EMS處理對小麥種子萌發和幼苗生長的影響

余徐潤，章 蓉，冉莉萍，周露艷，楊逸洲，熊 飛*

(1 江蘇省作物遺傳生理國家重點實驗室培育點/糧食作物現代產業技術協同創新中心/揚州大學教育部農業與農場品安全國際合作聯合實驗室，揚州大學，江蘇揚州 225009；2 揚州大學 廣陵學院，江蘇揚州 225128)

小麥(TriticumaestivumL.)是一種重要的糧食作物，在世界范圍內廣泛種植。中國是小麥生產和消費大國，近5年，中國小麥庫存量連年增加，增幅達29.9%,顯著高于世界小麥庫存總量增幅16.7%[1]。小麥產業發展直接關系到中國的糧食安全和社會穩定[2]。種子是農作物生產的基礎，使用高質量的種子能為獲得較高的產量提供更好保證。小麥種子的萌發率和幼苗生長狀況會直接影響產量和品質，在小麥育種和生產過程中，會有許多因素影響到小麥種子的萌發。

甲基磺酸乙酯(ethyl methane sulfonate, EMS)是一種誘變劑，能誘導堿基烷基化。使用EMS溶液處理種子來構建突變體庫是獲得優異種質資源的重要途徑, 這種方式具有種質突變頻率高、遺傳變異譜寬、育種周期短等優點[3]。通過突變體的多世代選擇和鑒定，可直接或間接地培育出生產上可以利用的作物新品種[4]。趙越[5]通過設立不同濃度梯度的EMS溶液處理小麥后，發現不同小麥品種的根長、芽長具有顯著差異，并且高濃度長時間的處理會抑制種子的生長發育甚至死亡。 Arias等[6]用EMS處理燕麥種子后能引起燕麥的產量突變；Natarajan等[7]發現大麥種子在水中預浸16 h或20 h，再用EMS浸泡4 h，可以最大限度地提高種子的敏感性，當使用合適的濃度時，在預浸的這個時間內可以獲得最高的突變率；Washington等[8]用EMS處理四倍體小麥的種子，在M1代的葉片中獲得了小麥葉綠素性狀突變體。此外，還有研究發現不同濃度的EMS處理小麥后，花藥愈傷組織的分化率降低；且隨著EMS濃度的增加，再生植株的抗旱性提高[9]。適當濃度的EMS處理能夠影響小麥農藝性狀的數值，例如能夠顯著降低小麥的株高、主穗長度、穗粒數等[10]。通過不同EMS濃度處理，還可以找到能夠使小麥誘變的最佳條件，從而產生具有抗病高產特性的新品種[11-12]。以上研究雖然明確了EMS對麥類作物生長發育有明顯影響，然而有關EMS處理對小麥種子萌發和幼苗生長的影響的報道卻不多。因此，本研究觀測了不同濃度EMS、不同處理時間下小麥的種子萌發情況和幼苗生長的情況，以探明EMS作為一種逆境條件對種子萌發和幼苗生長影響的細胞學機理。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

本研究以弱筋小麥品種‘揚麥15’為實驗材料，種子由江蘇省揚州市里下河地區農科所提供。

1.2 EMS處理

將EMS溶于75%的乙醇，再用配制好的pH為7.0的PBS溶液進行稀釋，配置成0.0%、0.6%、0.8%、1.0%、1.2%、1.4%和1.6%的處理液。選取飽滿、大小一致的小麥種子用蒸餾水浸泡12 h，浸泡后的小麥種子再用1%的次氯酸鈉溶液消毒30 min，然后進行EMS處理。試驗共設置以上7個EMS濃度梯度水平，以0.0%為對照(等體積的PBS溶液，pH=7)，每個濃度設置3個處理時長(10 h、12 h和14 h)，共組成21個處理組合，每個處理組合3次重復。將處理好的種子均勻放置在鋪好濾紙的培養皿中，每個培養皿40粒小麥種子，置于恒溫培養箱中培養；培養條件為白天25 ℃、16 h、光照4 000 lux，晚上16 ℃、8 h、無光照；在每日上午和晚上補加適量蒸餾水確保小麥種子正常生長。

1.3 觀測指標及方法

1.3.1 生物量及發芽勢和發芽率在開始培養后的3 d、6 d、9 d各取樣1次。每組處理隨機選擇3粒種子，觀測根、種子、葉片的數量、長度、鮮重、干重等指標。以種子的胚芽長到約種子一半長度作為種子萌發標準，在種子發芽4 d時計算發芽勢，在種子發芽7 d時計算發芽率。

發芽勢=第4 天發芽種子數/試驗種子數；

發芽率=第7 天發芽種子數/試驗種子數。

1.3.2 組織化學染色分別在開始培養后的3 d、6 d、9 d，各組隨機取3粒種子，去掉根和葉，保留穎果部分，將種子縱切，室溫下使用I2/KI(0.3% I2+1% KI)染色約1 min，使用體視顯微鏡觀察胚乳消耗情況并采集圖像。

1.3.3 顯微結構觀察從每組處理隨機選擇3粒種子，去除根和葉并保留穎果部分，用2.5%的戊二醛固定。其中對處理6 d的種子根部進行單獨取樣，選取培養皿外的部分，在靠近根部1/4處用刀片進行分離，并用2.5% 的戊二醛固定。將固定好的樣品在震蕩機上低速震蕩3 h左右后吸去前固定液，加入1～2 mL PBS低速震蕩10 min并重復3次。參照余徐潤[13]的方法制作樹脂樣品塊。在模具中用樹脂浸透樣品，使用恒溫箱于70 ℃條件下聚合24 h獲得樣品的包埋塊，冷卻后即可進行半薄切片。使用Leica ultracut R型超薄切片機進行半薄切片。用刀片修整包埋塊，使樣品接近包埋塊表面且保持切面平整；在超薄切片機上得到1 μm厚度的半薄切片后，用細玻璃管撈出切片置于提前滴加少量水的載玻片上，置于Leica EMMP烘片機上使切片伸展干燥；用1%TBO(甲苯胺藍)染色并用蒸餾水洗去浮色，再次置于烘片機上烘干；最后在Leica DMLS光學顯微鏡下觀察樣本并通過拍攝軟件進行圖像采集，以便進行后期數據分析。

1.4 數據統計

使用Adobe Photoshop CC 2019對根切片照片的皮層細胞部分染色，使用Image-Pro Plus對染色部分的面積進行測量，獲得根部橫截面積、維管束橫截面積以及皮層面積。數據分析時，每4個數據算一個平均值，作為一個重復。使用SPSS統計分析系統進行方差分析和顯著性檢驗(P< 0.05)。

2 結果與分析

2.1 EMS處理對小麥種子發芽勢和發芽率的影響

在相同 EMS處理時間下，小麥種子發芽勢和發芽率均隨著EMS濃度增高呈現逐漸降低的趨勢；相同EMS處理濃度下，種子發芽勢和發芽率均隨處理時間延長顯著降低，分別在0.8%～1.6%和1.0%～1.6% EMS處理濃度時表現得更明顯，且濃度越高，降低速度越快、降幅越大(圖1)。以上結果表明，EMS的濃度和處理時間均會影響種子發芽勢和發芽率，EMS濃度越高，處理時間越長，小麥種子發芽勢和發芽率越低。

圖1 不同濃度EMS和處理時間下小麥種子的發芽勢和發芽率Fig.1 Germination potential and germination rate of wheat seed under different EMS concentrations and treatment time points

2.2 EMS處理對小麥幼苗生長和生物量的影響

表1顯示，不同EMS處理組合的種子萌發第6 d，幼苗葉長隨著EMS處理濃度的升高和處理時間的延長逐漸減小，小麥幼苗的生長越緩慢。其中，處理時間為10 h時，小麥幼苗根長在相鄰EMS處理濃度之間差異不顯著，且根長在EMS處理濃度為0.6%～1.0%與對照(0.0%)無顯著差異，在EMS處理濃度為1.2%～1.6%時才表現出顯著差異；而幼苗葉長在相鄰EMS處理濃度之間則表現出顯著差異，且各濃度EMS處理均顯著低于對照。當EMS處理時間為12和14 h的時候，處理濃度越高，幼苗根和葉生長越慢，且差異顯著；幼苗根長在EMS處理濃度高于0.6%時顯著低于對照，而幼苗葉長在各濃度EMS處理下均與對照差異顯著。同時，不同EMS處理組合的種子萌發第6天時，隨著EMS處理濃度的升高和處理時間的延長，小麥幼苗的葉片鮮重表現出降低的趨勢，而種子的鮮重則表現出升高的趨勢；在處理時間為10 h時，小麥幼苗生物量(葉鮮重和種子鮮重)在各濃度EMS處理下均與對照差異顯著，而在處理時間為12和14 h時，幼苗生物量在EMS處理濃度高于0.6%時才與對照差異顯著。以上結果說明EMS處理會延緩小麥幼苗的生長。

表1 不同EMS處理組合小麥種子萌發第6天時幼苗根長、葉長及生物量比較

2.3 EMS處理對小麥種子形態的影響

如圖2所示，處理時間10 h時，不同EMS濃度處理的小麥種子萌發時胚乳消耗速度不同。隨著萌發時間的推移，種子內的胚乳逐漸被消耗，靠近胚的地方消耗更為明顯；在同一時間內，隨著EMS處理濃度的升高，小麥種子的胚乳消耗速度變慢。其中，在萌發3 d時，0.6% EMS處理的小麥種子已經出現凋亡空腔(白色箭頭所指，下同)，而1.0%、1.4% EMS處理的小麥種子并未出現明顯的凋亡空腔(圖2，A-C)；在萌發6 d時，0.6%、1.0% EMS處理的小麥種子都已有明顯的胚乳消耗，并出現凋亡空腔，但1.4% EMS處理的小麥種子仍未有明顯的凋亡空腔(圖2，D-F)；在萌發9 d時，3個EMS處理濃度的小麥種子都出現凋亡空腔，且0.6% EMS處理組的胚乳已經消耗殆盡，1.4% EMS處理組的胚乳消耗最少(圖2，G-I)。同時，在0.6% EMS處理濃度下，小麥種子在萌發3 d時只有靠近腹側糊粉層的部位出現凋亡空腔，在萌發6 d時胚乳已被消耗過半，在萌發9 d時胚乳被消耗殆盡(圖2，A、D、G)；在1.0% EMS處理濃度下，小麥種子在萌發3 d時未見明顯凋亡空腔，在萌發6 d時胚乳開始消耗并出現凋亡空腔，萌發9 d時胚乳被消耗一半(圖2，B、E、H)；在1.4% EMS處理濃度下，小麥種子在萌發3和6 d胚乳的凋亡空腔不明顯，在萌發9 d時胚乳僅被消耗一部分(圖2，C、F、I)。

圖中白色箭頭所指為凋亡空腔，下同圖2 處理10 h時不同EMS濃度處理下小麥種子的形態The white arrow in the figure indicates the apoptotic cavity, and the same as followFig.2 Morphology of wheat seeds treated with different EMS concentrations for 10 h

同時，相同EMS濃度下，經過不同時長處理的小麥種子萌發時胚乳消耗速度也不同，且隨著EMS處理時間的延長，小麥種子的胚乳消耗速度變慢(圖3)。在萌發3 d時，處理10 h的小麥種子已經出現凋亡空腔，而處理12和14 h的小麥種子并未出現明顯的凋亡空腔(圖3，A-C)。在萌發6 d時，處理10、12和14 h的小麥種子都已有明顯的胚乳消耗，并出現凋亡空腔，但凋亡空腔以處理10 h的小麥種子最大，處理14 h的小麥種子最小(圖3，C、D、F)。在萌發9 d時，3個處理時間的小麥種子都出現凋亡空腔，但處理10 h小麥種子的胚乳已經消耗殆盡，處理14 h小麥種子的胚乳消耗最少(圖3，G-I)。其中，處理組合0.6% EMS/10 h的小麥種子在萌發3 d時在靠近腹側糊粉層的部位已經出現凋亡空腔，在萌發6 d時胚乳已經被消耗過半，萌發9 d時小麥種子的胚乳被消耗殆盡(圖3 ，A、D、G)；處理組合為0.6% EMS/12 h的小麥種子在萌發3 d未見明顯的胚乳消耗，6 d時胚乳被消耗一部分，9 d時消耗更多(圖3，B、E、H)；處理組合為0.6% EMS/14 h的小麥種子在萌發3 d時的胚乳凋亡空腔不明顯， 6 d時候出現較小的凋亡空腔， 9 d時胚乳被消耗一部分(圖3，C、F、I)。

圖3 0.6% EMS不同時間處理下小麥種子形態觀察Fig.3 Morphological observation of wheat seeds treated with 0.6% EMS at different time points

2.4 EMS處理對小麥種子顯微結構的影響

不同EMS濃度下小麥種子的顯微結構圖顯示，隨著萌發時間的延長，小麥種子中的淀粉體尺寸越來越小，淀粉體的數量也越來越少(圖4)。其中，在萌發3 d時，處理組合0.6% EMS/10 h的小麥種子胚乳內大多數是小顆粒的淀粉體，而處理組合1.0% EMS/10 h和1.4% EMS/10 h的小麥種子中淀粉體大多是尺寸較大的淀粉體，且數量多(圖4，A、D、G)；在萌發6 d時，0.6% EMS處理的小麥種子淀粉體體積變小，而1.0%和1.4% EMS處理的小麥種子還有明顯的大淀粉體的殘留(圖4，B、E、H)；在萌發9 d時，0.6% EMS處理的小麥種子淀粉體已明顯有部分解體，而1.0%和1.4% EMS處理的小麥種子還有較多的淀粉體殘留(圖4，C、F、I)。從以上結果可以看出，EMS溶液處理濃度越高，小麥種子萌發過程中淀粉體的消亡速度越慢。

圖4 處理10 h不同EMS濃度處理下小麥種子的顯微結構(SG. 淀粉體)Fig.4 Microstructure of wheat seeds treated with different EMS concentrations for 10 h(SG. Starch granules)

2.5 EMS處理對小麥根長和根部維管束發育的影響

幼苗形態觀察結果表明，不同EMS濃度處理10 h后，小麥幼苗根長均隨著萌發時間的增加而逐漸增加(圖5，A-L)，隨著EMS濃度的增加而逐漸減少，且各EMS濃度之間大多差異顯著(圖5，M-O)。其中，根長在萌發3 d、6 d、9 d時均以0.0% EMS處理最長，1.4% EMS處理最短。可見，EMS能夠影響小麥的生長發育，EMS濃度越高，幼苗根長越短。

圖5 處理10 h不同EMS濃度處理下小麥種子根長對比Fig.5 Comparison of root length of wheat seeds treated with different EMS concentrations for 10 h

同時，各濃度EMS(0.0%、0.6%、1.0%和1.4%)處理10 h的小麥種子萌發6 d時幼苗根部顯微結構觀察結果顯示，根部維管束在0.0% EMS處理下較大(圖6，A)，但隨著EMS濃度的增加而越來越小(圖6，B、C)，并在1.4% EMS處理條件下最小(圖6，D)。可見，EMS的濃度能夠影響小麥幼苗根部維管束的發育進而影響小麥的生長，且EMS濃度越高，小麥維管束越小。另外，對小麥根部的橫截面進行染色，用軟件計算出不同部位的橫截面積，得到不同部位的橫截面積對比圖(圖6，E)。其中，小麥幼苗根部橫截面積也在0.0% EMS處理時最大，后隨著EMS濃度的增加而逐漸變小，并在1.4% EMS處理時最小；小麥幼苗根部維管束橫截面積與皮層橫截面積也在0.0% EMS處理下最大，后隨著EMS濃度的增加都逐漸減小；幼苗根部橫截面積、維管束橫截面積和皮層橫截面在EMS處理下的降幅均達到顯著水平。以上結果說明EMS能夠影響小麥維管束與皮層的增長，且EMS的濃度越高，小麥維管束與小麥皮層生長得越慢。

3 討 論

3.1 小麥種子胚乳消亡和幼苗生物量對EMS的響應

小麥作為中國重要的糧食作物，其生長發育狀況是影響產量的重要因素。種子的萌發和幼苗的生長是包括一系列生理生化反應的復雜又漫長的過程。本研究通過不同的EMS處理濃度和處理時間來探究小麥種子萌發的狀況。結果表明隨著EMS濃度的升高和處理時間的增加，小麥的發芽率和發芽勢逐漸降低，幼苗根、葉、種子的生物量明顯改變，種子萌發過程中胚乳消亡和淀粉體降解速度變慢，根系發育受到明顯抑制，總體呈現為小麥種子的萌發和幼苗的生長在高濃度EMS處理下受到明顯抑制。種子的胚乳是貯藏營養的地方，萌發開始時，小麥胚乳的消亡都是從近胚端開始，此后沿著腹溝向遠胚端延[14]。本研究在對小麥種子染色后可以在體視顯微鏡下觀察到，小麥胚乳的消亡也從近胚端開始，并且EMS顯著抑制了小麥胚乳的消亡速度。另外，小麥根系是吸收水分和無機鹽的重要器官，并通過根部內的維管組織進行營養物質傳輸。本研究表明，經EMS處理后小麥根部維管束面積和皮層面積均減少，根系變細，導致小麥吸收的營養物質減少，從而使其各項生物量發生顯著變化。熊君等評價了經EMS誘變的小麥種子產生的M4突變株系群體的農藝性狀，結果表明突變株系間在株高、穗長、總小穗數、總分蘗數、有效分蘗數、穗粒數、單株產量等性狀上差異極顯著[15]，也驗證了EMS能夠顯著改變小麥生物量這一結論。

最新研究表明鎘、鋅、銅和鉛等重金屬處理都會影響種子幼苗生長、生理生化過程和根的細胞壁成分[16-19]，且在高濃度下會抑制幼苗的生長。亞硒酸鈉[20]、NaCl[21-22]、Na2SO3和NaHSO3[23]等鹽溶液在高濃度下會加劇鹽脅迫的作用而降低種子發芽率。60Co-γ[24]、5-azaC[25]、PEG[26]等對小麥的生長以及鮮重干重也都有明顯的抑制作用。可見，EMS同其他高濃度重金屬、干旱、高鹽等逆境條件一樣，改變了實驗材料生長的生存環境，明顯影響糖、蛋白質、脂質的消耗以及抗氧化酶活性等，使得實驗材料的生理和代謝功能會受到阻礙從而影響種子的萌發和生長[27]。

3.2 不同EMS濃度和處理時間的差異

EMS是一種誘變劑，能夠改變植物生存環境并形成一種逆境條件，從而影響植物的生長發育。而不同濃度和不同時間對EMS處理效果也有影響。一方面，高濃度的EMS和較長的處理時間會影響小麥的生長發育。在本研究設置的7個EMS濃度處理梯度和3個處理時間下，隨著EMS處理濃度的增高和處理時間的延長，小麥種子的發芽率和發芽勢越低、小麥胚乳消耗量、根部維管束面積和皮層面積減少得更快，根系也越細，其各項生物量都發生顯著變化。李顏方等[28]采用梯度濃度的EMS和不同作用時間處理小麥種子，也發現小麥的發芽勢、發芽率、莖長和胚根長都隨著EMS濃度的增大而降低。另一方面，不同的EMS濃度和時間的處理組合能夠誘導小麥種子獲得理想株系。例如Lethin等[29]利用1% EMS濃度使小麥種子誘變，其中有部分株系表現出矮化、植株巨大、開花早等特性。Singh等[30]使用1.5% EMS處理不同品種的小麥，使這些品種的小麥獲得了更利于生長的特性，在干旱、高溫等條件下具有了更好的耐受性。武銀玉用0.8% EMS浸泡‘晉麥90號’小麥種子10 h后創造出抗寒性好的突變體[31]和具有抗旱性的突變體[32]。孫玉龍[33]用0.4% EMS浸泡14 h后獲得具有優良性狀的‘盛農1號’突變體。此外在前人研究中，通過采用梯度濃度的EMS和不同作用時間處理小麥種子，分析比較不同組合處理的效果，最終確定‘晉谷21號’最佳誘變條件為 1.0% EMS/10 h[28]，‘西農99’、‘西農979’、‘西農977’和‘小偃22’的最佳處理組合分別為1.0% EMS/10 h、1.0% EMS/8 h、1.0% EMS/12 h和1.0% EMS/12 h[34]。本研究中處理組合為1.4% EMS/14 h下，小麥‘揚麥15’種子發芽率和發芽勢最低，幼苗根部維管束和皮層面積最小，根系最細。

綜上所述，EMS處理會降低小麥種子的發芽率，減緩種子貯藏物質的降解速度，抑制小麥根系的生長。同時，EMS也能誘導小麥種子獲得理想突變體，產生優良性狀。因此，可以通過適當的EMS處理來調控小麥的生長發育，但具體的處理濃度和生產應用還應根據具體材料進行更深入研究。