進境澳大利亞大麥夾雜油菜莖基潰瘍病菌的檢疫鑒定

張慧麗　李雪蓮　陳先鋒等

中圖分類號：S 41-32 文獻標識碼：A DOI： 10.16688/j.zwbh. 2020106

油菜莖基潰瘍病菌Leptosphaeria maculan3于2007年被列入《中華人民共和國進境植物檢疫性有害生物名錄》，是一種檢疫性真菌。目前，在北美洲的加拿大和墨西哥，南美洲的巴西，大洋洲的澳大利亞，歐洲的英國、法國、德國等國家均有分布，但在中國、日本、韓國和俄羅斯等國家還未見發(fā)生危害的報道口]。導(dǎo)致加拿大、澳大利亞和歐洲地區(qū)油菜籽產(chǎn)量和質(zhì)量損失的主要原因就是油菜莖基潰瘍病的發(fā)生，一般年份可導(dǎo)致產(chǎn)量損失10%～20%，嚴重時產(chǎn)量損失可達30%～50%，甚至更高。油菜莖基潰瘍病菌在全世界導(dǎo)致的油菜每個生長季的損失超過9億美元。目前，我國口岸檢疫部門已經(jīng)從澳大利亞、烏克蘭、加拿大等進境的油菜籽，新西蘭進口的十字花科蔬菜種子中多次檢出該病菌，病菌傳人的風險不斷加劇。中國是油菜的起源地之一，油菜種植在我國已有上千年歷史，是我國種植面積最大的油料作物，也是國產(chǎn)植物油第一大油源，第二大飼用蛋白源。Fitt等用模擬模型預(yù)測了我國南方（長江流域）油菜種植區(qū)油菜莖基潰瘍病傳人后16年的流行趨勢，僅長江流域每年平均損失達4. 93億美元，同時還會對我國的十字花科野生植物構(gòu)成重大威脅。

油菜黑脛?。╞lack leg of oilseed rape）是油菜上最嚴重的真菌病害之一，引起該病害的病原至少有兩種：L.maculans和L.biglobosa。因檢疫工作的需要，L.biglobosa在油菜上引起的病害被稱為油菜黑脛病（black leg），L.maculans引起病害稱為油菜莖基潰瘍?。╬homa stem canker）。油菜莖基潰瘍病菌危害油菜莖基部，致病力強，危害重，是引起油菜產(chǎn)量損失的主要因素，迄今該病菌在我國未見分布。油菜黑脛病菌致病性弱，引起莖中上部發(fā)病，在我國已有發(fā)生報道。這兩種病菌都屬于真菌界Fungi、子囊菌門Ascomycota、格孢腔菌目Pleosporales、小球腔菌科Leptosphaeriaceae、小球腔菌屬Leptosphaeria。目前，根據(jù)rDNA基因間隔序列（ITS）、β-tubulin（ TUB）和actin（ACT）序列分析，油菜莖基潰瘍病菌種下包括2個亞種，分別是：L.maculans subsp.brassicae（寄主為蕓薹屬Brassica栽培植物）和L.maculans subsp. lepidii（寄主為獨行菜屬Lepidium植物）。油菜黑脛病菌種下包括6個亞種，分別是：L.biglobsa subsp.brassicae、L.biglobsa subsp. thlaspii、L.biglobosasubsp. erysimii、L.biglobosa subsp. canadensis、L.biglobosa subsp.australiensis和L.biglobsa subsp.occiaustralensis.

油菜莖基潰瘍病菌的形態(tài)特征受環(huán)境、培養(yǎng)基和外部條件影響，變化極大。僅用形態(tài)學特征無法鑒定油菜莖基潰瘍病菌。由于油菜莖基潰瘍病在全球貿(mào)易中的重要性，快速、簡便地檢測油菜莖基潰瘍病的發(fā)生和發(fā)展對控制該病的傳播和保證油菜籽的品質(zhì)至關(guān)重要。Mahuku等根據(jù)ITS序列設(shè)計特異引物HV17S/HV26C，對安大略湖油菜田塊油菜莖基潰瘍病菌分布進行了調(diào)查;Liu等基于ITS序列設(shè)計特異性引物，通過產(chǎn)物片段大小來區(qū)分L.maculans和L.biglobosa。周國梁等、易建平等和陳青等采用特異性引物擴增結(jié)合ITS基因序列分析分別從澳大利亞進口的油菜籽、新西蘭的青菜種子中成功檢測到油菜莖基潰瘍病菌。Fernando等采用Liu等設(shè)計的異性引物對加拿大油菜種子和油菜籽黑脛病的感染水平進行了評估。周國梁等根據(jù)ITS區(qū)序列設(shè)計了Taq-Man MGB探針，建立了該病菌的實時熒光PCR檢測方法。Song等根據(jù)ITS序列設(shè)計了2對引物，建立了油菜莖基潰瘍病菌巢式PCR檢測方法。周圓等根據(jù)ITS序列差異，建立了油菜莖基潰瘍病菌環(huán)介導(dǎo)等溫擴增一橫向流動試紙快速檢測方法。上述檢測技術(shù)均是建立在ITS序列分析基礎(chǔ)之上，表明ITS序列能夠有效鑒定劃分油菜莖基潰瘍病菌。

2019年3月，寧波口岸從一批進境的澳大利亞大麥中發(fā)現(xiàn)夾雜有大量油菜籽，挑選形態(tài)異常的油菜籽進行分離培養(yǎng)后，獲得1株疑似油菜莖基潰瘍病菌的分離物，對其進行了致病性測定、形態(tài)學觀察、基因序列比對分析研究，以期在準確鑒定該分離物種類的基礎(chǔ)上，對其危害進行評估，為口岸檢疫鑒定、后續(xù)疫情防控及相關(guān)研究工作奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1供試樣品

供試油菜籽為2019年3月進境澳大利亞大麥中夾雜的油菜籽。致病性測定用的油菜籽為市售油菜種子。

1.2培養(yǎng)基及主要試劑

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，含有氯霉素100μg/mL，杭州微生物試劑有限公司，用于病菌分離、純化和保存。

TANBead Plant DNA Auto Kit，臺灣TANBead公司;2×Taq MasterMix，北京康為世紀生物科技有限公司;100 bp DNA Marker，寶生物工程（大連）有限公司;其他試劑均為分析純;引物由北京六合華大基因科技有限公司合成。

1.3儀器

BX-51型生物顯微鏡，日本Olympus公司;AxioImager Z1型顯微鏡數(shù)碼成像系統(tǒng)、Discovery V12型解剖鏡及其成像系統(tǒng)，德國Zeiss公司;Friocell222型培養(yǎng)箱，德國MMM公司;Kingfisher mL核酸自動化提取儀、Multiskan G（）生物分光光度計，美國Thermo Scientific公司;TProfessional Basic型PCR儀，德國Biometra公司;PowerPac Basic型電泳設(shè)備和GelDocEQ型凝膠成像系統(tǒng)，美國伯樂生命醫(yī)學產(chǎn)品有限公司。

1.4病原菌的分離與純化

從大麥中挑選畸形、變色等外觀不正常的油菜籽，采用常規(guī)真菌分離方法對油菜籽進行病原菌分離。1%次氯酸鈉表面消毒3min，無菌水漂洗3次，在滅菌濾紙上吸干水分后，置于PDA平板培養(yǎng)基上，每皿放10粒，25℃黑暗培養(yǎng)，待長出菌落后，挑取邊緣菌絲進行純化，純化后菌株編號為01829。

1.5分離病原菌菌株的致病性測定

選取健康的油菜籽播種于育苗盤中，置于溫度25'C左右、日光條件下育苗間培養(yǎng)。分別在長出2片子葉和真葉后采用針刺法進行菌株01829的致病性測定。用70%乙醇擦拭子葉和莖基部進行表面消毒后，用經(jīng)酒精燈燒過冷卻后的0號昆蟲針點刺子葉和莖基部，取PDA培養(yǎng)基上培養(yǎng)6d的菌落，用直徑5mm打孔器在菌落邊緣打取菌餅，將菌餅有菌絲面放置在刺傷處，上覆蘸有無菌水的滅菌脫脂棉保濕，接種后置于塑料收納箱內(nèi)并扣上蓋，25℃室溫條件下培養(yǎng)。以接種無菌PDA為對照，每處理3次重復(fù)。接種后每天觀察并記錄發(fā)病情況。

1.6分離病原菌菌株的形態(tài)觀察

將純化的菌株01829接種于直徑9 cm的PDA平板培養(yǎng)基上，25℃黑暗培養(yǎng)14 d后，觀察記錄其菌落形態(tài)特征。將PDA平板上的供試菌，在解剖鏡下觀察分生孢子器，挑取分生孢子器制片后在顯微鏡下觀察分生孢子器和分生孢子的形態(tài)特征，并對其大小進行測量。

1.7分離病原菌菌株的分子生物學研究

1.7.1基因組DNA提取

用滅菌槍頭刮取在PDA平板培養(yǎng)基上培養(yǎng)10 d的01829菌絲體，用TANBead Plant DNA Auto Kit在KingFisher mL核酸自動化提取儀上提取病原菌總DNA。提取后DNA經(jīng)分光光度計測定濃度后，保存于-20℃冰箱備用。

1.7.2特異性引物PCR檢測

參照出入境檢驗檢疫行業(yè)標準SN/T 3685-2013《油菜莖基潰瘍病菌檢疫鑒定方法》中的PCR方法，采用特異性引物LMRl-D（5′-GCGTAAGAAGCGTGCCTTAGAGTC-3′/5′-TCCTGCT-CCTACTCCTTCTCTAGC-3′）和Lmb（5′-CACCAATTGGATCCCCTA-3′/5′-AGGCGAGTCCC-AAGTGGAACA-3′），對菌株01829的總DNA進行PCR擴增。擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，用凝膠成像系統(tǒng)觀察電泳結(jié)果。

1.7.3序列擴增和測序

采用ITS通用引物ITS1/ITS4對菌株01829總DNA進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，產(chǎn)物送上海華大基因科技有限公司進行雙向測序。

1.7.4序列分析

測得的ITS序列在NCBI網(wǎng)站上進行BLAST比對分析，確認序列的可靠性。使用MEGA 6.0軟件對測得的ITS序列與GenBank中下載的油菜莖基潰瘍病菌及其近似種的ITS序列進行比對，以GenBank上下載的草莖點霉Phoma herbarum的相關(guān)序列為外群，采用鄰接法（neighbor-joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)進化發(fā)育樹，進行1000次重抽樣訴計算系統(tǒng)樹中節(jié)點的置信度。

2結(jié)果與分析

2.1菌株01829的菌落性狀和形態(tài)特征

菌落生長速度較慢，邊緣不整齊，菌絲呈白色放射狀，多而致密，分枝較多，有分隔（圖1a～b）。分生孢子器褐色至深褐色，球形至扁球形（圖1d），散生、埋生或半埋生于菌絲中，直徑133～334μm，擠壓后釋放大量分生孢子。分生孢子無色透明，橢圓形或紡錘形，兩端各見1油球，大?。?. 6～6.8）μm×（0.9～2.1）μm（圖1c）。L.biglobosa在PDA培養(yǎng)基上產(chǎn)生黃色色素，菌絲白或微黃;而L.maculans在PDA培養(yǎng)基上無色素產(chǎn)生，菌絲白色，分枝較多;結(jié)合孢子大小和文獻報道，初步判斷菌株01829疑似L.maculans。

2.2菌株01829致病性測定結(jié)果

油菜子葉接種01829菌株2d后開始發(fā)病，接種點附近出現(xiàn)圓形枯死斑，淺褐色，稍凹陷。對照沒有產(chǎn)生上述癥狀（圖2a）。油菜莖基部接種01829菌株4d后在接種點附近出現(xiàn)褐色病斑，病斑不斷擴大，在莖基部形成凹陷的潰瘍斑（圖2b）。對照沒有產(chǎn)生上述癥狀（圖2c）。經(jīng)再次分離培養(yǎng)和ITS序列測定，獲得了與01829形態(tài)和ITS序列一致的菌株。

2.3菌株01829的特異性引物PCR檢測

用油菜莖基潰瘍病菌特異性引物對Lmb對分離物01829的DNA進行PCR檢測，結(jié)果擴增得到了約為270bp的預(yù)期擴增產(chǎn)物，無非特異性條帶（圖3）。特異性引物對LMR1-D擴增得到了約為580 bp的預(yù)期擴增產(chǎn)物，但有明顯的非特異性條帶，這與王振華等的結(jié)果有所不同。

2.4菌株01829 ITS序列分析

經(jīng)引物ITS1/ITS4擴增后獲得長度為511 bp的ITS片段，GenBank序列登錄號為MT138669。在GenBank中對該序列進行BLAST搜索和比對分析，發(fā)現(xiàn)該序列與油菜莖基潰瘍病菌（GenBank登錄號：DQ458907）ITS序列的相似性為99. 61%;與6個L.maculans subsp. brassicae的ITS序列相似性為99.14%～99. 36%;與1個L.maculans subsp. lepidii的ITS序列相似性為94. 91%。進一步通過ITS系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn)菌株01829的ITS序列與L.maculanssubsp. brassicae的相關(guān)序列聚在同一個分支上（boot strap值為99），而L.maculans subsp.lepidii則位于另一個分支（圖4）。序列分析及系統(tǒng)發(fā)育分析表明菌株01829為L.maculans subsp. brassicae。

3討論

油菜莖基潰瘍病菌無性態(tài)為Phoma lingam，其典型形態(tài)特征為產(chǎn)生近球形分生孢子器和分生孢子。本研究中發(fā)現(xiàn)，該病菌只有在早期分離培養(yǎng)時，可以在培養(yǎng)基上產(chǎn)生分生孢子器，后期多次轉(zhuǎn)代后則難以產(chǎn)生。油菜莖基潰瘍病菌檢測技術(shù)有分離培養(yǎng)法和PCR方法，PCR以其快速、準確和靈敏的特點受到廣泛應(yīng)用。Taylor等根據(jù)一段重復(fù)序列LMR1（5238 bp）設(shè)計特異引物LMR1-D，建立了檢測油菜莖基潰瘍病菌的PCR方法，王振華等利用該方法從加拿大進口油菜籽中檢測到油菜莖基潰瘍病菌，但是在本研究中，特異性引物對LMR1-D的擴增產(chǎn)物有明顯的非特異性條帶，通過調(diào)整退火溫度也未能消除。本研究采用了口岸日常檢測工作中使用的行業(yè)標準SN/T 3685-2013中提供的2對特異性引物對檢測樣品進行PCR檢測。結(jié)果表明，引物對Lmb擴增特異性優(yōu)于引物對LMR1-D，這一結(jié)果為口岸檢測人員提供了參考。從基于ITS序列構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育樹上可以看出，L.maculans subsp.brassicae和L.maculans subsp. lepidii各成一個分支，01829與多個不同地理來源（荷蘭、加拿大、英國、美國、澳大利亞）的L.maculans subsp. brassi-cae位于同一個分支中，且與多個來自澳大利亞的分離物聚在同一個分支，這與01829來自澳大利亞是一致的。本研究獲得分離物為L.maculans subsp.brassicae。除油菜莖基潰瘍病菌外，我們也從該批大麥夾雜油菜種子上檢出了油菜黑脛病菌L.biglo-b03a，據(jù)文獻報道這兩種病菌在澳大利亞均有分布。為提高檢測工作針對性，實際檢測工作中可采用PCR方法對油菜籽進行初篩，在此基礎(chǔ)上再進行分離培養(yǎng)和鑒定工作。

澳大利亞農(nóng)業(yè)生產(chǎn)是雨養(yǎng)農(nóng)業(yè)，無灌溉設(shè)施，作物單產(chǎn)變幅較大，作物輪作模式的研究是澳大利亞農(nóng)業(yè)研究的主要內(nèi)容。油菜對谷類作物根系病害以及單子葉雜草等有明顯的控制效果，是輪作系統(tǒng)中的理想“中斷作物”。因此，澳大利亞在同一田塊上每4年以上種1次油菜。輪作順序依次是：豆科牧草——闊葉作物（油菜）——谷類作物（小麥）——闊葉作物（羽扇豆、豌豆等）——谷類作物（大麥）。正是由于生產(chǎn)上集中連片種植和全程機械化，導(dǎo)致油菜籽可能夾雜在澳大利亞出口的各種輪作作物中。據(jù)段維軍等統(tǒng)計，自從2009年11月上海和江蘇口岸首次截獲該病菌以來，截止2016年，全國口岸共截獲該病菌626次。來源國包括：加拿大、澳大利亞、法國、日本、瑞典、荷蘭、美國、烏克蘭。貨物種類包括：油菜籽、小麥、豌豆、大豆、青菜種子、甘藍種子等。說明攜帶這種檢疫性病菌的油菜籽通過夾雜在其他作物中進行傳播的可能性較高。帶菌種子是該病害遠距離傳播的主要方式，據(jù)Hall等和汪國平等的研究，種植油菜種子攜帶油菜莖基潰瘍病菌的頻率平均為0. 5%～0.6%，盡管在種植當年損失不足1%～2%，但不斷積累的菌源將對油菜生產(chǎn)構(gòu)成巨大威脅。因此，在日常檢疫中對夾雜的油菜籽必須加以重視。

以往口岸檢疫研究多針對進口貨物本身，對其中夾雜物的研究較少。但是，進境貨物夾雜物中攜帶多種病菌的可能性很大。近年來，口岸部門已多次從進境大宗糧油貨物夾雜物中截獲多種檢疫性真菌，如：自烏克蘭玉米夾雜的向日葵種子中截獲向日葵莖潰瘍病菌Diaporthe helianthi;自法國大麥夾雜的向日葵種子中截獲大麗輪枝菌Verticilliumdahliae;自美國大豆夾雜的向日葵種子中截獲向日葵莖潰瘍病菌和向日葵黑莖病菌Plenodomuslindquistii等。這些截獲表明：進境大宗糧油貨物夾雜物中攜帶檢疫性真菌可能性較高，口岸檢疫部門應(yīng)予以高度關(guān)注，加強防范，以防檢疫性病原通過這種方式跨境傳播。