斑地錦黃烷酮-3-羥化酶基因及啟動子的克隆與分析

鐘小菊，吳晴陽，張永康，饒澤昌，王 飛，黃勝和*

(1 江西中醫藥高等專科學校 醫學基礎部，江西撫州 344000；2 南昌大學 撫州醫學院，江西撫州 344000)

斑地錦(EuphorbiamaculataL.)是一年生大戟科(Euphorbiaceae)大戟屬(EuphorbiaL.)草本植物，分布于江西、新疆、河南和浙江等地區[1]，具有清熱解毒、利濕退黃、涼血止血等功效，主治痢疾、泄瀉、尿血、便血、瘡癤癰腫、濕熱黃疸等[2]。斑地錦主要含有黃酮類、萜類、酚酸類和生物堿類等成分，其中槲皮素是主要藥效成分之一[3]。目前，斑地錦研究主要集中在成分分離、藥用價值以及臨床應用等方面[4-5]，分子生物學相關研究報道較少。

槲皮素屬于黃酮類化合物，其生物合成經由苯丙烷代謝途徑，而黃烷酮-3-羥化酶(flavanone 3-hydroxylase，F3H)是苯丙烷代謝途徑的關鍵酶之一，催化柚皮素(naringenin)生成二氫山奈酚(dihydrokaempfero，DHK)。DHK是合成黃酮醇和花青素的重要中間物質，阻斷F3H基因的表達，可導致擬南芥植株體內黃酮及花色素等含量變低[6]。目前，F3H基因已在金魚草(AntirrhinummajusL.)[7]、丹參(Salviamiltiorrhiza)[8]和白芨(Bletillastriata)[9]等多種植物[10]中被克隆，但斑地錦F3H基因克隆還未見報道。該實驗根據已知的植物F3H基因進行序列比對，在高度保守區設計簡并引物，PCR法結合RACE技術、熱不對稱PCR(Tail-PCR)[11]克隆斑地錦F3H基因及其啟動子，利用qRT-PCR技術檢測在苗期、花期和果期不同組織中的表達情況，為進一步研究斑地錦F3H基因表達調控和完善斑地錦槲皮素生物合成途徑提供便利條件。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

實驗植株采集于江西中醫藥高等專科學校實驗田，經江西中醫藥高等專科學校藥學系中藥教研室鑒定為斑地錦(EuphorbiamaculataL.)。分別采集苗期(未開花)、花期(開3朵以上的花且未結果)和果期(結3個以上的果)等的根、莖、葉以及果期的果實，樣品采集后立即置-80 ℃冰箱備用。

1.2 主要試劑與儀器

植物總RNA提取試劑盒(Spin Column Plant Total RNA Purification Kit)、基因組DNA抽提試劑盒(Spin Column Plant Genomic DNA Purification Kit)、質粒DNA小量抽提試劑盒(SanPrep柱式)、膠回收試劑盒(SanPrep Column DNA Gel Extraction Kit)、引物合成、測序等，生工生物工程(上海)股份有限公司；反轉錄試劑盒(PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser)、熒光定量PCR試劑盒(PrimeScript RT Master Mix)等，寶日醫生物技術(北京)有限公司；Pfu酶(TransStart FastPfu DNA Polymerase)、Taq酶、Marker(Trans2K?Plus Ⅱ DNA Marker)、T-載體(pEASY-Blunt Simple Cloning Kit)等，北京全式金生物技術有限公司。該實驗所用引物見表1。

表1 實驗所使用的引物

普通PCR儀(S1000TMThermal Cycler)、熒光定量PCR儀(CFX96 Real-Time)等，美國Bio-Rad公司；超微量分光光度計(NanoDrop One)，美國Thermo Scientific公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 總RNA提取、cDNA合成和DNA的提取斑地錦總RNA提取、DNA提取和cDNA合成均按試劑盒說明書進行。總RNA提取后經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量，超微量分光光度計測定RNA濃度。

1.3.2F3H基因片段的獲得在GenBank中查找麻風樹(JatrophacurcasL.)、非洲菊(GerberajamesoniiBolus)和烏桕(Triadicasebifera)等植物的F3H基因序列，比對找出高度保守區，Primer Premier5.0軟件設計簡并引物F3H-ZF和F3H-ZR，以引物FZL-1對總RNA反轉錄得到的cDNA為模板，PCR擴增斑地錦F3H基因保守序列。反應體系(25 μL)：5×GC緩沖液5 μL，dNTPs 2 μL，F3H-ZF、F3H-ZR各2 μL，cDNA模板2 μL，Pfu酶0.3 μL，滅菌超純水11.7 μL。反應程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 40 s，35個循環；72 ℃ 5 min。PCR產物電泳后膠回收試劑盒回收，連T-載體，轉化大腸桿菌DH5α感受態，菌液PCR篩選陽性后送測序。

1.3.3F3H基因ORF區的獲得根據保守序列測序結果設計正向特異引物F3H-XF，根據反轉錄引物FZL-1設計反向引物F3H-3R，進行3′-RACE。反應體系(25 μL)：5×GC緩沖液5 μL，dNTPs 2 μL，F3H-XF、F3H-3R各1 μL，cDNA模板1 μL，Pfu酶0.3 μL，滅菌超純水14.7 μL。反應程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環；72 ℃ 5 min。PCR產物電泳后膠回收測序。

根據保守序列測序結果設計特異引物F3H-

SR1、F3H-SR2、F3H-SR3，與隨機引物ADF1/ADF2/ADF3/ADF4，以及引物ADF0進行Tail-PCR擴增F3H基因5′端。Tail-PCR第一輪PCR，反應體系(25 μL)：10×緩沖液2.5 μL，dNTPs 2 μL，ADF1(/ADF2/ADF3/ADF4)2 μL，F3H-SR1 1 μL，基因組DNA模板1 μL，Taq酶0.3 μL，滅菌超純水16.2 μL。第二輪PCR反應體系(25 μL)：10×緩沖液2.5 μL，dNTPs 2 μL，ADF0、F3H-SR2各1 μL，稀釋100倍的第一輪PCR產物1 μL，Taq酶0.3 μL，滅菌超純水17.2 μL。第三輪PCR反應體系(25 μL)：10×緩沖液2.5 μL，dNTPs 2 μL，ADF0、F3H-SR3各1 μL，稀釋100倍的第二輪PCR產物1 μL，Taq酶0.3 μL，滅菌超純水17.2 μL。Tail-PCR反應程序見文獻[11]。根據第二輪和第三輪PCR產物電泳結果選擇長度合適的條帶進行膠回收測序。

將所獲得的F3H保守序列、5′端序列和3′端序列用DNAstar軟件拼接，結合GenBank中的blast結果，獲得ORF區序列，設計特異引物F3H-CF、F3H-CR，用Pfu酶進行PCR擴增并送測序。

1.3.4 生物信息學分析F3H蛋白的理化性質預測采用ExPASy Proteomics Server提供的在線工具Protparam (https://web.expasy.org/protparam/)，NCBI的 conserved domain database(https://www.ncbi.nlm.nih. gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)預測蛋白保守結構域。TMHMM 2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM)進行跨膜結構域預測，Phyre2 (http://www.sbg.bio.ic.ac.uk/phyre2/html/page.cgi?id=index)進行結構域三維建模[12]，NCBI中的Distance tree of results(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)進行系統進化樹分析。

1.3.5F3H基因不同生長期組織表達差異分析根據F3H基因ORF區序列設計熒光定量PCR引物F3H-qF、F3H-qR，分別提取斑地錦苗期、花期和果期的根、莖、葉以及果實的總RNA，經瓊脂糖凝膠電泳和超微量分光光度計檢測后，反轉錄試劑盒合成cDNA，以UBQ為內參基因[13]，進行熒光定量PCR擴增。反應體系(20 μL)：2×TB Green Premix Ex Taq(TliRNaseH Plus)10 μL，上下游引物各0.4 μL，cDNA模板2 μL，滅菌水7.2 μL；擴增條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環；每個反應體系重復3次。利用Excel分析處理實驗結果。

1.3.6F3H基因啟動子序列的獲得與分析根據5′端序列設計特異引物F3H-SR4、F3H-SR5、F3H-SR6，以基因組DNA為模板，采用Tail-PCR進行染色體步移，擴增EmF3H基因的啟動子，反應體系和反應程序與1.3.3相同。根據Tail-PCR產物測序結果設計特異引物F3H-PF、F3H-PR，用Pfu酶進行PCR擴增并送測序。序列分別用Plantcare(http://bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)和PLACE(https://www.dna.affrc.go.jp/PLACE/?action=newplace)分析序列特征。

2 結果與分析

2.1 斑地錦F3H基因的克隆

試劑盒提取斑地錦總RNA，瓊脂糖凝膠電泳檢測質量良好(圖1)。由圖1可知，同源克隆法設計簡并引物F3H-ZF和F3H-ZR，PCR獲得預期510 bp左右的斑地錦F3H基因保守序列，3′-RACE法得到約530 bp的3′端序列；Tail-PCR進行染色體步移，第三輪產物比第二輪產物小120 bp左右，將第三輪產物測序獲得保守序列上游約2 000 bp，其中包含基因5′端序列；將保守序列、3′端序列、5′端序列用DNASTAR軟件進行組裝，根據組裝結果設計特異引物F3H-CF和F3H-CR擴增ORF區。測序結果顯示，斑地錦F3H基因ORF區包含1 092 bp，編碼364個氨基酸，其中氨基酸序列與油桐(Verniciafordii)、烏桕(Triadicasebifera)的序列相似性高達85.5%、85.4%。將此基因命名為EmF3H， GenBank登錄號為MW767838。

M. Trans2K? Plus Ⅱ；1.總RNA；2.保守序列；3.3′-RACE；4-5.5′-Tail第二、三輪產物；6.ORF 圖1 EmF3H基因的克隆M. Trans2K? Plus Ⅱ; 1. Total RNA; 2. Conserved sequence; 3. 3′-RACE; 4-5. The second and third round products of 5′-Tail-PCR; 6. ORFFig.1 Cloning of EmF3H

2.2 EmF3H的生物信息學分析

用在線工具Protparam分析斑地錦F3H蛋白的理化性質，等電點(pI)為5.47，相對分子質量為40.93 KDa，不穩定系數47.89，脂肪指數為86.54，平均親水性為-0.371，表明EmF3H為相對穩定的疏水性蛋白。保守結構域預測顯示該蛋白屬于2-酮戊二酸鐵依賴的雙加氧酶(2-oxoglutarate/iron-dependent dioxygenase，2-ODD)超家族，與其他植物F3H的保守結構域相似。TMHMM 2.0預測EmF3H不含跨膜區域。Phyre三維建模結果見圖2，以克拉維胺合成酶(Clavaminate synthase，PDB ID：d1gp6a)的晶體三維結構為模板建模，三維模型覆蓋率為91%，序列的一致性為31%。利用NCBI在線BLAST工具將F3H 與GenBank 中其他植物F3H蛋白進行比對，選擇相似性最高的17種F3H蛋白，用Distance tree of results中的Neighbor Joining法構建系統進化樹(圖3)，不同物種來源的F3H蛋白在進化上歸屬不同的分支，類似于蔓花生、大花懸鈴果的F3H，EmF3H也為相對獨立的一個分支。

圖2 EmF3H蛋白三維結構預測Fig.2 The deduced three-dimensional structure of EmF3H

圖3 EmF3H和其他F3H蛋白的系統進化樹Fig.3 Phylogenetic tree analysis of EmF3H protein and other plant F3H proteins

2.3 EmF3H基因在不同生長期組織表達模式

分別提取斑地錦不同生長期(苗期、花期、果期)根、莖、葉、果的總RNA，以UBQ為內參基因，進行qRT-PCR擴增。結果顯示，EmF3H在不同生長期各組織中均有表達，但表達量有顯著差異，其中花期的根和果期的果實中表達量最高，其次為苗期的根和果期的根、莖，在各生長期的葉、苗期的莖和花期的莖內表達水平較低(圖4)。另外，在莖中隨生長期表達有不斷增強的趨勢，在根內表達量先上調后下降。

2.4 EmF3H基因啟動子序列的獲得與分析

以斑地錦基因組DNA為模板，Tail-PCR法進行染色體步移(圖5)，將第三輪約2 000 bp的PCR產物膠回收后連接T-載體測序。根據測序結果設計特異引物F3H-PF、F3H-PR，Pfu酶進行PCR擴增并送測序，結果獲得約1 604 bp的EmF3H啟動子序列，用Plantcare和PLACE分析顯示內含TATA-box、CAAT-box等基本啟動子序列，也含有Box 4(ATTAAT)、G-Box(CACGTG)、GATA-motif(AAGATAAGATT)、AE-box(AGAAACAA)、I-box(TGATAATGT)、TCT-motif(TCTTAC)等光反應元件，LTR(CCGAAA)低溫反應元件，TC-rich repeats(GTTTTCTTAC)應激反應元件，circadian(CAAAGATATC)晝夜節律調控元件和ABRE(ABA反應元件)、P-box(GAs反應元件)、TGA-element(生長素反應元件)等激素反應元件。

不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)圖4 不同生長期不同組織中EmF3H的相對表達量Different normal letters indicate significant difference at 0.05 level (P<0.05)Fig.4 The relative expression levels of EmF3H from different tissues in different growth stages

M. Trans2K? Plus Ⅱ；1.啟動子；2-3.Tail-PCR第二、三輪產物圖5 EmF3H基因啟動子的克隆M. Trans2K? Plus Ⅱ; 1. EmF3H promoter; 2-3. The second and third rounds products of Tail-PCRFig.5 Cloning of EmF3H promoter

3 討 論

苯丙烷代謝途徑是植物重要的次生代謝途徑之一，該途徑以苯丙氨酸為底物，先后在苯丙氨酸解氨酶(PAL)、肉桂酸-4-羥化酶(C4H)、4-香豆酰-CoA連接酶(4CL)、查爾酮合成酶(CHS)、查爾酮異構酶(CHI)、黃烷酮-3-羥化酶(F3H)、類黃酮-3′-羥化酶(F3′H)、黃酮醇合成酶(FLS)等一系列酶的催化作用下，合成黃酮類、木質素及花青素等多種次生代謝產物[14-15]，而F3H是其中的關鍵酶之一，催化柚皮素生成二氫山奈酚。F3H的克隆與功能研究已有一些報道[7-10]，煙草中超表達枸杞LcF3H提高了黃烷-3-醇的含量和對干旱脅迫的耐受性[16]；轉基因高粱胚軸中，SbF3H將部分碳流轉移到了3-羥基黃酮的生產上[17]。

該研究從斑地錦中克隆了一個F3H基因編碼區及其啟動子。蛋白質EmF3H與油桐VfF3H、烏桕TsF3H的序列相似性分別為85.5%、85.4%，初步證明EmF3H屬于F3H基因家族，氨基酸序列聚類分析結果表明其為相對獨立的一個分支，說明EmF3H在進化上有明顯的種屬特性。研究表明F3H基因在不同植物不同生長期和不同組織中表達水平有差異，檸條錦雞兒CkF3H在根、莖和葉中均有表達，沒有組織特異性[18]，而茶菊CmF3H在花中表達量最高，其次為莖、葉，根中表達量最低[10]；EmF3H在花期的根和果期的果實中表達量最高，隨著植物的生長，表達量在莖中逐漸上升，在葉內一直較低，說明該基因表達在斑地錦中存在組織特異性，同時預示著F3H可能參與多種物質的生物合成，且在不同植物中功能側重點不同，其具體功能有待于進一步挖掘。在EmF3H啟動子序列內預測有TAAT-box等基本啟動子序列和光反應元件、應激反應元件、激素反應元件等，表明EmF3H可能參與脅迫應答，但是否能夠響應不同脅迫，進而影響槲皮素等黃酮類化合物的合成，還需進一步研究基因表達調控。因此，該研究結果豐富了F3H基因資源，也對探討斑地錦苯丙烷類次生代謝途徑(包括黃酮類化合物生物合成途徑)奠定了一定的基礎。