(jìn)行顯著性分析和 SigmaPlot12.5軟件作圖。

M. DL2000；1. LbCAT；2. LbGPX圖1 百合LbCAT和LbGPX基因PCR產(chǎn)物電泳圖Fig.1 The electrophoretic map of PCR products of LbCAT and LbGPX in lily

2 結(jié)果與分析

2.1 百合LbCAT和LbGPX基因克隆

以百合cDNA為模板，用RT-PCR方法對(duì)LbCAT和LbGPX進(jìn)行特異性引物擴(kuò)增，分別得到大約1 500和 500 bp的產(chǎn)物(圖1)。利用軟件ORF finder進(jìn)行分析LbCAT和LbGPX基因編碼的氨基酸序列，其完整的ORF分別為1 479和519 bp，編碼的蛋白大小分別為492和172個(gè)氨基酸(圖2)。

圖2 LbCAT(A)和LbGPX(B)全長(zhǎng)序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列Fig.2 Nucleotides and deduced amino acid sequences of LbCAT (A) and LbGPX (B)

2.2 同源和進(jìn)化分析

通過(guò)NCBI Blast序列比對(duì)后發(fā)現(xiàn)，LbCAT與岷江百合(Liliumregale)ART33464.1序列相似性最高，為99.19%，與大部分植物序列相似性為77%～99%(圖3，A)。LbGPX與油棕(Elaeisguineensis)XP_010938757.1序列相似性最高，為78.61%，與大部分植物序列相似性為67%～78%(圖3，B)。LbGPX和LbCAT基因與不同種類(lèi)植物序列相似性較高說(shuō)明這2個(gè)基因在進(jìn)化中保守度較高。

用MEGA7.0軟件對(duì)LbCAT和LbGPX氨基酸序列和其他植物的CAT和GPX進(jìn)行分析，兩種基因都具有顯著的種屬特征，進(jìn)化符合植物分類(lèi)學(xué)分類(lèi)(圖4)。整個(gè)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)存在兩個(gè)大分支，其中LbCAT與同科植物的親緣關(guān)系最近，其次是鐵皮石斛和小蘭嶼蝴蝶蘭等其他科植物相對(duì)較近，與大麥和紫花針茅等的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)(圖4，A)。而對(duì)LbGPX分析結(jié)果顯示，整個(gè)系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹(shù)存在兩個(gè)分支，LbGPX與油棕親緣關(guān)系最近，與紅梅和水蜜桃等種屬關(guān)系最遠(yuǎn)(圖4，B)。

A：XP_020092953. 菠蘿；XP_020702876. 石斛蘭；ART33464. 百合；XP_008791900. 海棗；NP_001306842. 油棕；B：XP_010938757. 油棕；XP_010524011. 醉蝶花；XP_020108868. 菠蘿；XP_020267646. 蘆筍；XP_020685583. 鏈狀石斛圖3 LbCAT(A)和LbGPX(B)分別與不同物種CAT和GPX蛋白氨基酸序列比對(duì)A： XP_020092953. Ananas comosus; XP_020702876. Dendrobium catenatum; ART33464. Lilium regale; XP_008791900. Phoenix dactylifera; NP_001306842. Elaeis guineensis; B： XP_010938757. Elaeis guineensis; XP_010524011. Tarenaya hassleriana; XP_020108868. Ananas comosus; XP_020267646. Asparagus officinalis; XP_020685583. Dendrobium catenatumFig.3 Multiple alignment of LbCAT (A) and LbGPX (B) with those of other species

圖4 LbCAT(A)和LbGPX(B)蛋白系統(tǒng)進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of LbCAT (A) and LbGPX (B)

2.3 LbCAT和 LbGPX表達(dá)分析

2.3.1LbCAT和LbGPX器官和花蕾不同時(shí)期的表達(dá)分析以Lbactin作為內(nèi)參，對(duì)LbCAT和LbGPX在百合不同器官和花蕾不同發(fā)育階段的表達(dá)情況進(jìn)行qRT-PCR分析。結(jié)果表明，LbCAT基因在根、鱗莖、葉和花中都有表達(dá)，其中在葉片中的表達(dá)最高，根次之。LbGPX在百合的各器官中也均有表達(dá)，其中在花中的表達(dá)量最高，為鱗莖中表達(dá)量的40倍左右(P<0.01)(圖5, A)。

* 、**分別表示同一基因在不同器官相對(duì)鱗莖(同一基因在不同花蕾發(fā)育階段相對(duì)綠蕾期)的表達(dá)差異顯著或極顯著圖5 百合不同組織(A)和花蕾不同發(fā)育階段(B)中LbCAT和LbGPX的表達(dá)* and ** stand for the same gene’s expression level in different organ is significantly different relative to the bulb’s (the same gene’s expression level at different bud development stage) at 0.05 and 0.01 levelFig.5 Expression levels of LbCAT and LbGPX in different organs (A) and different bud development stages (B) of Lily

* 、**分別表示同一時(shí)期不同處理與對(duì)照差異顯著或極顯著圖6 LbCAT (A)和LbGPX (B)在不同處理下的表達(dá)* and ** stand for the gene’s expression level in different treatments is significantly different relative to the control’s on the same time at 0.05 and 0.01 levelFig.6 Expression levels of LbCAT (A) and LbGPX (B) under different treatments

在花蕾的不同生長(zhǎng)發(fā)育階段(圖5, B)，LbCAT和LbGPX都有表達(dá)，其中LbCAT在枯萎期表達(dá)量最高，約為綠蕾期表達(dá)量的8倍左右，差異極顯著(P<0.01)。LbGPX的表達(dá)水平則隨著花蕾的發(fā)育，總體呈現(xiàn)增長(zhǎng)的趨勢(shì)(圖5,B)。

2.3.2 SLs對(duì)PEG處理下百合切花LbCAT和LbGPX表達(dá)的影響LbCAT和LbGPX基因在不同處理下的表達(dá)情況如圖6所示。LbCAT表達(dá)在第1天最高。PEG處理下LbCAT基因的表達(dá)量第1天約為CK的5倍；但SLs+PEG處理的表達(dá)量卻顯著低于PEG處理組，表明SLs處理降低了LbCAT的轉(zhuǎn)錄水平(圖6，A)。

不同處理下，LbGPX表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢(shì)。在PEG處理下，LbGPX的表達(dá)量在第3天達(dá)到了峰值，約為CK組的4倍；在PEG+ SLs處理下LbGPX的表達(dá)量低于PEG處理(圖6，B)。

3 討 論

本研究通過(guò)RT-PCR從百合中分別克隆了LbCAT和LbGPX基因，氨基酸序列比對(duì)結(jié)果表明兩種基因在進(jìn)化中高度保守。qRT-PCR定量分析結(jié)果說(shuō)明，LbCAT和LbGPX在百合不同器官中表達(dá)都有特異性，其中分別以在葉片和花中的表達(dá)量最高；而在花蕾的不同發(fā)育階段，兩個(gè)基因表達(dá)量均隨花蕾的發(fā)育而增加。在橡膠中的研究結(jié)果表明HbCAT2隨著橡膠樹(shù)的發(fā)育其表達(dá)量逐漸升高[18]，而在香蕉的研究中發(fā)現(xiàn)MaGPX在其花中的表達(dá)情況與LbGPX一致[19]；這種抗氧化酶基因的器官表達(dá)差異,可能與不同的器官中活性氧分布的差異有關(guān)聯(lián)[20-22]。

進(jìn)一步用PEG模擬干旱處理百合切花發(fā)現(xiàn)，LbCAT和LbGPX的表達(dá)在經(jīng)過(guò)PEG處理后表現(xiàn)出明顯的上調(diào)。有研究發(fā)現(xiàn)水稻葉片組織中的OsCATB基因轉(zhuǎn)錄水平能夠在受到嚴(yán)重干旱脅迫時(shí)升高[23]；而在對(duì)木薯的研究中也觀察到4個(gè)木薯栽培種中有3個(gè)在干旱誘導(dǎo)下，CAT轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)[24]。

此外，在香蕉、野生近緣種小麥和桑樹(shù)中也發(fā)現(xiàn)GPX基因在干旱脅迫下表達(dá)上調(diào)[20，25-26]。因此，干旱脅迫誘導(dǎo)CAT和GPX表達(dá)上調(diào)似乎是植物的普遍反應(yīng)。

已有文獻(xiàn)報(bào)道表明，SLs能有效提高植物的抗逆性，如SLs能增強(qiáng)鼠尾草中抗鹽脅迫的能力[26]，提高羽扇豆幼苗在熱脅迫下抗氧化系統(tǒng)和乙二醛酶系統(tǒng)的活性而減輕對(duì)種子萌發(fā)和光系統(tǒng)Ⅱ功能的不利影響[27]；但本研究發(fā)現(xiàn)，在轉(zhuǎn)錄水平SLs并不能提高LbCAT和LbGPX的表達(dá)，這與Parisa Sharifi等在鼠尾草中發(fā)現(xiàn)SLs不能提高抗氧化酶活性似乎是一致的[26]。導(dǎo)致這些結(jié)果的差異一方面可能是因?yàn)槲锓N的不同，另一方面在逆境脅迫下SLs可能在不同的水平調(diào)控植物的抗逆性。

本研究結(jié)果表明，LbCAT和LbGPX基因在百合中參與了對(duì)百合不同器官和花蕾生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控，以及對(duì)水分脅迫的應(yīng)答。后續(xù)對(duì)這2個(gè)基因的研究主要是通過(guò)基因的過(guò)表達(dá)和沉默進(jìn)行功能驗(yàn)證，以及克隆啟動(dòng)子及短截實(shí)驗(yàn)研究它們的調(diào)控位點(diǎn)。百合花蕾是百合全株最具觀賞價(jià)值的部位，目前關(guān)于調(diào)控百合抗逆機(jī)制的研究較少，本研究為更有效了解百合的抗逆機(jī)制和進(jìn)一步改善百合鮮切花瓶插壽命和培育抗性品種提供了理論基礎(chǔ)。