稻瘟病菌效應蛋白MoIEEPl功能初探

張茜茜　劉文德　李智強

中圖分類號： S435.111.41 文獻標識碼： A DOI： 10.16688/j.zwbh.2020118

水稻是最重要的糧食作物之一，供養著全世界50%以上的人口。然而，由稻瘟病菌引起的水稻全生育期病害極其嚴重且難以控制。研究顯示，稻瘟病造成的水稻年均減產量可大約供給6000萬人口的稻米需求。稻瘟病菌無性態為灰梨孢犘狔狉犻犮狌犾犪狉犻犪狅狉狔狕犪犲Sacc，屬半知菌亞門，叢梗孢綱，叢梗孢目，叢梗孢科，梨形孢屬;有性態為犕犪犵狀犪狆狅狉狋犺犲狅狉狔狕犪犲BarrYaegash，子囊菌亞門。其侵染階段分為：首先，在適宜溫濕度條件下，稻瘟病菌分生孢子梗產生分生孢子，作為侵染循環的接種體;其次，借助空氣和風雨的傳播，分生孢子利用尖端的黏液附著在植物組織表面，2h后萌發形成芽管，8h后特異性分化產生附著胞;成熟的附著胞隨即形成侵染釘穿透植物表皮細胞，侵入植物體內;最后，稻瘟病菌菌絲在寄主細胞內和組織間生長，并在侵染4～5d后形成病斑，寄主細胞死亡?？諝鉂穸容^高的情況下，稻瘟病菌侵染菌絲再次產生分生孢子梗和分生孢子，形成新一輪侵染循環，造成病害的不斷產生與擴散。自稻瘟病菌全基因組測序完成以來，己有上百個基因被預測并證明可能與稻瘟病菌的致病性相關。如敲除稻瘟病菌MoDuol基因后，發現其突變體分生孢子發育異常，營養菌絲生長減緩，致病力明顯減弱。有些基因則與稻瘟病菌附著胞和侵染釘的形成有關，如Pmk1、MoMSB2、MoSHO1、Com1等，進而影響其致病性。因此，稻瘟病菌致病相關基因及其與水稻的互作研究是尋找新的防病途徑的關鍵，具有重要的科學意義和實踐價值。

為了順利侵入寄主植物，病原菌需要經歷一系列形態和生理變化，其中包括抑制或克服植物免疫系統，擾亂寄主新陳代謝和信號傳導，促進其自身生長。相應地，植物體內進化出一套相對完善的防御系統。該系統包括兩個層面。第一是植物細胞表面模式識別受體識別保守的病原菌相關分子模式（PAMP）激發植物基礎防衛反應PTI（PAMPtriggeredimmunity）;第二是植物抗病蛋白直接或間接識別病原菌分泌的效應蛋白產生的更強烈的免疫防衛反應ETI（Effectortriggeredimmunity），通常在侵染位點引起寄主細胞死亡。在植物和病原菌激烈的“軍備競賽”中，PTI是寄主植物先天免疫的基礎防線。寄主植物模式識別受體識別到鞭毛蛋白、碳水化合物、脂質和小分子等病原菌相關分子模式即可抵御病原菌侵染。隨之病原菌協同進化出多種途徑直接或間接抑制植物PTI反應，其中最重要的是通過分泌效應蛋白干擾免疫反應。大多數真菌效應蛋白N端具有信號肽，利用內質網-高爾基體蛋白分泌系統分泌到細胞外基質，或被轉運至植物細胞特定空間發揮作用?；蚪M、轉錄組和蛋白質組等相關生物技術的不斷發展，使越來越多與水稻互作的稻瘟病菌效應蛋白先后被鑒定。稻瘟病菌Slp1基因編碼一個具有分泌功能的LysM 效應蛋白，通過與水稻模式識別受體幾丁質激發子結合蛋白（CEBIP）競爭結合幾丁質，抑制植物免疫反應。AVRPITA 和PWL2含有分泌信號肽且在真菌侵入、定殖和晚期感染過程中特異表達。犪犮犲1是已克隆無毒基因中唯一編碼非分泌蛋白的基因，控制合成一種次生代謝物，侵染水稻時特異性積累在附著胞細胞質中。

鑒定更多的稻瘟病菌效應蛋白并明確其在寄主細胞中的可能作用位置及其致病性不僅是當前研究“水稻稻瘟病菌”分子互作機制的熱點內容，而且對稻瘟病防治及培育抗性品種等工作具有極其重要的意義。前期研究中，本實驗室應用RLSAGE、MPSS與SBS轉錄組高通量分析技術，檢測到MoIeep1分泌蛋白基因在稻瘟病菌侵染寄主植物時誘導表達。為進一步了解該基因的功能，本文對MoIEEP1（MGG_00083）蛋白的預測信號肽進行了分析與功能驗證，亞細胞定位分析與驗證了該蛋白的定位，并構建該基因的敲除突變體，解析其生長表型與致病性，為進一步研究該效應蛋白的功能奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料水稻品種為‘日本晴和‘CO39。稻瘟病菌菌株為Guy11，農桿菌Agrobacterium tumefaciens菌株為EHA105，克隆菌株為大腸桿菌Escherichia coli菌株DH5α和JM109，酵母突變體菌株為YTK12。試驗用載體為用于信號肽驗證的pSUC2和用于水稻亞細胞定位的pYBA1132，以上試驗材料均由本實驗室保存。用于酵母菌培養的SD/T培養基、蔗糖培養基、YPD培養基的配制參考文獻。

1.2 試驗方法

1.2.1 效應蛋白基因克隆與載體構建

根據真菌數據庫（https：∥fungidb.org/fungidb/）中MoIeep1（GeneID：MGG_00083）基因編碼區（CDS）序列信息，采用PrimerPremier5.0軟件設計包含全長開放閱讀框（fulllength，FL）和不含預測信號肽的截短編碼區（nosignalpeptide，NS）目的基因引物，正反向引物前端加上合適的酶切位點及同源序列，用于載體構建;以稻瘟病菌菌株Guy11菌絲cDNA為模板，PCR擴增目的基因并進行瓊脂糖凝膠檢測和純化回收;對pSUC2和pYBA1132載體相應酶切位點進行雙酶切，膠回收后分別與MoIeep1基因不同片段重組連接并轉化至大腸桿菌感受態細胞中，挑取適量單克隆菌落進行PCR 篩選和測序驗證;確認序列準確的單菌落經擴大培養后提取質粒，-20℃保存備用。引物合成和測序由北京擎科生物技術公司完成。

1.2.2 效應蛋白轉錄分析

參照吳立葉等的稻瘟病菌菌絲和孢子樣品收集方法，獲得Guy11新鮮菌絲和孢子樣品，液氮速凍，-80℃保存備用。噴霧接種法將Guy11分生孢子接種于生長1周的大麥葉片背面，分別在接種后2h（芽管形成階段）、8h（附著胞形成階段）、18、24、42h撕取葉片下表皮，液氮速凍，-80℃保存備用。

TRIzol法提取稻瘟病菌Guy11菌絲、孢子及不同侵染時期大麥樣品總RNA，獲得的總RNA 用全式金生物公司RNA 反轉錄試劑盒合成cDNA 作為熒光定量PCR（qRTPCR）模板。本試驗使用引物見表1。內參基因MoActin（MGG_03982）作為對照，基因表達量用相對閾值法（2^-ΔΔCT）計算，軟件GraphPadPrism5分析并作圖。

1.2.3 效應蛋白生物信息學分析

利用SignalP（http：∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP5.0/）在線平臺預測MoIEEP1氨基酸序列信號肽的有無和具體位置;WoLFPSORT（https：∥wolfpsort.hgc.jp/）在線平臺預測MoIEEP1在植物中的亞細胞定位。網站預測過程中，均需首先輸入MoI

EEP1氨基酸序列Fasta格式，信號肽分析選擇“Organismgroup”為“Eukarya”，亞細胞定位分析選擇相應物種類型為“Plant”，然后直接提交即可獲得預測結果。

1.2.4 效應蛋白信號肽驗證

LiAc法制備酵母突變體菌株YTK12感受態細胞，并將構建好的含有目的基因MoIeep1的pSUC2載體質粒進行轉化。挑取轉化成功的酵母單克隆于SD/T液體培養基中，28℃，180r/min過夜培養。當OD₆₀₀達到0.8時，菌液稀釋1000倍劃線于蔗糖篩選培養基上，觀察酵母菌株在培養基上的生長情況。

1.2.5 效應蛋白亞細胞定位驗證

高滲透壓下，利用以纖維素酶和果膠酶為主要成分配制的酶解液消化生長10d的‘日本晴水稻黃化苗細胞壁，使之結構松散破壞;隨后移除酶解液，用普通滲透壓，濃度為0.6mol/L的緩沖液使細胞吸水，原生質體沖破細胞壁釋放出來，離心收集原生質體。再將構建好的含有目的基因MoIeep1的pYBA1132載體質粒轉化到水稻原生質體中，光照培養箱28℃，L∥D=12h∥12h條件下孵育48h后，激光共聚焦顯微鏡觀察。

1.2.6 MoIeep1基因敲除突變體的構建

依據改進的SplitPCR方法進行目的基因敲除。首先根據稻瘟病菌犕狅犐犲犲狆1基因組DNA 序列信息，設計兩輪PCR 擴增引物;然后以稻瘟病菌Guy11基因組DNA 為模板，LBCK/LBR和RBF/RBCK兩對引物，分別擴增目的基因上游LB 片段和下游RB片段，并以pCX62載體為模板，HYGF/HYGR擴增完整潮霉素（HYG）基因;再分別以片段LB和HYG共同作為模板，LBF和HYGR1為引物，擴增出片段LB+HY，以片段RB和HYG 共同作為模板，HYGF1和RBR為引物，擴增出片段YG+RB;最后將兩個DNA 融合片段共同轉化至稻瘟病菌Guy11原生質體;用含有潮霉素抗性的培養基篩選轉化子并進行DNA 和RNA 水平的驗證，最終獲得陽性敲除菌株。

1.2.7 MoIeep1突變體生長表型分析

用孔徑6mm 打孔器從生長一周左右的稻瘟病菌野生型菌株Guy11和2個MoIeep1敲除突變體菌落邊緣取同等大小的菌塊，同時接種于完全培養基（CM）正中央，28℃黑暗培養7d后觀察菌落生長形態并測量菌落直徑。

1.2.8 MoIeep1突變體致病力檢測

稻瘟病菌野生型菌株Guy11和突變體菌株于25℃養菌室暗培養3d后恢復光照，7～10d后產生大量孢子。用0.05%的Tween20水溶液洗下分生孢子，并調整孢子懸浮液濃度為1.5×10⁵個/mL，再均勻噴施在三葉一心期‘CO39水稻葉片上，避免孢子懸浮液液滴凝聚，影響接種效果。接種后于植物光照培養箱中26～28℃，覆膜黑暗保濕培養24h，然后恢復正常光照，溫度不變，光照和黑暗各12h，濕度為80%～90%，7d后調查病情并統計病斑密度。即統計葉片上一定面積的病斑數，計算不同病原菌接種后的平均病斑數（個/cm²）。

2 結果與分析

2.1 稻瘟病菌效應蛋白基因MoIeep1轉錄分析

稻瘟病菌侵染水稻過程中，黏附在水稻表面的分生孢子先產生芽管，再逐漸分化出一種特殊的圓頂狀休眠結構———附著胞，附著胞通過積累高濃度的相容性溶質產生巨大的膨壓，細胞膨壓再轉換成機械動力，促使侵染釘穿透葉角質和表皮細胞壁。稻瘟病菌侵染早期表達的效應蛋白更有可能與致病性相關。我們利用qRTPCR 技術，驗證了稻瘟病菌MoIeep1 在不同生長和侵染時期的表達水平。如圖1所示，MoIeep1在侵染初期8h（附著胞形成階段）表達量最高，而在菌絲、孢子等營養生長階段表達量較低，侵染寄主8h后的表達量呈逐漸降低趨勢。推測該基因可能在稻瘟病菌被寄主植物識別或進行活體營養侵染階段發揮重要作用。

2.2 稻瘟病菌效應蛋白犕MoIEEP1信號肽分析與驗證

信號肽是真菌效應蛋白N端的一段氨基酸序列，使效應蛋白在病原菌入侵寄主植物時具有分泌性。首先利用SignalP在線分析軟件預測了MoIEEP1蛋白的信號肽，結果表明，該蛋白N端氨基酸序列具有信號肽，且其信號肽切割位點為17/18（圖2）。隨后構建了2個MoIeep1基因的pSUC2（含蔗糖轉化酶基因）轉化質粒并分別轉化到酵母突變體菌株YTK12中。YTK12菌株不含蔗糖轉化酶基因，僅能在YPD培養基上生長，而不能在以蔗糖為唯一碳源的篩選培養基上生長。試驗結果表明（圖3），轉化Avr1b_pSUC2（陽性對照）的YTK12菌株能在蔗糖篩選培養基上正常生長，但含有mg87_pSUC2（陰性對照）的YTK12菌株因mg87不具有分泌性，不能在蔗糖篩選培養基上生長。含MoIEEP1_FL_pSUC2序列的菌株能在蔗糖篩選培養基上生長，而含MoIEEP1_NS_pSUC2序列的菌株不能在蔗糖篩選培養基上生長，說明該效應蛋白含有信號肽序列，為分泌蛋白。

2.3稻瘟病菌效應蛋白犕狅犐犈犈犘1亞細胞定位分析與驗證

病原菌效應蛋白在水稻細胞中的亞細胞定位與其功能的發揮密切相關。采用WoLFPSORT軟件對MoIEEP1蛋白進行亞細胞定位分析。該軟件數據庫來源于UniProt網站，分為真菌、植物和動物3個方面，各包含2113、2333和12771個蛋白質?；诜诸愋盘枴被峤M成和功能修飾（如DNA結合基序），WoLFPSORT將蛋白質氨基酸序列轉換為數字定位特征，然后使用k近鄰分類法預測其亞細胞定位。預測結果以兩種方式顯示：Ⅰ）與查詢序列最相似定位特征的已知定位蛋白質個數;Ⅱ）關于各個已知定位蛋白的詳細特征信息。如表2、表3所示，該軟件共篩選到14個MoIEEP1最相似定位蛋白。其中與定位在內質網、內質網和質膜、過氧化物酶體、細胞質和過氧化物酶體中的相似蛋白質個數相等且最多;其次是葉綠體和細胞外基質。所以MoIEEP1蛋白極有可能定位在內質網或過氧化物酶體等細胞器。激光共聚焦觀察亞細胞定位結果顯示：MoIEEP1蛋白質全長或去信號肽均在水稻原生質體中呈明亮點狀的定位信號，排除內質網定位，初步推測該定位信號為過氧化物酶體或線粒體等細胞器（圖4）。該結果與軟件預測內容相互輔正，可信度較高。

2.4 MoIeep1基因敲除突變體的獲得

本研究利用SplitPCR方法構建MoIeep1基因敲除突變體。通過兩輪PCR 擴增待敲除基因兩側的同源片段分別融合部分潮霉素基因，再將兩個DNA片段直接轉化至稻瘟病菌Guy11原生質體，兩個片段經過同源重組構成完整的潮霉素基因，進而替換目的基因，獲得陽性敲除菌株（圖5a）。整個試驗過程操作方便，轉化效率高。潮霉素抗性培養基上篩選的陽性轉化子，需分別提取菌絲DNA 和RNA進一步驗證。DNA水平上，目的基因內部引物MoIEEP1NF/NR和基因上下游1.5kb處的正反向引物UA/DB 與潮霉素基因的正反向引物H708/H853同時驗證（圖5b）;RNA水平上，僅用基因內部正反向引物鑒定即可（圖5c）。結果如圖所示。本試驗成功獲得2個目的基因敲除突變體，后續試驗中分別命名為MoIEEP1KO1、MoIEEP1KO2。

2.5 MoIeep1敲除突變體表型鑒定

生長表型方面，稻瘟病菌野生型菌株Guy11和MoIeep1敲除突變體在CM 培養基生長一周的表型如圖6所示，突變體和野生型在菌落形態和生長速率方面無明顯差異，和圖7中菌落生長直徑測量結果一致，表明MoIeep1基因可能不直接參與稻瘟病菌的營養生長過程;致病性方面，水稻葉片發病情況和病斑密度統計結果見圖8和圖9，相比于野生型菌株，MoIeep1敲除突變體致病性輕微減弱。因此，該基因可能對稻瘟病菌的致病性產生一定的影響。

3 討論

稻瘟病是最具破壞性的植物病害之一，每年可造成10%～30%的產量損失，嚴重時甚至造成顆粒無收，俗稱水稻的癌癥。目前，施用化學農藥和培育抗性品種是防治稻瘟病的主要方法。隨著生態環境建設思想的貫徹執行和人民綜合素質的不斷提高，化學農藥的使用逐漸減少，水稻抗性品種的選育和種植成為最經濟有效的措施。深入了解水稻和稻瘟病菌的分子互作機制，有助于培育更加優質高效的水稻抗病品種。稻瘟病菌是最早完成全基因組測序的病原真菌。Dean等解析了稻瘟病菌實驗室菌株70-15總長度38.8Mb的序列，分析表明其含有11109個預測基因，其中包含1032個編碼分泌蛋白的基因。事實上，稻瘟病菌侵染水稻是一個復雜的過程，大量分泌蛋白參與其中。例如，稻瘟病菌犕犆96基因編碼一個分泌蛋白。研究顯示，該基因突變后，不僅會顯著降低其致病性，而且會影響稻瘟病菌侵染菌絲的擴展。Mosquera等研究表明，真菌侵染早期分泌的效應蛋白具有較高的研究價值。已發表的稻瘟病菌犌犃犛1和犌犃犛2基因在附著胞形成過程中特異表達且編碼蛋白定位于細胞質，預測有信號肽，表示它們可能從附著胞移動到侵染菌絲，或運送到寄主植物細胞內發揮作用;Catanzariti等還通過篩選亞麻銹菌吸器cDNA文庫，鑒定了21個特異表達的分泌蛋白。因此，本研究對在稻瘟病菌侵染初期8h誘導表達的MoIeep1基因進行了初步的功能鑒定和分析，期望為進一步開展該基因在后續水稻稻瘟病菌分子互作機制研究中提供借鑒。

信號肽位于分泌蛋白的N 端，引導分泌蛋白離開其合成所在的細胞到其他組織細胞。侵染寄主植物期間，病原真菌分泌蛋白干擾寄主免疫防衛反應。本研究采用酵母系統驗證目的基因的信號肽。酵母是一種高效真核表達體系，本身含有較少的分泌蛋白，且酵母suc2基因編碼蔗糖轉換酶，可在以蔗糖為唯一碳源的篩選培養基上生長，而酵母突變體菌株YTK12因缺乏suc2基因，不能將蔗糖或棉籽糖轉化為可直接吸收利用的單糖，因此不能在蔗糖或棉籽糖培養基上生長。利用該特性，我們分別將含有全長和不含信號肽的MoIeep1基因的pSUC2載體（含有suc2基因）轉化至YTK12酵母突

變體菌株感受態細胞并挑取單菌落涂板，若該基因含有信號肽，則只有含有該基因全長的pSUC2載體（MoIEEP1_FL_pSUC2）可將蔗糖轉換酶分泌至胞外，并把培養基中的蔗糖轉化為葡萄糖或果糖，從而在蔗糖培養基上正常生長，而不含信號肽的pSUC2載體（MoIEEP1_NS_pSUC2）則不能在蔗糖培養基上生長。本文研究結果與該假設一致，表MoIeep1基因的信號肽具有分泌活性，可能通過分泌到胞外執行生物學功能。

蛋白質的合成在核糖體上進行，信號肽是蛋白質的一個片段。“信號假說”認為信號肽引導核糖體定位并附著于內質網上，并使不斷伸長的蛋白質鏈通過水溶性通道，隨后信號肽被切割，合成的蛋白質被釋放進內質網腔，隨蛋白分泌系統轉運到胞外。因此，信號肽不僅與蛋白質的分泌特性相關，也與蛋白質在細胞內的定位有關。近年來，原生質體瞬時表達系統廣泛應用于水稻功能基因組學研究。為進一步探究MoIEEP1效應蛋白在水稻細胞中的作用位點，結合在線平臺WoLFPROST 的亞細胞定位預測結果，將目的基因構建到含有綠色熒光蛋白基因的表達載體pYBA1132上并轉化至水稻原生質體細胞，激光共聚焦觀察。該方法可以保持效應蛋白的天然特性，靈敏度高，易于操作，試驗周期相對較短。試驗結果表明，該蛋白定位于水稻細胞的過氧化物酶體或線粒體上，初步證明MoIEEP1可能通過影響寄主植物過氧化物酶體或線粒體上的蛋白受體或其他抗性相關蛋白，進而調控植物抗病反應。

4 結論

本研究首先通過轉錄分析MoIeep1基因在稻瘟病菌野生型菌株Guy11菌絲、孢子和不同侵染時期的表達量，發現其在侵染初期8h表達量最高;信號肽和亞細胞定位分析結果表明MoIEEP1N 端含有17個氨基酸的信號肽，為分泌蛋白且定位于水稻細胞過氧化物酶體或線粒體上;通過構建MoIeep1基因敲除突變體，證明其與稻瘟病菌野生型Guy11相比在生長表型方面無明顯差異，但影響其致病性。因此推測該基因可能參與調控稻瘟病菌的致病性。