GC-MS/MS法測定草莓中吡唑醚菌酯殘留量及安全評價

喻歆茹　路彩紅　徐玲英等

中圖分類號：S 481.8 文獻標識碼：A DOI：10.16688/j.zwbh. 2020264

吡唑醚菌酯屬于甲氧基丙烯酸酯類新型殺菌劑，其主要通過抑制病菌線粒體的呼吸阻礙病菌的能量循環，最終導致細胞死亡。吡唑醚菌酯對子囊菌類、擔子菌類、半知菌類及卵菌類均有很好的活性，具有保護、治療、滲透、內吸等作用，對農作物生長有一定的調節作用，被廣泛用于防治農作物的霜霉病、白粉病、葉斑病、炭疽病等病害。除此之外，吡唑醚菌酯還能誘導農作物發生生理變化，提高對氮元素的吸收，促進生長，提高產量。

我國是草莓第一種植大國。由于草莓生長周期短，經濟效益高，已成為我國農村經濟的支柱產業之J[們，但連作易引起草莓病害的發生。吡唑醚菌酯是防治草莓病害的主要農藥，其大量使用所帶來的健康風險和環境問題都值得關注。盡管吡唑醚菌酯毒性較低，但過量使用可能對消費者構成潛在的健康風險。目前，國內外對吡唑醚菌酯在農產品上的殘留測定方法已有大量報道，但已報道的檢測方法中其樣品前處理和凈化方法效果不佳，試劑使用量大。草莓中吡唑醚菌酯殘留檢測的氣相色譜串聯質譜法尚未見報道。由于不同樣本基質的多樣性，現有方法無法直接使用，我國規定吡唑醚菌酯在草莓上的最大殘留限量（maxlmum res-idue limit，MRL）為2mg/kg。雖已有關于吡唑醚菌酯在草莓等鮮食水果、蔬菜上的膳食風險評估報道，但GB 2763—2019中針對吡唑醚菌酯在食品中最大殘留限量制定的食品類別由15項增加到66項，需要對其重新進行膳食風險評估。本試驗通過對提取溶劑、分散固相吸附劑進行優化，建立了準確、快速測定草莓中吡唑醚菌酯的氣相色譜串聯質譜法（GC-MS/MS），同時結合施藥濃度、施藥次數及施藥間隔時間等因素對吡唑醚菌酯進行消解動態差異、殘留特點等對比，并對吡唑醚菌酯在草莓中的最終殘留結果進行膳食風險評估，以期為吡唑醚菌酯在草莓上的科學合理使用和殘留檢測提供技術支持。

1材料與方法

1.1儀器與試劑

TQ 8040氣相色譜串聯質譜系統，日本島津公司;DB-5 MS色譜柱（30m×0.25 mm×0.25μm，美國Agilent Technologies公司）;其他為實驗室常規儀器設備。

99.5%吡唑醚菌酯標準品購自德國Dr. Eh renstorfer GmbH公司;分析純乙腈，上海凌峰化學試劑有限公司;色譜純乙腈，德國默克公司;色譜純甲酸，美國Anaqua Chemicals;氯化鈉（分析純），蘭溪市屹達化工試劑有限公司;2mL Agela Clean ert MAS-Q凈化管購自天津博納艾杰爾科技有限公司，包括3種，分別為1）C18 50 mg，PSA 50 mg，MgSO₄150 mg;2）C18 50 mg， PSA 50 mg， MgSO₄150 mg， PC 50 mg;3） C18 50 mg， PSA 50 mg，MgSO₄150 mg，PC 8 mg。250 g/L吡唑醚菌酯乳油（EC），巴斯夫（中國）有限公司。

1.2樣品前處理

1.2.1提取溶劑的優化

乙酸乙酯、丙酮、乙腈、正己烷是果蔬樣品中農藥殘留分析的常用提取溶劑，本試驗比較了這5種試劑作為提取溶劑的提取效率。稱取已勻漿的草莓空白樣品5.0g于50 mL離心管中，加入吡唑醚菌酯標準溶液（添加量為0.2 mg/kg）靜置30 min。加入20 mL提取試劑振蕩30 min，加入約3g氯化鈉，渦旋振蕩1min，5454 g離心1 min，吸取1.0 mL上清液至平底燒瓶于40℃濃縮至近干，色譜純乙腈定容2.5mL，待凈化。

1.2.2凈化填料的優化

吸附填料的組成和用量是影響樣品前處理凈化的重要因素，本試驗采用分散固相萃取法對樣品進行凈化。吸取1.2.1的待凈化液1.6mL于3種Cleanert MAS-Q凈化管中，渦旋30 s，8000g離心1 min，取上清液過0.22μm濾膜，待檢測。

1.2.3儀器分析條件

氣相色譜條件：色譜柱DB-5 MS。進樣口溫度：250℃;起始溫度80℃保持1min，以35℃/min升溫至280℃，保持6 min;載氣：He（純度≥99. 999%），恒流模式，進樣體積1.0μL;進樣模式：不分流進樣;質譜條件：采用多反應離子監測模式（ multiplereaction monitoring，MRM）采集，電離方式：EI（70 eV）;接口溫度：280℃;離子源溫度：230℃;檢測電壓：0.8 kV，定性和定量離子對、碰撞能如表1所示。

1.2.4標準曲線

乙腈為溶劑，配制1μg/mL吡唑醚菌酯標準儲備液，并依次稀釋成0. 001、0.005、0.010、0.050、0. 100、0.200μg/mL系列標準工作液，按照1.2.3節的檢測條件進樣，以標準溶液濃度對峰面積作圖，繪制吡唑醚菌酯的標準工作曲線。使用草莓空白樣品，按照1.2的方法提取并凈化制得草莓空白基質溶液，吸取2 mL草莓空白基質溶液，N₂吹至近干后用配制的系列標準工作液復溶，超聲得到基質匹配標準溶液，過0. 22μm微孔濾膜后進行GC-MS/MS測定。

1.2.5回收率和精密度

向草莓空白樣品中添加3個水平（0. 020、0.20、2.0 mg/kg）的吡唑醚菌酯標準溶液，每個水平重復5次。按照已優化的前處理方法提取和凈化，1.2.3的檢測條件進行分析，外標法定量，計算加標回收率和相對標準偏差（RSD）。

1.3吡唑醚菌酯田間消解動態和殘留試驗

于2019年3月—12月分別在浙江省杭州市、遼寧省沈陽市、北京市、山東省濰坊市、黑龍江省哈爾濱市、湖南省長沙市、安徽省合肥市、貴州省畢節市進行250 g/L吡唑醚菌酯EC防治草莓葉斑病的田間試驗。250 g/L吡唑醚菌酯EC的田間推薦劑量為6. 0～10.0 g/667m²。在草莓葉斑病發生初期采用噴霧方式施藥，每個小區50m²，藥液量為0. 067 5L/m²，保證均勻施藥，施藥3次，施藥間隔7～10 d。施藥后2h、1、3、5、7、lo d每個小區按四分法采集樣品。所有樣品裝入樣品袋中，在低于

20℃條件下保存。其中消解動態試驗采用山東、北京、遼寧、浙江4地的樣品;最終殘留試驗采用8地5、7、10d的樣品。樣品檢測前，所有樣品在冷凍狀態下經勻漿機勻漿，制備成待檢樣品。

1.4膳食攝入風險評估

采用國家估算每日攝入量（national estimated daily intake，NEDI）和風險概率（risk probability）對吡唑醚菌酯在草莓中的膳食風險進行評估。

NEDI=∑[STMR（STMR-P_i）×F];

風險概率=NEDI/（ADI×B_w）×100%。

STMR：農藥在某一食品中的規范殘留試驗中值;STMR—P_i：用加工因子校正的規范殘留試驗中值;F：一般人群某一食品的消費量。ADI：每千克體重每日允許攝入量，單位mg/kg。B_w：人群平均體重，單位kg。當風險概率>100%時，表示會對一般人群健康產生不可接受的風險，風險概率越大，風險越大，反之，當風險概率<100%時，表示對一般人群健康產生的風險是可接受的，風險概率越小，風險越小。

2結果與分析

2.1提取溶劑的優化

供試的5種溶劑中乙酸乙酯屬中等極性，用其作為提取溶劑時目標化合物難以轉移到有機相中，且易將基質樣品中的非極性雜質，如蠟質、脂肪等提取出來。丙酮容易將樣品中的色素雜質提取出來，且丙酮與水互溶，難以與水相分層。為了獲得更高的回收率和較好的樣品提取效率，本試驗對5種不同試劑的提取效率和差異顯著性進行比較，結果如圖1所示。不同提取溶劑提取的樣品中吡唑醚菌酯的平均回收率差異顯著（P<0.05），丙酮、乙腈及1. 0%甲酸乙腈均能有效提取吡唑醚菌酯，但由于草莓基質含水量高，用乙腈或者酸化乙腈提取后鹽析效果更好，當提取溶劑為1.0%甲酸乙腈時，吡唑醚菌酯的萃取效率最高，其回收率為95.7%，RSD為3.2%，其結果與Narenderan等報道的一致。

2.2凈化填料的優化

近年來，分散固相萃取法在農藥上應用廣泛，常見的用于凈化的吸附填料有C18，PC和PSA。PSA可以有效吸附脂肪酸、糖類、色素及有機酸等物質。PC主要去除色素、甾醇類和非極性干擾物，C18主要去除脂肪和酯類等非極性干擾物。本試驗選用C18、PC和PSA作為吸附填料，比較其對吡唑醚菌酯回收率的影響，結果如圖2所示。3種凈化方法下吡唑醚菌酯的平均回收率差異顯著（P<0.05），在吸附填料中均含有PSA 50 mg、MgSO₄150 mg、C18 50 mg的條件下，凈化方法1添加50 mg PC其吡唑醚菌酯的回收率僅有45.5%;凈化方法3將PC含量降低為8 mg時，吡唑醚菌酯的回收率顯著提高，回收率為83.1%;而凈化方法2的吸附填料里無PC，目標物的回收率為107. 9%，與PC吸附劑相比，PSA也能吸附部分色素達到凈化色素的效果。結果表明，PC填料對于吡唑醚菌酯具有吸附作用，導致其回收率偏低，因此本試驗采用PSA和C18作為凈化填料吸附雜質。與Lagunas-Allue等所報道的方法相比，改進QuEChERs-GC-MS/MS的LOQ更低，凈化分離效果好。

2.3方法的線性范圍、準確度及精密度

本研究基于優化后的QuEChERs方法進行樣品前處理，采用1. 0%甲酸乙腈作為提取溶劑，凈化過程添加C18、PSA等分散固相吸附劑來去除草莓樣本中的雜質。外標法定量分析結果表明：在0. 001～0. 200 mg/L圍內，吡唑醚菌酯的峰面積（y）與其質量濃度（x）呈良好的線性關系。標準溶液線性回歸方程為y=4878. 9x—2985.8，相關系數r=0. 999 8。

由表2可以看出：在0. 020、0.20、2.0 mg/kg添加水平下，吡唑醚菌酯在草莓中的平均回收率為101.4%、96. 8%、97. 3%，相對標準偏差（RSD）分別為1. 8%、2.0%、3.3%（n=5）。草莓中吡唑醚菌酯的定量限（LOQ）為0. 020 mg/kg，符合農藥殘留試驗的規范要求。

2.4基質效應

本試驗采用在空白草莓基質中添加待測物的方法評價基質效應，通過測定吡唑醚菌酯在基質匹配標準溶液中標準曲線的斜率（K_m）及其在純溶劑中標準曲線的斜率（K），計算基質效應（matrix effect，ME）。ME=（K_m/K-1）×100%。當|ME|≤20%時，表現為弱基質效應;當|ME|為20%～50%時，為中等基質效應;當|ME|>50%時為強基質效應。由于草莓基質復雜，凈化不完全而流出的基質雜質不僅影響方法的靈敏度，甚至還影響儀器的壽命，因此通常要求在保證添加回收率的同時要最大化地去除基質干擾。本文比較了不同凈化方法下的草莓基質效應，通過凈化方法1、2和3凈化草莓樣品，吡唑醚菌酯的基質效應分別為13. 2%，9. 7%，13. 7%，均呈現弱基質效應，說明3種凈化方式條件下凈化效果良好。不同吸附填料對基質效應的影響評估結果顯示，含PC填料的凈化方法其基質效應要高于無PC填料的凈化方法，這可能是因為PC吸附雜質的同時也吸附目標分析物。通過基質效應的評價，本試驗采用溶劑匹配標準溶液進行校正，以提高檢測結果的準確性。

2.5吡唑醚菌酯在草莓中的消解動態

2.6吡唑醚菌酯在草莓中的最終殘留

吡唑醚菌酯在8地草莓中的最終殘留結果如表4所示，以250 g/L吡唑醚菌酯EC有效成分150 g/hm²在草莓上施藥3次。施藥后5d，草莓中吡唑醚菌酯殘留量為0. 015～0. 35 mg/kg，殘留中值（STMR）為0. 16 mg/kg，殘留最大值（HR）為0. 35 mg/kg。施藥后7d，草莓中吡唑醚菌酯殘留量為0. 014～0. 31 mg/kg，STMR為0.12 mg/kg，HR為0. 31mg/kg。施藥后10 d，草莓中吡唑醚菌酯殘留量為0. 012～0.15 mg/kg，STMR為0.085 mg/kg，HR為0.15 mg/kg。采收間隔期5d時吡唑醚菌酯在草莓中達到最大殘留量（0. 35 mg/kg），小于我國規定吡唑醚菌酯在草莓上的最大殘留限量（MRL=2 mg/kg）。

2.7吡唑醚菌酯膳食風險評估

基于最終殘留試驗中吡唑醚菌酯的殘留數據，以一般人群的膳食結構為基礎，選用采收間隔期5d的吡唑醚菌酯STMR（0.16 mg/kg）和GB 2763—2019中規定吡唑醚菌酯的ADI（0. 03mg/kg）進行膳食風險評估，結果如表5所示。一般人群吡唑醚菌酯的國家估算每日攝入量（ NEDI）為1.34 mg，占日允許攝入量的70. 9%，小于100%，表明我國居民對吡唑醚菌酯長期膳食攝入風險較低，不會對人體健康產生不可接受的風險。結果表明：以250 g/L吡唑醚菌酯EC有效成分150 g/hm²的劑量在草莓上噴霧施藥3次，采收間隔期為5d時不會對一般人群造成膳食攝入風險。

3結論與討論

本試驗建立了基于分散固相萃取法結合GC-MS/MS檢測草莓樣品中吡唑醚菌酯殘留分析方法，以PSA、C18為凈化吸附填料，吡唑醚菌酯的平均回收率為96. 8%～101.4%，相對標準偏差為1.8%～3.3%，定量限為0. 020 mg/kg。該方法具有操作簡單，高效等優點，且靈敏度、重現性、回收率等指標都能滿足農藥殘留檢測要求。通過田間試驗發現吡唑醚菌酯在草莓中的消解速率較快，半衰期為2. 2～3.0 d，屬于易降解農藥，在末次施藥Sd后草莓中吡唑醚菌酯的殘留水平遠低于國家標準。根據規范殘留試驗數據對草莓中吡唑醚菌酯的殘留進行膳食風險評估，風險概率小于100%，表明了吡唑醚菌酯通過長期膳食攝人不會對身體產生不可接受的風險。