梅毒螺旋體TP15 抗原在梅毒診斷中的應用價值

許志晟 朱伯平 黃思聰

梅毒是由梅毒螺旋體(Treponema pallidum，TP)引起的一種性傳播疾病，可通過性接觸、輸血和垂直傳播傳播。近年來，梅毒在中國的發病率呈上升趨勢。梅毒患者從2005 年的135210 例增加到2014 年的441818 例，增幅超過其他27 例乙類法定傳染病，居全國第三位［1］。梅毒可導致神經梅毒、心血管、多系統損傷，甚至死亡。因此，及時診斷和治療梅毒患者至關重要［2］。梅毒的診斷主要依據臨床表現和實驗室血清學檢查，血清學試驗提供了梅毒的推定診斷，它可以分為非密螺旋體試驗和密螺旋體試驗。非密螺旋體檢測主要包括快速血漿反應素環狀卡片試驗(RPR)、性病研究實驗室試驗(VDRL)及甲苯胺紅血清不加熱試驗(TRUST)，如果結果為陽性，則進行經確認的密螺旋體檢測，如TPPA。近年來，越來越多的實驗室開始應用密螺旋體免疫分析，如酶免疫分析(EIA)、化學發光免疫分析(CIA)等。這些方法的靈敏度和特異性都很高，但梅毒檢測尚無公認的金標準方法［3］。以往研究表明，TP15 蛋白在梅毒螺旋體中含量豐富，是一種具有較高特異性的外膜蛋白成分，在各期梅毒患者的血清中均能夠檢測到針對該蛋白的特異性免疫球蛋白G(IgG)抗體［4］。因此，本研究通過基因工程技術克隆表達TP15蛋白，并通過建立ELISA 方法評價其作為診斷抗原的應用價值，為開發和優化新一代梅毒診斷試劑盒提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料 TP 模板：梅毒螺旋體Nichols 株基因組DNA 由廣州醫科大學檢驗系實驗室保存。載體及菌株:原核表達載體pET-28b 及大腸桿菌DH5A、大腸桿菌BL21 (DE3)保存于實驗室。血清樣本：梅毒TPPA 陰陽性血清由廣州醫科大學附屬第一醫院收集。主要試劑：購自TAKARA 的預混Ex Taq DNA 聚合酶;購自New England Biolabs 的核酸內切酶NCOI、SALI和T4 DNA 連接酶。購自Fermentas 的蛋白質分子量標準品；購自Tiagen 公司的質粒提取和PCR 產物回收試劑盒，購自JABES 公司30%丙烯酰胺(1∶29)、TRIS、SDS、IPTG 和TRICINE；鎳離子親和色譜柱(histrapgravity)購自GE；購自Abcam 的酶標羊抗人IgG。

1.2 TP15 基因擴增 以TP 基因組DNA 為模板設計引物forward：5’-CATGCCATGGGCATGGTGAAAAGAG GTGGCGC-3’；reverse：5’-ACGCGTCGACCCTGCTAAT AATGGCTTCCT-3’。TP 模板0.8 ng，上游和下游引物為0.8 μmol/L，2×Premix Ex Taq 為25 μl，蒸餾水為50 μl。反應條件為:95℃預變性5 min，95℃變性15 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，循環35 次，再72℃延伸5 min。擴增PCR 產物和1%瓊脂糖凝膠電泳分析。

1.3 pET28b-TP15 質粒的構建和測序 目的基因片段與經相同雙酶切的pET-28b 載體連接過夜。將連接產物轉化到敏感大腸桿菌BL21 (DE3)中，使用卡那霉素進行抗性篩選，獲得重組體，送公司測序驗證。

1.4 重組工程菌的誘導表達和純化 在含有卡那霉素的LB培養基中接種重組工程菌并振蕩培養，次日按1%比例轉種于卡那霉素LB 培養基中。當OD600 達到0.8，最終濃度為1.0 mmol/L 時加入IPTG 誘導表達。分別在誘導后0、1、2、3、4 h 收集細菌，用超聲波破菌。行SDS -PAGE 分析。提取IPTG 誘導與表達后包涵體沉淀物，用含2 M 尿素和1% Triton X-100 的洗滌液洗滌3 次，再用8 M 尿素沉淀包涵體。用親和層析對溶解的上清進行純化，用450 mM 咪唑洗脫。

1.5 Western blot SDS-PAGE 后，在PVDF 膜上TP15重組蛋白進行Western blotting 分析，其中一抗為TPPA陽性梅毒血清，二抗為酶標羊抗人IgG。

1.6 TP15-ELISA 法的建立 使用碳酸鹽緩沖液(pH 9.6)將純化的TP15 蛋白稀釋到合適的濃度(由棋盤滴定法確定)，將其包被到空白酶標板，4℃孵育過夜。使用1%BSA 在室溫條件下封閉2 h 后即可使用。血清經1∶5 稀釋后37℃溫育1 h，酶標抗體工作濃度為1∶20000。用于檢測臨床收集的44 例TPPA 陽性和44 例TPPA 陰性血清，以檢測獲得的44 份TPPA 陰性血清的平均OD+3SD 為陽性臨界值。

1.7 統計學方法 采用SPSS17.0 統計學軟件處理數據。計數資料以率(%)表示，采用χ2檢驗分析TPPA法與TP15-ELISA 對梅毒血清的檢測結果。P＜0.05 表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 TP15 表達載體的測序和鑒定 TP15 基因片段經PCR 擴增后進行AGE 分析，發現特異性DNA 條帶約為0.5 KB，與預期一致。電泳分析的原核表達載體pET28b-TP15 NCoI/SAII 酶切后顯示兩個條帶約5.3 KB 和0.5 KB。見圖1。表達載體的測序結果顯示，pET28b 載體克隆的基因序列與數據庫中注冊TP15 基因序列是一致的。

圖1 TP15 基因擴增產物和表達載體pET28b-TP15 雙酶切鑒定

2.2 TP15 誘導表達、純化與驗證 經IPTG 誘導表達后，重組菌pET-28b-TP15-BL21 的表達產物經SDSPAGE 分析，可見蛋白條帶約20 kDa 左右，隨誘導時間的延長 其表達量增加，4 h 時達到峰值，以包涵體為主要表達形式。見圖2A。UVP 分析顯示，約細菌總蛋白含量的30%是本實驗的目的蛋白，純化重組蛋白可得到相對單一的目的蛋白帶。見圖2B。Western blotting表明TP15 蛋白與TPPA 陽性血清具有良好的免疫反應性，而與TPPA 陰性血清不發生反應。見圖2C。

圖2 梅毒螺旋體TP15 蛋白的誘導表達、純化與驗證

2.3 ELISA 間接法的檢測結果 44 份TPPA 陰性樣品的平均OD 值為0.212，標準差為0.04，因此陽性結果判斷參考值為0.332。在44 份TPPA 陽性血清中發現2 份結果為陰性的標本，在44 份TPPA 陰性血清中發現2 份結果為陽性的標本，TPPA 與TP15-ELISA 檢測梅毒特異性抗體的符合率比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。見表1。

表1 TPPA 與TP15-ELISA 檢測臨床血清的結果(n)

3 討論

梅毒螺旋體是梅毒的病原體。梅毒是一種慢性、多期、全身性疾病，有三種主要傳播方式：性接觸、接觸感染性病變及宮內感染。雖然梅毒使用青霉素治療治愈率高，但每年仍然約有1100 萬新增感染［5］。先天性梅毒可導致自然流產、死胎、產后死亡或新生兒畸形，目前每年估計仍有140 萬孕婦感染梅毒［6］。此外，已經證實有癥狀的梅毒感染會使艾滋病毒傳播和獲得的風險增加2～5 倍，對全球公共衛生構成的威脅［7］。

目前對梅毒螺旋體感染的診斷主要依靠病原體的直接檢測［2］與血清學抗體檢查［3］。病原體的檢測取樣及檢測都比較繁瑣，因此限制了其在臨床上大規模的應用；而在梅毒血清抗體的檢測中，RPR 和TPPA是診斷梅毒的經典方法，但不適于大批量標本的篩查。RPR 檢測梅毒非特異性抗體，存在一定比例的假陽性反應，且易漏診三期及治療后梅毒，僅適用于梅毒感染的初步篩查［8］。TPPA 是目前國內許多醫院常用的梅毒確診試驗，但檢測時標本需要系列稀釋，操作煩瑣，檢測時間長，難以自動化，同樣不適合大批量標本的篩查［9］。

梅毒螺旋體TP15 脂蛋白是梅毒螺旋體含量豐富的外膜蛋白之一，具有較強的免疫原性，在梅毒感染的各個期間均可引起高抗體反應，且與其他螺旋體疾病患者的血清不發生交叉反應，是一種針對梅毒特異性抗體檢測的新型位點［4］。而ELISA 靈敏度高，特異性強，穩定性好，可自動化，是梅毒篩查的理想方法［10］。

由于梅毒螺旋體難以在體外培養，本研究中我們采用基因工程技術，構建梅毒螺旋體TP15 基因的原核表達載體，通過誘導表達獲得TP15 重組蛋白，經SDSPAGE 驗證后顯示為單一的蛋白條帶，表明所采用的Ni-NTA 親和層析法可快速獲得高純度的TP15 蛋白，進而我們利用TP15 重組蛋白建立了以TP15 為診斷抗原的間接ELISA 檢測方法。在與傳統梅毒血清學診斷方法比較中發現，TPPA 與TP15-ELISA 檢測梅毒特異性抗體的符合率比較，差異無統計學意義(P＞0.05)。

綜上所述，通過基因工程獲得的TP15 蛋白具有良好的臨床應用前景，可以作為研發新一代梅毒診斷試劑重要物質基礎。