南瓜炭疽病菌Colletotrichum brevis porum生物學特性及藥劑防治

張琳　彭琳　邵郅偉等

中圖分類號：S 436. 429 文獻標識碼：A DOI：10.16688/j. zwbh. 2020115

南瓜Cucurbita moschata是一種富含β-胡蘿卜素和抗衰老物質的健康食物，并且南瓜在結籽期會產生豐富的礦物質，比如鋅。南瓜原產墨西哥到中美洲一帶，明代傳入我國，現南北各地廣泛種植。炭疽病是南瓜上的一種重要病害，主要發生在南瓜的葉、莖、花等部位，造成爛葉、爛果或死苗，造成嚴重的經濟損失。

以前，普遍認為Colletotrichum orbiculare是引起瓜類炭疽病的病原菌，且在黃瓜、西瓜、長瓜、蜜瓜和苦瓜上均發現該種炭疽病菌的危害。2015年，在‘綠皮香栗23號南瓜上，發現了與之不同的炭疽病菌Colletotrichum brevisporum。本試驗對該病原菌生物學特性進行研究，并對13種殺菌劑進行室內毒力測定，以期為該種瓜類炭疽病的預防和治療提供理論與實踐依據。

1材料與方法

1.1供試菌株

南瓜炭疽病菌C.brevisporum（菌株編號為CCCM12）來源于吉林農業大學植物病理綜合治理實驗室菌種庫，病原菌以菌絲體的形式存于干燥濾紙片上，濾紙片置于滅菌硫酸紙袋內保持密封和干燥，保存于-20℃。

1.2供試培養基

生物學特性測定所用培養基：馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基（PDA），配方為馬鈴薯200g，葡萄糖20 g，瓊脂20g;查氏培養基，配方為氯化鉀0.5g，磷酸氫二鉀1g，硝酸鈉2g，硫酸鐵0.01g，七水合硫酸鎂0.5g，蔗糖30g，瓊脂20g，均用蒸餾水補足至1000mL備用。SNA培養基，配方為硝酸鉀0.1g，磷酸二氫鉀1.0g，七水合硫酸鎂0.5g，氯化鉀0.5g，蔗糖0.2g，葡萄糖0.2g，瓊脂15g，蒸餾水補足至1000mL備用。

1.3試劑及儀器

試驗采用日本TaKaRa公司生產的10 mmol/LdNTPs、Taq酶、PCR Buffer等;生工生物工程（上海）股份有限公司生產的25mmol/L MgCl₂;其他試劑均為國產分析純。試驗中使用的儀器為日本HITACHI公司生產的CT15RE臺式微量高速離心機;基恩士（中國）有限公司生產的超景深三維顯微系統VHX-600;美國BI0-RAD公司生產的C1000Touch Thermal cycler PCR擴增儀。

1.4病原菌生物學特性測定

1.4.1病原菌寄主范圍測定

利用針刺接種法，供試南瓜炭疽病菌CCCM12在PDA上培養7d，用滅菌的8mm打孔器在菌落邊緣打取菌餅，選用儲藏期新鮮南瓜、辣椒Capsicum annuum、紫甘藍Brassica oleracea、火龍果Hylocereus undatus、西葫蘆Cucurbita pepo、青椒Capsicum annuum、黑布林Prunus salicina、紅布林Prunus salicina、大白菜Brassica rapa pekinen-sis、木瓜Chaenomeles sinensis、西瓜Citrullus lana-tus、甜瓜Cucumis melo、黃瓜Cucumis sativs和芒果Mangifera indica等14種供試植物進行致病性測定。利用無菌針頭刺傷植物果實表面，取直徑為8mm的菌餅接種，在同一個植物組織的一半接種CCCM12菌餅，另一半接種空白PDA作為對照。每處理接種5個植物組織，3次重復，接種7d后觀察發病情況。

1.4.2病原菌菌絲致死溫度的測定

將直徑為8mm的南瓜炭疽病菌CCCM12菌株菌餅接至無菌試管中，加入2 mL滅菌水，置于35、40、45、50、55、60℃的水浴中加熱10 min，然后接種于PDA平板中央，25℃光照培養，5d后用十字交叉法測量菌落直徑，每個處理接種5皿，每處理3次重復。

1.4.3溫度對病原菌生長的影響

用打孔器打取直徑8mm的菌餅，接至PDA平板中央，分別在5、10、15、20、25、30、35、40℃的恒溫條件下培養，觀察菌絲生長情況，并在5d后采用十字交叉法測量菌落直徑，每個處理接種5皿，每處理3次重復。

1.4.4光照對病原菌生長的影響

將直徑為8mm的病原菌菌餅接至PDA平板中央，將平板分別置于連續光照、12 h光暗交替、連續黑暗的人工氣候培養箱中，25℃恒溫培養，5d后用十字交叉法測量菌落直徑，每個處理接種5皿，每處理3次重復。

1.4.5 pH對病原菌生長的影響

用1mol/L HCl和1mol/L NaOH調節PDA培養基的pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0、12.0，向上述不同pH平板（15mL/皿）中移入菌餅（直徑8mm），25℃C恒溫培養。5d后，十字交叉法測量菌落直徑，每個處理接種5皿，每處理3次重復。

1.4.6碳源對病原菌生長的影響

以查氏培養基為基礎培養基，分別用含等質量碳元素的葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、可溶性淀粉、甘油和甘露醇作為碳源，以不加碳源的查氏培養基為對照（CK），每皿定量15mL培養基。待培養基凝固后，將直徑8mm的菌餅接至含不同碳源的平板上，25℃條件下培養5d后采用十字交叉法測量菌落直徑，每個處理接種5皿，每處理3次重復。

1.4.7氮源對病原菌生長的影響

以查氏培養基為基礎培養基，分別用含等質量氮元素的蛋白胨、牛肉膏、L-丙氨酸、L-胱氨酸、L-精氨酸、DL-甲硫氨酸、賴氨酸、硝酸鉀和硝酸銨作為氮源，以不加氮源的查氏培養基為對照（CK），每皿定量15mL培養基。待培養基凝固后，將直徑為8mm菌餅接至含不同氮源的平板上，25℃條件下培養5d后采用十字交叉法測量菌落直徑，每個處理接種5皿，每處理3次重復。

1.5藥劑室內毒力測定

1.5.1供試菌株及藥劑

供試菌株為南瓜炭疽病菌CCCM12。供試藥劑共13種，均為原藥：97%醚菌酯，京博農化科技有限公司;95%氟環唑，沈陽科創化學品有限公司;95%腈菌唑、98%抑霉唑和96%咯菌腈，浙江禾本科技股份有限公司;95%福美雙，河北冠龍農化有限公司;96%甲基硫菌靈，江蘇藍豐生物化工股份有限公司;99. 6%吡唑嘧菌酯，巴斯夫歐洲公司;95%苯醚甲環唑和95%百菌清，利民化工有限責任公司;98.3%戊唑醇，江蘇龍燈化學有限公司;97%多菌靈，江蘇輝豐生物農業股份有限公司;95%己唑醇，江蘇萊科化學有限公司。其中，咯菌腈、醚菌酯和吡唑嘧菌酯原藥用乙腈溶解，其余藥劑原藥用丙酮溶解，均配制成質量濃度為1×10⁵mg/L的母液保存，用于室內毒力測定。

1.5.2試驗方法

采用菌絲生長速率法測定13種供試藥劑對南瓜炭疽病菌CCCM12菌絲生長的抑制活性。將預先配制好的藥劑母液用0. 1%的Tween-80水溶液稀釋后，各濃度梯度的藥液以1：9（V/V）的體積比與溶化的PDA培養基混勻，制成不同濃度藥劑的PDA平板。根據預試驗結果設置6個復篩濃度（表1），以加入等量Tween-80水溶液的PDA平板為空白對照，以加入溶劑的Tween-80水溶液的PDA平板為溶劑對照。將直徑為8mm的菌餅接種到含藥平板中央，每個處理接種5皿，置于25℃恒溫培養箱培養7d，用十字交叉法測量各處理的菌落直徑，計算相對抑制率。

相對抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/（對照菌落直徑-菌餅直徑）×100%。

1.6數據分析

利用（Xfice 2010對數據進行整理，結合DPS數據處理系統統計軟件求出抑制中濃度（EC₅₀）、置信區間等，比較不同殺菌劑對南瓜炭疽病菌的抑制作用。利用Duncan氏新復極差法進行處理間差異顯著性分析。

2結果與分析

2.1南瓜炭疽病菌CCCM12生物學特性測定

2.1.1寄主范圍測定結果

將南瓜炭疽病菌CCCM12采用針刺接種方法接種不同植物組織，7d后調查發現，炭疽菌CCCM12菌株對南瓜、辣椒、紫甘藍、火龍果、西瓜、香瓜、西葫蘆、青椒、黑布林、紅布林、大白菜、木瓜、黃瓜和芒果均有致病性（表2、圖1）。

2.1.2溫度對病原菌生長的影響

溫度對南瓜炭疽病菌CCCM12生長的影響顯著。菌絲在20～30℃生長較好，其中25℃菌絲生長最快，生長5d后的菌落直徑為59.5mm; 5℃時，菌株CCCM12在第2天開始生長，且生長緩慢，生長5d后的菌落直徑為18.5mm。

2.1.3光照對病原菌菌絲生長的影響

光照對南瓜炭疽病菌CCCM12菌絲生長影響顯著。南瓜炭疽病菌CCCM12在12h光暗交替條件下生長較好，在連續光照、連續黑暗、12 h光暗交替條件下培養5d，菌落平均直徑分別為55、62、65 mm（表3）。

2.1.4 pH對病原菌菌絲生長的影響

測量菌落直徑，不同pH條件對南瓜炭疽病菌CCCM12菌絲的生長影響顯著。南瓜炭疽病菌CCCM12菌絲生長適宜pH為6～9，菌落直徑范圍為54～61mm。最適pH=9，病原菌菌落直徑達到61. 67 mm（圖3）。pH為10～12，或pH=3，菌落直徑<42mm。

2.1.5病原菌菌絲致死溫度的測定

使用不同溫度的水浴處理南瓜炭疽病菌CCCM12的菌餅，結果表明，菌餅在35～45℃水浴處理10 min后，置于PDA平板上培養，5d后均可長出新的菌絲，而經50、55、60'C處理下，培養10 d后仍未觀察到菌絲生長，由此可知南瓜炭疽病菌CCCM12菌絲的致死溫度為sooc、10min。

2.1.6碳氮源對病原菌菌絲生長的影響

南瓜炭疽病菌CCCM12在7種不同碳源和9種不同氮源的培養基質條件下都能夠生長，但對不同碳、氮源的利用程度不同。在不同碳源中，病原菌對可溶性淀粉的利用效果最好，培養5d后菌落直徑為5. 17cm，顯著大于其他碳源處理，其次是甘油和葡萄糖，而對甘露醇、蔗糖、果糖和麥芽糖利用效果差。不同氮源中，菌株CCCM12對L-胱氨酸的利用效率最高，培養5d后的菌落直徑為2. 73cm，顯著大于其他氮源處理，其次為牛肉膏和DL甲硫氨酸，對硝酸銨利用效果較差，而對L-精氨酸利用效果最差，生長緩慢（表4）。

2.2殺菌劑對南瓜炭疽病菌CCCM12的抑制活性

室內生物活性測定表明（圖4和表5），南瓜炭疽病菌CCCM12對供試殺菌劑均有一定的敏感性，13種藥劑中，福美雙和百菌清對南瓜炭疽病菌的抑制效果較差，其EC50均大于20μg/mL（表5）。腈菌唑、己唑醇和吡唑醚菌酯對南瓜炭疽病菌的抑制效果一般，而多菌靈、抑霉唑、甲基硫菌靈毒力較高，EC₅₀分別為0.060 2、0.186 2、0.339 6μg/mL。

3討論

國內外關于南瓜炭疽病菌研究的報道較少。人們普遍認為Colletotrichum orbiculare是引起瓜類炭疽病的主要病原菌，寄主植物為西瓜、甜瓜和黃瓜等葫蘆科植物。而青皮南瓜作為C.brevispo-rum的寄主植物在2018年首次報道以來，其生物學特性及其藥劑防治研究尚未進行。

在寄主范圍測定中，C.brevisporum除了可使葫蘆科南瓜、西葫蘆、西瓜、甜瓜等植物致病，也可使十字花科辣椒、紫甘藍、青椒、大白菜等植物，仙人掌科火龍果，薔薇科黑布林、紅布林致病，寄主范圍較廣泛。在炭疽菌屬中，C.gloeosporioides的寄主范圍廣泛，是引起多種經濟作物炭疽病的病原菌，如芒果、枸杞、大棗和人參等的炭疽病，該種引起的病害一旦發生，防治特別困難，而C.brevisporum是與之完全不同的另一寄主范圍較廣泛的種，為了預防C brevisporum在田間暴發，本試驗開展其生物學特性和室內藥劑篩選研究。研究表明，C.brevisporum的菌絲生長適宜pH為6～9，最適pH=9;光暗交替利于菌絲生長;適宜溫度20～30℃;致死溫度50℃，10 min;適宜菌絲生長的最佳碳、氮源分別為可溶性淀粉和L-胱氨酸。采用菌絲生長速率法測定了13種殺菌劑對其的室內毒力，發現供試藥劑中效果較好的為多菌靈、抑霉唑和甲基硫菌靈。目前，南瓜炭疽病的發生范圍逐年擴大，而篩選合適的化學農藥迫在眉睫。本研究可為合理選擇田間化學農藥及合適的施用濃度提供依據，并為今后研究該病的抗藥性機制提供理論依據。