超高效液相色譜串-聯質譜檢測小麥中唑啉草酯及其代謝物M4

吳遲　何明遠　歐陽小慶等

中圖分類號：S 481.8 文獻標識碼：A DOI：10.16688/j.zwbh. 2020599

唑啉草酯為先正達公司開發的苯基吡唑啉類除草劑，具有內吸傳導性，作用機理為乙酰輔酶羧化酶（ACC）抑制劑，造成脂肪酸合成受阻，使細胞生長分裂停止，細胞膜含脂結構被破壞，導致雜草死亡。唑啉草酯主要用于大麥和小麥田防除一年生禾本科雜草，如大穗看麥娘Alopecurus myosuroides Huds.、阿披拉草Apera spica-venti L.Beauv.、燕麥Avenasativa L.、黑麥Secale cereale L.、狗尾草Setaria viridis（L.）Beauv.等主要禾本科雜草，對小麥安全性高。有研究表明，5%唑啉草酯乳油80、100 mL/667m²對小麥田4～5葉禾本科雜草（藺草Schoenoplectus trigueter （L.）Palla、看麥娘Alopecurus aequalis Sobol.為主）防除效果優良，藥后35 d株防效分別達到92. 9%和96.1%，鮮重防效分別達到97. 7%和99.1%。由于其防效好、安全性高，唑啉草酯發展迅速，先后在美國、英國、加拿大以及澳大利亞取得登記。2010年唑啉草酯原藥單劑和復配制劑在中國取得登記。唑啉草酯在植物體內迅速代謝為M2，而后羥基化為代謝物M4。唑啉草酯及其代謝物M4被視為唑啉草酯用以制定其MRL值及膳食評估的定義指標。因此，研究建立唑啉草酯及其代謝物M4在小麥中的檢測方法具有重要意義。

目前，唑啉草酯的殘留檢測方法主要有液相色譜一串聯質譜法（LC-MS/MS）和高效液相色譜法（HPLC）。前處理大多采用QuEChERS法。國內對于唑啉草酯的測定研究大多是對于大麥樣品，而對唑啉草酯在小麥上的檢測方法研究較少，未見其代謝物M4在小麥上的測定研究報道。本文采用超高效液相色譜法串聯質譜法開展了唑啉草酯及代謝物M4在小麥上的殘留試驗，建立了UPLC-MS/MS快速檢測唑啉草酯和代謝物M4在小麥中的殘留分析方法，為該藥劑在小麥上的安全使用提供方法與依據，為農產品安全監測和膳食評估提供技術支撐。

1材料與方法

1.1儀器和試劑

超高效液相色譜質譜聯用儀（Waters XevoTQD），沃特世科技上海有限公司;色譜柱為ACQU-ITY UPLC BEH C18（2.1 mmX50 mm，1.7μm），Waters公司;ACQUITY UPLC BEH HILIC（2.1mm×50 mm，1.7μm），Waters公司;Insert Sustain

C8（2.1 mm×75mm，3μm）， GLS Sciences公司;分析天平（MS105），梅特勒托利多儀器上海有限公司;電子天平（YP502N），上海菁海儀器有限公司;數控超聲波清洗器（KQ-500DE），昆山市超聲儀器有限公司;移液器，Eppendorf;臺式高速離心機（TG-18），四川蜀科儀器有限公司;0.22μm微孔濾膜，天津博納艾杰爾公司;多管旋渦混合器（UMV2），北京優晟聯合科技有限公司。

唑啉草酯標準品（純度99.1%），北京勤誠亦信科技開發有限公司;唑啉草酯代謝物M4標準品（純度99. 7%），上海洲銳生物科技有限公司;N-丙基乙二胺（PSA）、十八烷基硅烷鍵合硅膠（C18）、石墨化碳黑（GCB）、多壁碳納米管（MWCNT），天津博納艾杰爾公司;乙腈、甲酸、乙酸、HCl（色譜純，分析純），賽默飛世爾科技有限公司;氯化鈉（分析純）、無水乙酸鈉（分析純），國藥集團化學試劑有限公司。

1.2樣品前處理方法

1.2.1麥粒中唑啉草酯提取

采用優化的QuEChERS方法，稱取（10. 00±0.05）g麥粒于50 mL離心管中，加入10.0 mL去離子水，10.0 mL0.1%甲酸乙腈，混勻，超聲提取15min，然后向離心管中加入6g無水MgSO₄，1，1.8g無水NaAC，2400 r/min渦旋2min，4000 r/min離心5 min，上清液待凈化。取上清液1.600 mL于裝有50 mg PSA的離心管中，2400 r/min渦旋2 min，10 000r/min離心2 min，取上清過0.22μm微孔濾膜，待測。

1.2.2麥粒中唑啉草酯代謝物M4提取

采用優化的QuEChERS方法，稱取（5.00±0. 05）g麥粒于50 mL離心管中，加入10. 00 mL1 mol/L HCl，混勻，80'c水浴超聲30 min，加入10.0 mL乙腈，80℃水浴超聲提取15 min，冷卻至室溫后，向離心管中加入5. 00g NaCl，4.00 g無水MgSO₄，2400r/min渦旋2min，4 000 r/min離心5 min，上清液待凈化。取上清液1.600 mL于裝有50 mg C18的離心管中，2400 r/min渦旋2 min，10 000 r/min離心2 min，取上清過0.22μm微孔濾膜，待測。

1.2.3秸稈中唑啉草酯提取

采用優化的QuEChERS方法，稱取（1. 00±0. 05）g秸稈于50 mL離心管中，加入10.0 mL去離子水，10.0 mL0.1%醋酸乙腈，混勻，超聲提取15 min，然后向離心管中加入6g無水MgSO₄，1.8 g無水NaAC，2400 r/min渦旋2min，4000r/min離心5 min，上清液待凈化。取上清液1.600 mL于裝有50 mg PSA的離心管中，2 400 r/min渦旋2 min，10000 r/min離心2 min，取上清過0.2μm微孔濾膜，待測。

1.2.4秸稈中唑啉草酯代謝物M4提取

采用優化的QuEChERS方法，稱取（1.00±0.05）g秸稈于50 mL離心管中，加入10. 00 mL 1mol/LHC1，混勻，80℃水浴超聲30 min，加入10.0 mL乙腈，80℃水浴超聲提取15min，冷卻至室溫后，向離心管中加入5. 00gNaCl，4.00g無水MgSO₄，2400r/min渦旋2 min，4000r/min離心5min，取上清4.000mL，旋蒸近干，用1. 000 mL乙腈定容，待凈化。將旋蒸瓶中溶液分別轉移至裝有50 mg C18的離心管中，2400r/min渦旋2 min，10000r/min離心2min，取上清過0.22μm微孔濾膜，待測。

1.3唑啉草酯及其他代謝物M4的檢測

1.3.1色譜柱和凈化劑的選擇

本研究考察了3種色譜柱C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm），C8柱（2.1mm×75 mm，3μm）和LCHILIC（2.1mm×50 mm，1.7μm）對唑啉草酯和唑啉草酯代謝物保留和響應的影響。當流動相為乙腈水相（70：30），且水相中含有0.01%的甲酸時，采用上述色譜柱分別對o.25 mg/l_的唑啉草酯和唑啉草酯代謝物標準溶液進行分析測定。麥粒和秸稈基質中唑啉草酯分別采用乙腈、甲醇、0. 1%甲酸乙腈和0.1%的醋酸乙腈提取，麥粒和秸稈中唑啉草酯代謝物M4分別采用乙腈、0. 1%甲酸乙腈、0.1%醋酸乙腈、10 mL 1mol/L HCl+10 mL乙腈提取，80℃水浴中超聲輔助提取，以PSA為凈化材料，選擇最優提取劑。

1.3.2色譜條件

色譜柱為AOQUITY UPLC BEH C18（2.1 mm×50 mm，1.7μm），柱溫為40℃。唑啉草酯流動相為乙腈和0. 01%甲酸水溶液（70. 0/30.0）等度洗脫，流速為0.4 mL/min;進樣量為2μL。唑啉草酯代謝物M4流動相為乙腈和0.01%甲酸水溶液二元梯度洗脫，流速0.4 mL/min;進樣量為5μL;梯度洗脫條件見表1。

1.3.3質譜條件

電噴霧離子源，正離子電離模式（ESI+）。離子源溫度150℃，去溶劑溫度500℃，去溶劑氣（N₂）流量1000L/Hr，錐孔反吹氣（N₂）流量50L/Hr。唑啉草酯毛細管電壓1. 99kV，唑啉草酯代謝物M4毛細管電壓3. 80 kV。采用MRM多重反應監測，以保留時間和離子對（母離子和2個子離子）信息比較進行定性分析;以母離子和響應值最高的子離子進行定量分析。具體質譜參數見表2。

1.4方法驗證

1.4.1標準曲線繪制

采用麥粒、秸稈基質空白提取液做溶劑，分別稀釋唑啉草酯標準溶液和唑啉草酯代謝物M4，得到濃度為0. 000 5、0.001、0.002、0.005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/L的基質標準溶液，現配現用。采用麥粒基質空白提取液做溶劑，稀釋標準溶液，得到濃度為0. 005、0.01、0.02、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/L的麥粒基質標準溶液。采用秸稈基質空白提取液做溶劑，稀釋標準溶液，得到濃度為0. 002、0.05、0.1、0.2、0.5 mg/L的秸稈基質標準溶液。按1.3條件進行檢測，分別以唑啉草酯和唑啉草酯代謝物M4的質量濃度為橫坐標，相應的峰面積為縱坐標繪制標準曲線。

1.4.2添加回收以及精密度準確度

在空白麥粒中添加3個水平濃度的唑啉草酯標準溶液，添加水平分別為0. 001、0.01 mg/kg和0.1 mg/kg。在空白秸稈中添加3個水平濃度唑啉草酯標準溶液，添加水平分別為0. 01、0.1 mg/kg和1. 00 mg/kg。在空白麥粒中添加3個水平濃度的唑啉草酯代謝物M4標準溶液，添加水平分別為0.01、0.1 mg/kg和1.0 mg/kg。在空白秸稈中添加3個水平濃度唑啉草酯代謝物M4標準溶液，添加水平分別為0. 05、0.1 mg/kg和0.5 mg/kg，每個添加水平濃度重復5次。按1.3條件進行檢測，計算添加回收率及相對標準偏差（RSD）。

2結果與分析

2.1唑啉草酯及其代謝物M4的檢測

2.1.1檢測條件優化

為獲取唑啉草酯、唑啉草酯代謝物M4多反應監測參數，采用在質譜直接進標準品的方式，在100～500 m/z范圍內掃描，對正離子電離（ESI⁺）和負離子電離（ESI^-）同時進行監測。結果表明，在ESI⁺模式下，唑啉草酯和唑啉草酯代謝物M4具有明顯的特征離子峰[M+H]。再調整合適的錐孔電壓選定母離子，調節碰撞能量，進一步獲得定量和定性離子及相應的碰撞能量，最終優化條件如1.3所示。進一步優化色譜條件，最終唑啉草酯、唑啉草酯代謝物M4均采用乙腈-0.01%甲酸水溶液體系為流動相，在所設梯度洗脫條件下得到較好的靈敏度、重現性及峰形（圖2）。

2.1.2色譜柱選擇

唑啉草酯及其代謝物M4在LCHILIC柱上的保留時間有所增加，色譜峰形較差，為準確定量帶來困難。二者在C18、C8色譜柱上的保留時間相當，但在C8色譜柱上的響應明顯不如于C18色譜柱。因此，選取C18色譜柱用于唑啉草酯及其代謝物的分析測定。

2.2麥粒和秸稈樣品前處理方法的優化

2.2.1提取溶劑的選擇

以添加回收率為指標，結果表明，0.1%甲酸乙腈對麥粒中唑啉草酯的提取效果最佳，0. 1%醋酸乙腈對秸稈中唑啉草酯的提取效果最佳，在80℃水浴中加熱超聲輔助條件下，10mL 1mol/LHCl+10 mL乙腈對麥粒與秸稈中唑啉草酯代謝物M4提取效果最佳。相對于乙腈，酸化乙腈的提取效率更高。唑啉草酯代謝物M4存在游離態與共軛態，添加1mol/L HCl，以水浴加熱超聲輔助提取，更有利于樣本中共軛態M4游離，結果見表3。

2.2.2凈化劑的選擇

唑啉草酯分別采用GCB、PSA、多壁碳納米管凈化，唑啉草酯代謝物M4分別采用PSA、C18和GCB凈化。凈化后，上清液均變澄清，說明4種凈化方式都能很好地去除色素。不同凈化劑對麥粒和秸稈基質中0. 100 mg/kg添加濃度的唑啉草酯及唑啉草酯代謝物M4的回收率影響不同。50 mg GCB、50 mg PSA、10 mg多壁碳納米管凈化后，麥粒基質中唑啉草酯的回收率范圍分別為70. 3%～79. 1%、71. 9%～77. 3%、65.2%～73.7%，秸稈基質中唑啉草酯的回收率分別為58. 9%～64. 8%、72. 0%～77. 1%、40. 2%～57. 1%; 50 mg C18、50 mg GCB、50 mg PSA凈化后，麥粒基質中唑啉草酯代謝物M4的回收率分別為70. 3%～78.1%、69. 2%～77. 3%、55. 2%～62.3%。秸稈基質中唑啉草酯代謝物M4的回收率分別為78. 9%～84. 8%、72. 0%～77.1%、59. 5%～65.4%。結果表明，麥粒與秸稈基質中，選用PSA為凈化劑唑啉草酯添加回收均滿足要求，選用C18為凈化劑唑啉草酯代謝物M4添加回收均滿足要求（回收率在70%～120%之間）。結果見圖3。

2.3方法驗證

2.3.1基質標準曲線繪制

基質匹配外標法定量分析，結果表明在0. 000 5～0.5 mg/L的質量濃度范圍內，唑啉草酯和唑啉草酯代謝物M4的峰面積（y）與其質量濃度（x）呈現良好的線性關系。

2.3.2添加回收試驗的準確度和精密度

在0. 001、0.010mg/kg和0.100 mg/kg添加水平下，唑啉草酯在麥粒中的平均回收率為77. 6%～90.4%，RSDs為1.71%～3.64%;在0. 010、0. 100 mg/kg和1.000 mg/kg添加水平下唑啉草酯在秸稈中的平均回收率為76. 7%～84.4%，RSDs為4.35%～9. 36%。在0.010、0.100 mg/kg和1. 000 mg/kg添加水平下，唑啉草酯代謝物M4在麥粒中的平均回收率為81. 9%～89.4%，RSDs為5. 51%～13. 90%。在0.050、0.100 mg/kg和0. 500 mg/kg添加水平下，唑啉草酯代謝物M4在秸稈中的平均回收率為74. 5%～89. 2%，RSDs為3.14%～15. 60%（表5）。唑啉草酯在麥粒、秸稈中的定量限分別為0. 001 mg/kg和0.01 mg/kg;唑啉草酯代謝物M4在麥粒、秸稈中的定量限分別為0.01 mg/kg和0.05 mg/kg，該方法的回收率、準確度、精密度、靈敏度均滿足《農作物中農藥殘留試驗準則》的檢測要求。

3結論與討論

本研究采用QuEChERS方法進行樣品前處理，建立了UPLC-MS/MS測定小麥麥粒和秸稈中唑啉草酯及其代謝物M4的殘留分析方法。提取溶劑的選擇與目標化合物的溶解性質以及目標化合物存在的基質有關。常用的有機提取溶劑有乙腈、甲醇、正己烷、丙酮、乙酸乙酯、二氯甲烷等，其中乙腈對大多數農藥具有良好的溶解性以及較小的雜質溶出度，甲醇也是一種比較好的提取溶劑，但其揮發性較大，而且與水互溶，往往容易造成提取后共存的水分難以除去。而提取溶劑酸化具有保證目標物的穩定性，提高提取效率的作用。QuEChERS方法常用的凈化材料有C18、PSA、GCB、無水硫酸鎂和多壁碳納米管等，其中C18可吸附樣品中的脂肪和蛋白質，PSA主要吸附樣品中的脂肪酸和糖類雜質，GCB主要去除植物中的葉綠素等雜質，無水硫酸鎂可去除樣品中的水分。本文篩選了唑啉草酯與唑啉草酯代謝物M4在麥粒和秸桿基質中最佳提取溶劑與最佳凈化劑。在0. 000 5～0.5mg/L范圍內，唑啉草酯和唑啉草酯代謝物M4的濃度與色譜峰面積均呈現良好的線性關系;在0. 001、0.010 mg/kg和0. 100 mg/kg添加水平下，唑啉草酯在麥粒中的平均回收率為77. 6%～90.4%，RSDs為1.71%～3.64%;在0. 010、0.100 mg/kg和1.000 mg/kg添加水平下唑啉草酯在秸稈中的平均回收率為76. 7%～84.4%，RSDs為4.35%～9.36%。在0. 010、0.100 mg/kg和1.000 mg/kg添加水平下，唑啉草酯代謝物M4在麥粒中的平均回收率為81. 9%～89.4%， RSDs為5.51% N13. 90%。在0. 050、0.100 mg/kg和0.500 mg/kg添加水平下，唑啉草酯代謝物M4在麥粒中的平均回收率為74. 5%～89. 2%，RSDs為3.14%～15. 60%。唑啉草酯在麥粒、秸稈中的定量限分別為0. 001 mg/kg和0. 01 mg/kg;唑啉草酯代謝物M4在麥粒、秸稈中的定量限分別為0. 01mg/kg和0.05 mg/kg。與韓何丹等建立的HPLC-MS/MS測定唑啉草酯的方法相比，本研究的定量限更低，靈敏度更高。該方法快速簡便，準確可靠。與JMPR上提供的HPLC-MS/MS測定唑啉草酯代謝物M4的方法相比，該方法經濟快速，操作簡單。