香稻不同發育時期香味物質的變化分析

潘陽陽，周德貴，黃道強，王重榮，李 宏，王志東，陳宜波，趙 雷，龔 蓉，周少川

（廣東省農業科學院水稻研究所/廣東省水稻育種新技術重點實驗室/廣東省水稻工程實驗室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】廣東是我國重要的水稻主產省份之一，國家統計局數據顯示，近5 年廣東稻谷年播種面積在180 萬hm2左右，產量達1 050 萬t。當前，水稻產業處于提質增效轉型關鍵期，發展優質稻是提高種植效益、優化品種結構的重要舉措［1］。廣東優質稻育種在全國處于領先地位［2］，于2018 年提出振興廣東絲苗米戰略，以絲苗米產業園為抓手，打造絲苗米品牌。首屆全國優質稻品種食味品質鑒評中，廣東絲苗米品種美香占2 號、象牙香占和增科新選絲苗1 號獲得首屆全國十大優質稻品種食味品質鑒評（秈稻）金獎，此后美香占2 號又連續獲得第二屆和第三屆全國優質稻品種食味品質鑒評金獎，已成為絲苗米產業園主栽品種。截至2021 年1 月，廣東已創建18 個省級絲苗米產業園，有力帶動了優質米產業高質量發展。香味是絲苗米必須具備的食味品質性狀，是稻米價格的重要決定因素［3］。因此，解析絲苗米品種香味物質組分，特別是從動態角度考量水稻發育過程中香味物質的變化，對于打造不同類型香米品牌、培育廣東絲苗米新品種具有重要指導意義。【前人研究進展】香味是稻米的重要品質性狀，泰國香米、五常大米等品牌稻米均具有濃郁的香味，除日本以外多數亞洲國家消費者對香味具有偏好性。稻米中已發現上百種揮發性化合物［4-7］，通常根據香米散發出來的香氣差異，將香型分為爆米花型、茉莉花型、紫羅蘭型、山核桃型等［8］。1983 年，Buttery 等［9］確認2-乙酰-1-吡咯啉（2AP）是香稻特征香氣成分，2AP 是一種極易揮發的親脂性小分子化合物，其閾值僅為0.1 μg/kg，呈典型“爆米花”香味而極易被感知，幾乎在所有香稻中均能被檢出［10］。研究表明，香稻是由于香味基因BADH2功能性缺失，導致2AP 被特異積累［11-12］。香稻地上組織中2AP 含量通常高于精米［13］，籽粒中90%以上2AP 分布于精米，米糠中2AP 含量不足10%［14］。不同的badh2突變類型導致2AP 積累程度表現出較大差異［15］，即使是相同的badh2突變類型，其2AP 含量也存在明顯差異［16-17］，一方面由于品種間存在適應性的差異，另一方面與2AP 代謝通路中其他基因活性密切相關［18］；此外，產地、氣候、栽培方法、儲藏條件等環境因素均能夠影響香味強度［19-23］，即使同一品種在不同地域種植，其香味往往表現不同。除2AP外，其他類型香味化合物也是導致香稻間食味品質差異的重要因素。Widjaja 等［24］對3 種香米米飯的揮發性物質比較發現，Jasmine 和Goolarah 的吲哚含量更高，而Basmati 的2-苯基乙醇含量最高、正己醛含量最低。Yang 等［25］對6 種不同風味米飯的揮發性成分進行分析，其中2-AP、己醛、2-壬烯醛，辛醛、庚醛和壬醛的氣味活性值占比均達97%以上，而1-辛烯-3-醇、2-辛烯醛、2,4-壬二烯醛、2,4-癸二烯醛、癸醛、2-庚酮和愈創木酚對不同類型稻米風味的形成起重要貢獻；Hinge 等［26］比較Basmati-370 和Ambemohar-157在籽粒成熟過程中的香味物質差異，發現Basmati-370 中2AP 含量低于Ambemohar-157，但2-壬醛、壬醛、庚醛、辛醇、1-辛烯-3-醇和2-戊基呋喃的含量均顯著高于后者，這可能是兩者風味差異的主要原因?！颈狙芯壳腥朦c】關于廣東優質絲苗米香味成分的比較研究較少，特別是對不同組織器官、尤其是對生殖生長階段的枝梗、穎殼等組織中的香味物質鮮有研究。【擬解決的關鍵問題】本研究對美香占2 號和象牙香占兩個廣東絲苗米代表品種生長發育過程中的香味物質進行分析，揭示香味物質變化特性，比較兩個品種香味物質差異，重點揭示2AP 在籽粒發育過程中的含量變化特征。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1供試品種與種植條件 選用廣東省農業科學院水稻研究所保存的美香占2 號和象牙香占水稻品種種子，于2019 晚季在廣東省農業科學院水稻研究所大豐育種基地種植，單株移栽，株行距為16.7 cm×16.7 cm，兩行后隔一行種植，采用常規水肥方式管理。

1.1.2樣品采集 分別收集拔節期頂二葉（S1）、孕穗期穗（S2 為穎花、S3 為枝梗）、開花后10 d谷粒（S4 為乳熟期籽粒，S5 為穎殼）、20 d 谷粒（S6為蠟熟期籽粒，S7 為穎殼）、30 d 谷粒（S8 為成熟期籽粒，S9 為穎殼）。每個樣品由12 個以上單株樣品混合制備，所有樣品均在上午9：00—10：00 收集，液氮冷凍后保存在-80 ℃冰箱；收集兩個品種自然曬干的谷粒，后續處理獲得S10糙米和S11 精米。

1.2 試驗方法

1.2.1樣品制備 對冷凍鮮樣進行真空冷凍干燥處理：采用德國Christ 凍干機（型號Alpha 1-4 LSC basic），在-40 ℃真空冷凍條件下對S1～S9等樣品干燥48 h。葉片、枝梗和谷殼等樣品采用IKA 研磨器研磨4～5 min 至無法繼續粉碎為止。

稻谷利用礱谷機（中儲糧有限公司，型號JIG-Ⅲ）進行 脫殼，獲得相應糙米，再經碾米機（中儲糧有限公司，型號JNM-III）對糙米進行去皮，獲得精米。利用芬蘭Perten3310 型實驗室粉碎磨機對籽粒樣品、糙米和精米進行研磨，粉末樣品過425 μm 孔徑篩網，用于后續試驗。

1.2.2揮發性成分萃取 采用瑞士CTC Analytics AG 公司多功能自動進樣系統RTC120，準確稱取2 g 粉狀樣品，放入20 mL 頂空瓶中，加入1 μL 2,4,6-三甲基吡啶（TMP，溶于乙醚，濃度0.05 mg/mL）作為內標，迅速擰緊頂空瓶瓶蓋，放入90 ℃水浴鍋中，平衡5 min 后，迅速插入固相微萃取裝置（SPME Arrow DVB/CWR/PDMS 萃取頭），90 ℃條件下吸附40 min。

1.2.3揮發性成分檢測 把萃取頭插入色譜儀的進樣口進行解吸附，進樣口溫度為250 ℃，解吸附時間為2 min。利用安捷倫8890 氣相色譜串聯5977B 質譜儀對樣品的揮發性成分進行數據采集和分析。

氣相條件：氣相色譜柱DB-5MS（60 m×0.32 mm×0.25 μm，美國安捷倫公司）；載氣為氦氣，流速為1.0 mL/min；不分流進樣，程序化升溫為35 ℃保持3 min，隨后以5 ℃/min 的速率上升至85 ℃，保持5 min 后以相同速率上升至120 ℃，保持6 min 后以相同速率上升至210 ℃，傳輸線溫度250 ℃。

質譜條件：電子轟擊型離子源；電離電壓70 eV；離子源溫度230 ℃；四級桿溫度150 ℃；接口溫度280 ℃；掃描模式為全掃，m/z 為35～450。

1.2.4數據處理 對GC-MS 檢測所得的原始數據利用Masshunter 工作站進行處理，并與NIST17庫中數據比對，以質譜數據（匹配度得分大于70.0）和線性保留指數（偏差在10 個單位內），確定揮發性物質成分。以TMP 為內標，計算各化合物的相對含量：

2 結果與分析

2.1 水稻樣品中香味物質成分分析

美香占2 號和象牙香占各11 份不同時期的樣品揮發物成分及含量見表1。所有水稻樣品共檢出63 種香味物質，分為雜環類、烴類、醛類、醇類、酮類、酯類和其他等7 類，每類分別含有5、11、16、9、12、8、2 種香味物質。大多數樣品香味物質數量在35～40 種之間，每個樣品平均含36 種化合物，其中十二烷、十三烷、十四烷、己醛、庚醛、苯甲醛、辛醛、壬醛、癸醛、十一醛、苯甲醇、正壬醇、香葉基丙酮和辛酸乙酯等14 種物質在所有樣品中均被檢出。此外，2AP、十一烷、5-甲基十三烷、3-甲基十三烷、2,6,10-三甲基十二烷、1,2,3,4-四氫-1,6-二甲基-4-（1-甲基乙基）萘、2-壬烯醛和正己醇等8 種物質在所有籽粒樣品中均被檢出。

相同時期兩個品種間香味物質種類相近，均在孕穗期最多，其中美香占2 號孕穗期穎花和枝梗分別含有40、43 種香味物質，象牙香占孕穗期穎花中含有42 種香味物質；穎殼中香味物質種類較少，其中10 d 穎殼中香味物質種類最少，分別為28、27 種。所有香味物質中，僅三甲基環己烯酮在美香占2 號中被特異檢出，2-辛烯-1-醇只在象牙香占中被檢出。以上結果表明美香占2 號和象牙香占香味物質構成相似，且在籽粒成熟過程中，香味物質種類變化特征基本一致。

2.2 不同水稻樣品間香味物質含量比較

對63 種香味物質含量進行分析發現，美香占2 號孕穗期枝梗中有19 個化合物含量達到最高，此外孕穗期穎花、10 d 穎殼和葉片分別含有13、11、8 個峰值化合物，孕穗期穎花和枝梗中峰值香味物質數量占比達一半以上，包括大多數醛類、醇類和酮類，表明美香占2 號在孕穗期香味物質種類最多，且多數物質在此時含量最高。象牙香占在孕穗期穎花和10 d 穎殼中各含有16 個峰值化合物，包括大多數醛類、烴類、酮類和醇類，而葉片和孕穗期枝梗中分別有10、3 個含量最高化合物，表明象牙香占在孕穗期和開花初期香味物質含量最為豐富。值得注意的是，個別香味物質在30 d 穎殼中含量最高，如具有柑橘香味的正壬醇，以及象牙香占中具有菠蘿香味的辛酸乙酯和2-辛烯酸乙酯，說明水稻發育過程中不同香味物質的合成代謝和積累特性存在明顯差異。

2.3 兩個香稻品種發育過程中2AP 含量比較

從圖1 可以看出，美香占2 號和象牙香占2AP 均在葉片中含量最高，分別達104.93、119.25 ng/g，籽粒中2AP 含量明顯低于葉片，隨著籽粒成熟2AP 含量呈下降趨勢，糙米中2AP 含量分別為3.86、8.06 ng/g，所有穎殼樣品中未檢出2AP。美香占2 號孕穗期穎花和枝梗中2AP 總量高于葉片，但各時期籽粒中2AP 含量均低于象牙香占。從籽粒2AP 空間分布來看，美香占2 號精米與糙米2AP 含量比為97.9%，象牙香占精米2AP 占64.4%，說明美香占2 號籽粒2AP 主要積累在胚乳中。

圖1 兩個香稻品種不同發育時期2AP 含量的動態變化Fig.1 Dynamic change of 2AP content in two aromatic rice cultivars at various developmental stages

2.4 糙米和精米中香味物質的比較

兩個香稻品種糙米和精米中香味物質含量豐富，包含所有烴類、大多數醛類和醇類、少數酮類和酯類共約40 種香味化合物。從表2 可以看出，烴類含量最高，其次為醛類和醇類，糙米中各類香味物質含量整體高于精米，個別物質如1-辛烯-3-醇、4-氧代異佛爾酮在精米中未檢出，表明糙米中香味物質組分和含量多于精米。此外，2-甲基苯并呋喃、正庚醇和γ-壬內酯只在糙米或精米中被檢出，說明在大米加工過程中能夠產生個別新的香味物質。

表2 兩個香稻品種糙米和精米中揮發性成分含量Table 2 Contents of volatile components in brown rice and polished rice of two aromatic rice cultivars（ng/g）

進一步比較兩個香稻品種精米中香味物質差異發現，美香占2 號精米除2AP 含量低于象牙香占外，其他烴類、醛類、醇類、酮類和酯類中的多數組分含量均略高于象牙香占。另外，1,2,4-三甲基苯、異佛爾酮只在美香占2 號精米中被檢出，而苯乙醛、1-辛烯-3-醇和γ-壬內酯在象牙香占精米中被特異檢出，這些香味物質構成及含量的差異，可能對兩種米飯飯香的塑造起重要作用。

3 討論

頂空固相微萃取法是目前香味物質檢測的主要方法［17,27-29］，本試驗采用瑞士CTC 公司RTC120 自動化取樣設備，結合目前最高性能的安捷倫8890 氣相色譜串聯5977B 系統，在前期對香稻糙米2AP 含量測定所需的萃取溫度、萃取時間和上樣量等條件進行優化基礎上，一次性對所有樣品進行測定，數據偏差小，可信度較高。

從香味物質的分布來看，葉片中不含特定的香味成分，只有8～10 種香味物質在葉片中含量達到峰值，而孕穗期香味物質積累最為豐富，表明香味物質在生殖生長時期能夠被持續合成，由于香味物質具有極易揮發的特性［30］，這可能是水稻開花期“稻香”最濃郁的原因所在。同時，通過改善孕穗期水肥管理，有助于2AP 積累［31-32］。另外，發現11～16 個香味物質在10 d 或30 d 穎殼中含量最高，其生物學意義尚不清楚。

在食味品質鑒評中，象牙香占較美香占2 號具有更濃的香味［33］；同時，Luo 等［34］、Okpala 等［35］均發現象牙香占籽粒中2AP 含量高于美香占2 號，本研究與其結果一致。同時，本研究進一步發現，美香占2 號在各時期籽粒中2AP 含量均低于象牙香占，這可能與2AP 代謝通路的調控密切相關，具體原因有待進一步研究。

美香占2 號和象牙香占是當前廣東絲苗米的代表品種，成熟籽粒中檢出40 多種香味物質，與Basmati-370 籽粒中54 種香味物質［26］、泰國香米91 種香氣成分和五常大米68 種香氣成分［36］相比，所有香稻中2AP 均是香稻香味構成的主要成分，同時，烴類、醛類和醇類化合物含量最為豐富，但不同類型香米中香味化合物種類有較大差異，如Basmati-370 中含有香草醛、芳樟醇、2-乙基-1-己醇、水楊酸甲酯等香味物質，泰國香米中的正己醇、1-辛烯-3-醇、苯酚、4-甲基苯酚、正己醇和1-辛烯-3-醇等，五常大米中香草醛、2,4-葵二烯醛、3-甲基苯酚、4-甲基苯酚和苯丙酮等化合物，而絲苗米中含有反式肉桂醛、苯甲醇、正壬醇、辛酸乙酯等物質，這些化合物可能對各自香米特征性風味的形成發揮作用。

由于米糠中營養素和生理活性物質含量遠高于胚乳［37-38］，糙米的營養價值要高于精米，本研究也發現糙米中香味物質含量明顯多于精米。因此，在絲苗米品牌創建過程中要注重加工環節，應當防止絲苗米過度精加工，同時有必要建立相關的糙米食味評價指標及體系，對于強化稻米營養價值、提高米飯飯香具有重要意義。

4 結論

本試驗分析了美香占2 號和象牙香占兩個優質香稻不同發育時期11 份樣品的香味物質成分，共檢測到63 種香味物質，每個樣品平均含36 種化合物，美香占2 號在孕穗期枝梗中含有43 種化合物，其中19 個物質在此時期含量最高，象牙香占孕穗期穎花中含有的化合物種類最多為42 種，其中16 個為峰值化合物，這些物質包括多數醛類、醇類和酮類化合物；兩個品種在10 d 穎殼中香味物質種類最少，分別有28 種和27 種化合物，表明兩個香稻品種在生長發育過程中香味物質變化特性整體相似，孕穗期是香味物質積累的關鍵時期。葉片中2AP 含量最高，隨著籽粒成熟，各樣品中2AP 含量呈下降趨勢，而象牙香占各時期籽粒2AP 含量均高于美香占2 號，但精米中烴類、醛類、醇類、酮類和酯類等多數香味化合物含量低于美香占2 號，這可能是兩者飯香差異的主要原因。本研究揭示了香稻中香味物質的動態變化特性，將為研究香稻品種特性、推進優質香米品牌建設等提供理論依據。