蛻皮激素對黑化黏蟲體液免疫的影響

張乃元　張蕾　程云霞等

中圖分類號：S 433.4 文獻標識碼：A DOI：10.16688/j.zwbh. 2020225

外界微生物時刻威脅著昆蟲的存活，因此免疫系統在昆蟲的生長發育過程中至關重要。先天免疫系統是昆蟲的主要免疫系統，主要由細胞免疫和體液免疫組成。體液免疫中酚氧化酶（phenol oxi-dase，PO》和溶菌酶（lysozyme）是免疫關鍵酶，PO和溶菌酶活性是免疫反應的重要指標。昆蟲免疫系統受內分泌系統調節，內分泌激素在昆蟲的免疫反應中起重要的調節作用。昆蟲體內主要的內分泌激素是保幼激素（juvenile hormone，JH）和蛻皮激素（molting hormone，MH），它們在昆蟲的生長過程中不僅可以聯合調控昆蟲的變態、遷飛和繁殖，而且在昆蟲的免疫系統中也有非常重要的調控功能。JH是昆蟲咽側體分泌的一種生長調節劑，能夠保持幼蟲狀態、抑制蛻皮和變態，調控昆蟲生命周期中每一個重要發育階段的轉變，在昆蟲發育的臨界期高濃度JH會阻礙變態提前發生。蛻皮激素的主要成分是20羥基蛻皮酮（20-hydroxyecdys-one，20E），主要作用是激發昆蟲的蛻皮活動，調節昆蟲所有的幼蟲態、蛹以及成蟲的轉換。在針對黑腹果蠅Drosophila melanogaster的研究中發現，注射20E后，黑腹果蠅的細胞吞噬功能和PO活性得到了增強。棉鈴蟲Helicoverpa armigera在注射20E后，細胞吞噬功能提高，細胞免疫明顯增強。JH和MH對昆蟲細胞免疫既有正調控作用，也有負調控作用，并可通過增強或抑制PO活性來調節昆蟲體液免疫。

黏蟲是嚴重威脅我國主要糧食作物生產安全的重大農業害蟲。由于近年來黏蟲在我國局部地區常常暴發，對糧食生產安全帶來重大威脅。暴發的黏蟲幼蟲發生黑化現象已成常態，其免疫能力顯著增強。但這種免疫能力是否受到內分泌激素的影響還不清楚，關于黑化黏蟲內分泌激素MH如何調控免疫反應未見報道。因此，本研究旨在明確黑化黏蟲6齡幼蟲被球孢白僵菌Beauveria bas-siana侵染后其內分泌激素MH的含量變化。注射20E稀釋液后，明確被白僵菌侵染的黑化黏蟲幼蟲死亡率的變化以及體液免疫中PO和溶菌酶活性的變化，揭示黑化黏蟲體液免疫和內分泌調節機制間的關系。

1材料與方法

1.1材料

供試菌株：球孢白僵菌Beauveria bassiana菌株由中國農業科學院植物保護研究所蔬菜害蟲組提供。使用0. 01%吐溫80溶液配制10⁵、5×10⁵、10⁶、5×10⁶、10⁷cfu/mL和10⁸cfu/mL的球孢白僵菌孢子懸浮液進行預試驗，經SPSS-Probit回歸模型分析處理，球孢白僵菌對黑化黏蟲的LC₅₀約為10⁶cfu/mL，本試驗所有黏蟲感染球孢白僵菌的濃度均為10⁶cfu/mL。

供試昆蟲及飼養：供試黏蟲采集于吉林省四平市公主嶺市田間。在飼養瓶（直徑9 cm×高13 cm）中高密度誘導飼養，飼養密度為10頭/瓶。飼養方法參照郭棟、呂偉祥等室內人工飼養方式，每日更換30～50cm高的玉米苗直至幼蟲停止取食。飼養溫度設置為（23±1）℃，濕度設置為（70±5）%，光周期設置為L∥D=14 h∥10h。

1.2球孢白僵菌和外源蛻皮激素注射方法

1.2.1黑化黏蟲幼蟲白僵菌注射方法

根據預試驗的結果，球孢白僵菌濃度10⁶cfu/mL注射后可以激活黑化黏蟲6齡幼蟲的免疫反應，且有近半數黏蟲幼蟲可以完成世代發育。將蛻皮24h內的黑化黏蟲6齡幼蟲置于冰上冷凍麻醉15 min，幼蟲靜止后，使用微量注射器吸取10⁶cfu/ml_的球孢白僵菌孢子懸浮液1μL，注入幼蟲第3與第4腹足之間的腹部。處理對照組注射0. 01%吐溫80溶液。每個處理組30頭蟲，每個處理重復3次。幼蟲傷口閉合并且晾干后，放入裝有新鮮玉米幼苗的飼養瓶中繼續飼養。

1.2.2黑化黏蟲幼蟲20E稀釋液注射方法

取20 mg 20E加入1mL無水乙醇充分溶解混勻后，得到20μg/μL的20E母液。用無水乙醇對20μg/μL的20E母液2倍梯度稀釋，得到濃度為1. 25、2.5、5、10μg/μL的20E稀釋液并進行編號。蛻皮24h內的黑化黏蟲6齡幼蟲注射球孢白僵菌孢子懸浮液后，立刻對其注射20E液。對照組為注射球孢白僵菌孢子懸浮液后立刻注射無水乙醇。每個處理組30頭蟲，每個處理重復3次。注射方法同1.2.1。

1.3免疫指標測定方法

1.3.1 MH含量測定方法

在注射球孢白僵菌后8、24、48、72h和96h分別取對照組（注射吐溫80）以及處理組（被白僵菌侵染）的黏蟲血淋巴樣品，每次采集3頭黏蟲，每頭幼蟲采集血淋巴約50μL，每頭黏蟲血淋巴樣品重復測試3次。使用昆蟲蛻皮激素（MH）試劑盒測定MH含量。在96孔酶標板中設空白孔、標準孔和樣品孔。標準孔中加入稀釋為10、20、40、80、160ng/L的MH標準品，樣品孔中加入待測樣品及樣品稀釋液后在預熱至37℃的水浴鍋中溫育30 min。溫育后棄去板中的液體，使用洗滌液洗板并拍干。加入酶標試劑溫育30 min并使用洗滌液洗滌拍干。加入顯色試劑在37℃的水浴鍋避光顯色15 min。避光顯色后加入終止劑終止反應，用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度（OD），分別通過標準曲線計算樣品中的MH含量。

1.3.2被球孢白僵菌侵染的黑化黏蟲注射20E后幼蟲死亡率測定

每天觀察記錄對照組（被白僵菌侵染后僅注射無水乙醇）的黑化黏蟲6齡幼蟲，以及處理組（被白僵菌侵染后）分別注射1. 25、2.5、5、10、20 μg/μL20E稀釋液的黑化黏蟲6齡幼蟲的存活情況，統計幼蟲死亡數量，直至幼蟲化蛹。統計分析黑化黏蟲幼蟲的校正死亡率。每個處理組30頭蟲，每個處理重復3次。選取對黑化黏蟲死亡率影響最顯著的20E稀釋液進行血淋巴免疫酶活性測定試驗。

1.3.3血淋巴PO和溶菌酶活性的測定

處理組在注射球孢白僵菌孢子懸浮液后注射5μg/μL20E稀釋液。處理對照組在注射球孢白僵菌后注射無水乙醇。另設空白組不作處理以驗證注射球孢白僵菌的黑化黏蟲6齡幼蟲被侵染成功。在被白僵菌侵染后8、24、48、72 h和96 h取黏蟲血淋巴樣品，每次采集3頭黏蟲，每頭采集約50μL，每頭黏蟲血淋巴重復測試3次。使用酶聯免疫試劑盒測定溶菌酶和PO活性。試劑盒操作方法參照1.3.1。

1.4數據統計與分析

數據采用Excel進行統計，所有數據采用平均值±標準誤（mean±SE）表示，應用統計軟件SPSS24.0對數據進行分方差分析。用單因素方差分析（ANOVA）Tukeys HSD和獨立樣本t測驗進行差異顯著性分析。

2結果與分析

2.1白僵菌侵染對黑化黏蟲幼蟲體內MH含量的影響

從圖1可以看出，黑化黏蟲幼蟲的MH含量隨侵染后時間的增加呈先降低再升高的趨勢，總體上呈現侵染組高于對照組（侵染后24h除外）。對照組（注射吐溫-80） MH含量在處理后8～72 h呈下降趨勢。在處理后96 h時MH含量顯著升高（F_4，40=25. 131，P<0. 05），達到120. 00 ng/l_。與對照組相比，注射球孢白僵菌后，在侵染初期8h時黑化黏蟲幼蟲的MH含量達到136. 96 ng/L，顯著高于對照組的95. 25 ng/L（t=-9.028，fg=16，P<0. 05），是對照組的1. 44倍。在侵染中期24 h時，MH含量低于對照組，僅為54. 54 ng/L。48h時MH含量高于對照但無顯著差異（t=-1.112，df=16，P>0. 05）。而在侵染后期72 h（t=-4.510，df=16，P<0. 05）、96h（t=-6.889，df=16，P<0. 05）時，黑化黏蟲幼蟲的MH含量顯著增加，并且顯著高于對照組。在侵染后96h時達到最大值197. 79 ng/L，是對照組的1. 65倍。

2.2注射20E對被菌侵染的黑化黏蟲死亡率的影響

由圖2可以看出，注射球孢白僵菌的黑化黏蟲幼蟲在注射不同濃度20E后，其校正死亡率有不同程度的下降。注射1. 25、2.5μg/μL和20μg/μL的20E后黑化黏蟲的校正死亡率有所降低，但與注射無水乙醇的對照組相比，差異不顯著（F_5，12=2.909，P>0.05）。注射5μg/μL和10μg/μL的20E后黑化黏蟲的校正死亡率顯著降低（F_5，12=2.909，P<0. 05），分別為19. 28%和26. 51%。供試的5個濃度中，5μg/μL的20E處理后被侵染的黑化黏蟲的死亡率顯著低于對照組（F_5，12=2.909，P<0.05）。這說明注射20E有利于黏蟲免疫能力增強。

2.3注射20E對被茵侵染的黑化黏蟲幼蟲溶菌酶活性的影響

從圖3中可以看出，空白對照組（不作處理）溶菌酶活性較低，在不同時間其活性無顯著差異（F_4，40=0. 366，P>0. 05）。對照組（被球孢白僵菌侵染后僅注射無水乙醇）被球孢白僵菌侵染后，體液免疫激活，溶菌酶活性增加。被球孢白僵菌侵染后注射20E的處理組免疫反應增強，溶菌酶活性高于對照組。注射20E的處理組的溶菌酶活性與對照組變化趨勢相同，在侵染后隨時間增加溶菌酶活性降低。對照組溶菌酶活性在被侵染后8h最高，達到最大值717. 61 U/mL，隨后溶菌酶活性開始下降，隨侵染后時間的增加，溶菌酶活性逐漸趨于穩定。經20E誘導的黑化黏蟲幼蟲的溶菌酶活性在8h時最高，并顯著高于其他時間（F_4，40=97. 262，P<0. 05）。被白僵菌侵染后8h（F_2，24=386. 35，P<0. 05）和24 h（F_2，24=128. 323，P<0. 05）時20E處理組溶菌酶活性顯著高于對照組，在侵染48h之后，注射20E的處理組的溶菌酶活性也逐漸回到空白組基線水平。

2.4注射20E對被菌侵染的黑化黏蟲幼蟲PO活性的影響

從圖4中可以看出，空白組PO活性較低，在不同時間無顯著差異（F_4，40=2. 885，P>0. 05）。處理對照組在注射球孢白僵菌后，球孢白僵菌激活了黑化黏蟲的體液免疫，其PO活性增加。24h時PO活性達到最大值132. 25 U/mL。隨被侵染時間的增加，其PO活性顯著降低（F_4，40-225. 340，P<0. 05）。注射球孢白僵菌后又注射20E的處理組，黑化黏蟲經20E誘導后免疫反應增強，PO活性高于對照組。在侵染后8 h（F_2，24=250. 345，P<0. 05）、24 h（F_2，24=235. 849，P<0. 05）和48 h（F_2，24=121. 385，P<0. 05）20E處理組PO活性均顯著高于對照組，并在侵染后8h達到最大值156. 83 U/mL。

3討論

昆蟲種類繁多、形態各異，在長期的進化過程中，作為地球上數量最多、分布最廣的動物群體，逐漸形成了獨特的免疫機制。神經和內分泌系統對昆蟲的免疫功能起到主要的調節作用。昆蟲體內的蛻皮激素（MH）已被證明在發育、變態、生殖等方面具有重要作用，并且對昆蟲的先天免疫反應有重要調控作用。蛻皮激素的主要成分20羥基蛻皮酮（20E）可以激活細胞免疫和體液免疫來對抗外源入侵微生物，而外源微生物的刺激也會通過3脫氫蛻皮激素-3β-還原酶促進20E滴度升高。本試驗通過對黑化黏蟲6齡幼蟲注射球孢白僵菌來測定黑化黏蟲幼蟲體內的MH含量，發現被侵染后的黑化黏蟲體內的MH含量出現顯著變化。MH含量在侵染后高于對照組，侵染后8、72 h和96 h尤為明顯。其原因是被球孢白僵菌侵染后，20E可以迅速激活免疫反應來對抗外源入侵微生物。這說明MH在黑化黏蟲體液免疫反應中起到重要的調節作用。

近年來的研究發現，昆蟲體液免疫可以受20E調控，酚氧化酶（PO）和溶菌酶等保護昆蟲免受傷害。酚氧化酶是昆蟲體液免疫中非常重要的免疫因子。在昆蟲表皮的硬化和黑化的過程中酚氧化酶具有重要作用。在昆蟲受到外源病原物的刺激時酚氧化酶同樣具有重要作用。酚氧化酶活性是衡量昆蟲體液免疫的重要指標之一。黑腹果蠅注射MH后，其體內的PO活性增強。針對埃及伊蚊Aedes aegypti的研究發現，鑒定到的一條PO基因序列中有2個可以結合20E受體復合物EcR/USP的順式作用元件，20E的刺激能上調PO的轉錄表達。本試驗結果與上述試驗結果一致。通過對球孢白僵菌侵染后的黑化黏蟲6齡幼蟲注射20E稀釋液來測定黑化黏蟲血淋巴中的酚氧化酶活性。黑化黏蟲6齡幼蟲被球孢白僵菌侵染后，經20E稀釋液誘導其PO活性顯著增強，幼蟲的免疫水平因外源20E誘導而提高。未經20E稀釋液誘導的對照組黑化黏蟲幼蟲的酚氧化酶活性顯著低于經20E稀釋液誘導的試驗組。這表明20E處理組的黑化黏蟲幼蟲的體液免疫功能明顯增強。

在昆蟲的非特異性免疫中，溶菌酶同樣是非常重要的免疫因子。溶菌酶通過昆蟲的脂肪體分泌釋放到血淋巴中。昆蟲在受到外界環境刺激時，溶菌酶的活性急劇增加。當外界的病原物進入昆蟲體內后，病原體細胞壁會在溶菌酶的作用下破裂并使內容物溢出，最終病原細胞破裂死亡。針對棉鈴蟲的研究發現，棉鈴蟲20E滴度增高，脂肪體中溶菌酶基因的轉錄表達上調。針對東亞飛蝗Lo-custa migratoria的研究發現，溶菌酶基因在轉錄水平上可被20E顯著上調。本試驗結果與上述試驗結果一致。本試驗通過對白僵菌侵染后的黑化黏蟲6齡幼蟲注射20E稀釋液來測定黑化黏蟲血淋巴中的溶菌酶活性。試驗中被侵染的黑化黏蟲幼蟲在注射20E稀釋液后，溶菌酶活性的變化與酚氧化酶活性的變化趨勢大致相同。這同樣表明20E對黑化黏蟲幼蟲的體液免疫功能有增強作用。

綜上所述，對黑化黏蟲內分泌激素含量的分析表明，黑化黏蟲6齡幼蟲被球孢白僵菌侵染后，MH的分泌顯著提高。對酚氧化酶和溶菌酶活性的分析表明，在注射20E稀釋液后，黑化黏蟲幼蟲的酚氧化酶活性和溶菌酶活性顯著提高。本試驗證明，黑化黏蟲6齡幼蟲在受到外源病原微生物侵染后，蟲體通過內分泌激素對免疫系統進行調控從而增強免疫反應。本文試驗結果對黑化黏蟲免疫機制和內分泌調節機制間的關系提供了一定的理論依據，對揭示黑化黏蟲、防御能力和免疫應答三者間聯系具有重要意義。