四川獼猴桃灰霉病菌對4種殺菌劑的抗藥性檢測

裴艷剛　朱宇航　歲立云等

中圖分類號：S 481.4 文獻標識碼：A DOI：10.16688/j.zwbh. 2020229科普愛好者提供一個便捷準確的外來入侵植物自動識別和調查工具，大大降低了經濟和時間成本。調查監測人員或用戶可以通過該APP系統隨時隨地拍攝入侵植物圖像并上傳到云服務器，該系統實現了用戶點對點服務，實現外來入侵植物信息查詢、圖像自動識別、入侵植物采集點地圖顯示和專家遠程鑒定、圖像識別歷史查詢等功能。目前對35科135種入侵植物平均識別率達到85. 3%，可在1～2s內將識別結果反饋至用戶客戶端。由于一部分入侵植物圖像來自網絡，圖像質量不高，以及部分種類的入侵植物的圖片收集不全等，影響了入侵植物的準確識別率。后續的研究，一方面需要提高入侵植物的圖片質量和樣本量，包括入侵植物在不同生境和發育階段的圖片;另一方面，針對一些入侵植物存在多種本地同屬近緣種或形態相似種的情況，還需要增加本地植物圖片庫，以進一步提升入侵植物的識別精度和識別率。但針對一些目前形態識別不準的入侵植物，該系統的后臺專家實時支撐系統則明顯彌補了這一不足，并且通過大量圖片的不斷積累，也增加了后續識別的精度。

我國外來入侵植物種類數遠遠不止本研究識別采樣的種類數，調查人員利用本系統調查和拍攝入侵植物的圖像識別，記錄了識別入侵植物的種類和發生位置，后期可以通過大數據挖掘與分析獲得各地的入侵植物發生、分布和危害情況，這對我國外來入侵植物的實時調查監測和早期預警防控與研判應對具有極為重要的防控決策指導價值。

獼猴桃Actinidia chinensis Planch因含有多種微量元素、氨基酸及豐富的維生素和礦物質，被譽為“水果之王”。獼猴桃原產于中國，20世紀40年代，經新西蘭培育后廣泛種植，現已成為世界上重要的經濟作物之一。隨著國內獼猴桃栽培面積的不斷擴大，灰霉病在四川、陜西和湖北等全國各地的獼猴桃產區均有發生，獼猴桃灰霉病的危害也日益突出，成為獼猴桃的主要病害之一。灰霉病菌Botrytiscinerea在獼猴桃生長期侵染葉片、花萼和果實，造成落葉、花腐和果腐癥狀，在貯藏期造成果實軟腐，嚴重威脅獼猴桃產業的健康發展。目前國內外對于獼猴桃灰霉病的防治仍以化學防治為主，用于生產上防治灰霉病的藥劑主要有苯胺基嘧啶類、苯吡咯類、二甲酰亞胺類和酰胺類化學殺菌劑。由于灰霉病菌具有繁殖迅速、遺傳變異快和適應力強等特點，這些殺菌劑的連續使用使其極易產生抗藥性，導致灰霉病菌對很多不同類型殺菌劑產生不同程度的抗性。據報道，湖南、福建、江蘇和山東等多個地區的葡萄、草莓、番茄、黃瓜等果蔬植物上的灰霉病菌已經對嘧霉胺、腐霉利兩種傳統化學藥劑產生較高的抗藥性;在日本大阪番茄上、我國江蘇草莓上的灰霉菌對異菌脲抗性頻率分別高達86.4%、64.6%;苯吡咯類殺菌劑咯菌腈作為一種新型殺菌劑具有較好的田間防控效果，2019年山東蓬萊葡萄灰霉菌對咯菌腈抗性頻率僅為9.47。前人對以上幾種殺菌劑進行抗藥性檢測的結果表明，不同寄主植物、不同生態區的灰霉病菌的抗性頻率不盡相同。

近年來關于灰霉病菌抗藥性的報道多見于葡萄、番茄、草莓等寄主植物，針對獼猴桃灰霉病抗藥性的研究鮮有報道，在實際生產中用于獼猴桃灰霉病菌防控的藥劑種類和施藥頻次亦未見報道，四川獼猴桃灰霉病菌對嘧霉胺、咯菌腈、腐霉利和異菌脲等幾種常見殺菌劑的抗藥性尚不明確。本試驗基于田間防控灰霉病用藥的實際情況，廣泛采集四川主要獼猴桃產區灰霉病樣本，并采用MIC法測定獼猴桃灰霉菌對4種殺菌劑的抗藥性，旨在探明獼猴桃灰霉病菌對常見殺菌劑的抗性頻率、敏感類型及多重抗藥性，為獼猴桃灰霉病藥劑的選擇提供理論依據。

1材料與方法

1.1供試藥劑

97%嘧霉胺原藥、98%咯菌腈原藥、98%腐霉利原藥、96%異菌脲原藥均由四川國光農化股份有限公司提供。

1.2四川省獼猴桃灰霉病田間用藥情況調查

2016年3月至2018年11月，在四川都江堰、彭州、雙流、蒲江、雅安、綿竹、蒼溪和安州等獼猴桃種植區隨機選擇125個發生灰霉病的果園，調查并記錄種植戶在栽培管理過程中為防控獼猴桃灰霉病施用的藥劑名稱及次數，統計主要藥劑種類和施用的頻次。根據調查結果，結合其他寄主灰霉病的抗藥性檢測情況，最終篩選出用于四川獼猴桃灰霉病菌的抗藥性檢測的藥劑。

1.3菌株的采集與分離

2016年—2018年，從四川都江堰、彭州、雙流、蒲江、雅安、綿竹、蒼溪和安州等8個獼猴桃主要種植區采集獼猴桃病葉、病花和病果，癥狀如圖1所示。將采集的樣品帶回實驗室18～20℃濕潤培養2d后，將具有灰霉病特征的病組織放置于解剖鏡下，采用龔國淑等的單孢分離法在PDA培養基上進行純化，再利用形態特征結合分子生物學方法進行鑒定，共獲得灰葡萄孢菌122株（表1），于4℃冰箱保存備用。

1.4含藥培養基的制作

嘧霉胺、咯菌腈、腐霉利和異菌脲的鑒別濃度分別為1.0、0.1、1.0μg/mL和5.0μg/mL。準確稱取各種原藥0.1 g，然后用丙酮溶解后加入少量吐溫-80乳化，配制成濃度為1000μg/mL的母液，再用滅菌水將嘧霉胺、咯菌腈、腐霉利和異菌脲的母液稀釋為鑒別濃度的10倍，分別為10、1、10、50μg/mL。在無菌環境下，分別將稀釋后的4種藥劑溶液與滅菌后冷卻到60℃的PDA培養基按1：9比例混合充分搖勻，配成最終濃度為1.0、0.1、1.0μg/mL和5.0μg/ml_的含藥培養基，倒入直徑90 mm的培養皿中，以無菌水代替藥劑作為對照，用于抗藥性測定。

1.5獼猴桃灰霉病菌對4種殺菌劑抗藥性頻率的測定

采用最低抑制濃度法（MIC法）檢測獼猴桃灰霉病菌對不同殺菌劑的抗藥性頻率。將菌種在PDA培養基上20℃下活化3d后，再轉至d=90 mmPDA平板上培養3d。用5mm滅菌打孔器打取菌落邊緣生長一致的菌餅若干，接種于含藥的PDA平板中央，每皿放置一塊，每處理3個重復，置于20℃恒溫培養箱中持續培養3d，敏感菌株的界定為不能或幾乎不能在鑒別濃度下正常生長，抗性菌株為能在該濃度下正常生長。

1.6統計分析

采用Excel軟件統計各個區域的抗性菌株發生頻率和抗性類型。

抗性頻率=抗性菌株數/所測菌株總數×100%。

2結果與分析

2.1四川獼猴桃灰霉病防控的藥劑種類及施用情況

對四川125個獼猴桃果園用藥情況的調查及數據統計結果表明，種植戶針對獼猴桃灰霉病防控所施用的藥劑（主要成分）主要有嘧霉胺、異菌脲、腐霉利、啶酰菌胺、嘧菌環胺、多菌靈、甲基硫菌靈和咯菌腈等8種（表2）。2016年上述8種藥劑的施藥次數分別為165、86、87、23、16、26、15次和13次，累計施藥431次，平均每個果園施藥3.45次;2017年施藥次數分別為145、96、74、36、18、22、17次和12次，累計施藥420次，平均每個果園施藥3. 36次;2018年施藥次數分別為141、128、72、54、25、17、15次和15次，累計施藥467次，平均每個果園施藥3. 74次。嘧霉胺、異菌脲和腐霉利連續3年被高頻施用，但啶酰菌胺、嘧菌環胺、多菌靈、甲基硫菌靈和咯菌腈施用頻次相對較低。其中嘧霉胺施用頻次最高，2016年2018年3年中分別占總施用次數的38. 28%，34.52%和30.19%，呈現下降趨勢。同樣，腐霉利和多菌靈等傳統殺菌劑施用頻次均有不同程度下降;相反，異菌脲和啶酰菌胺施用頻次逐年增加，逐漸成為四川獼猴桃灰霉病防控的主要殺菌劑;嘧菌環胺、甲基硫菌靈和咯菌腈等施用頻次無明顯變化，僅在個別果園施用。根據以上結果可知，嘧霉胺、異菌脲和腐霉利這3種藥劑被大部分種植戶用于獼猴桃灰霉病的防控，故獼猴桃灰霉病菌對這3種藥劑的抗藥性情況亟須探明，另根據鄭媛萍等、紀明山等、李若晨等研究發現咯菌腈對其他寄主灰霉病菌防控效果較好，最終選擇嘧霉胺、異菌脲、腐霉利和咯菌腈4種藥劑用于抗藥性檢測，以進一步探究四川獼猴桃灰霉病菌對這4種藥劑的抗藥性狀況。

2.2獼猴桃灰霉病菌的抗性頻率和分布

由表3可知，四川8個獼猴桃種植區的122個灰葡萄孢Botrytis cinerea菌株群體對嘧霉胺、咯菌腈、腐霉利和異菌脲的抗性頻率分別為95. 08%、86. 07%、80. 33%和5.74%。其中對嘧霉胺敏感菌株有6株，抗性菌株有116株;對咯菌腈敏感菌株有17株，抗性菌株有105株;對腐霉利敏感菌株有24株，抗性菌株有98株;對異菌脲敏感菌株有115株，抗性菌株有7株。表明四川省獼猴桃灰霉病菌群體對嘧霉胺、咯菌腈和腐霉利3種藥劑已產生了較強的抗藥性，且抗性頻率都在80%以上，以嘧霉胺最高;試驗菌株對異菌脲的抗性頻率最低。針對同一藥劑，不同種植區的菌株抗性頻率不同，蒲江與雅安菌株對咯菌腈的抗性頻率均為100%，但綿竹與彭州菌株的抗性頻率分別是69. 23%和70. 00%;都江堰與安州菌株對腐霉利的抗性頻率均達到90%以上，而雅安菌株的抗性頻率只有66. 67%;蒲江、雅安與蒼溪3個區域未檢測到對異菌脲表現抗性的菌株。綜上表明，四川獼猴桃灰霉病菌已對嘧霉胺、咯菌腈、腐霉利產生了較高的抗藥性，對異菌脲產生了較低的抗藥性，迫切需要篩選新的殺菌劑防治獼猴桃灰霉病。

2.3獼猴桃灰霉病菌敏感性類型

根據對不同殺菌劑抗感性的不同，將122個菌株分為8種敏感性類型（表4），各類型分別占總菌株數的65. 57%、10. 65%、7.38%、5.74%、5.74%、2.46%、1.64%、0. 82%。其中Pyr^RFlu^RPcm^RIpr^S類型（對嘧霉胺、咯菌腈、腐霉利表現抗性，對異菌脲表現敏感）（圖2）的菌株有80株，占全部菌株的65. 57%，表明大部分菌株對嘧霉胺、咯菌腈和腐霉利產生抗性，而對異菌脲敏感。在122個灰葡萄孢菌株中，單抗菌株共12株，占總菌株數的9. 84%;雙抗菌株共23株，占總菌株數的18. 85%;三抗菌株共80株，占總菌株的65. 57%;對4種殺菌劑均產生抗性的菌株7株，占總菌株數的5.74%。說明四川省不同種植區的獼猴桃灰霉病菌抗藥性以三抗類型Pyr^RFlu^RPcm^RIpr^S為主，在防治獼猴桃灰霉病時，連續多次施用嘧霉胺、咯菌腈、腐霉利，導致獼猴桃灰霉病菌對這3種藥劑產生了抗藥性。異菌脲可以起到一定的防治效果。

3結論與討論

灰霉病菌具有繁殖快，遺傳變異快，適應能力強等特點，連續施用同一種化學藥劑容易產生抗藥性。本文結合實際生產中施用藥劑的種類和頻次，對四川獼猴桃灰霉病菌進行了抗藥性檢測，研究結果表明，來自四川獼猴桃的灰葡萄孢群體對嘧霉胺、咯菌腈、腐霉利和異菌脲等4種常用殺菌劑已產生了不同程度的抗藥性。其中嘧霉胺、腐霉利和異菌脲是防控灰霉病的傳統藥劑，已有多個省份報道在其他作物上產生了抗藥性，且抗性頻率較高。這3種藥劑也是四川獼猴桃灰霉病防控中施用頻率最高的藥劑，其中對嘧霉胺和腐霉利已產生較高的抗藥性。異菌脲與腐霉利同屬于二甲酰亞胺類殺菌劑，具有多作用位點，作用機理相似，且常常存在交互抗性，本試驗中獼猴桃灰霉病菌對異菌脲的抗性頻率（5.74%）遠低于腐霉利（80.33%），究其原因主要是腐霉利應用到獼猴桃灰霉病防治的時間更早，長期地施用導致灰霉病菌對其抗藥性更強。根據田間調查，咯菌腈僅偶爾用于防治獼猴桃灰霉病，但本研究顯示已產生了較高的抗藥性，關于灰霉病菌對咯菌腈的抗藥性鮮有報道，其抗藥性的產生是否與防治獼猴桃其他病害有關還有待調查。

灰葡萄孢對殺菌劑具有豐富的敏感性類型可能與用藥歷史，用藥水平、施藥方法、氣候特征、栽培條件等密切相關。本文發現四川獼猴桃灰霉病菌對嘧霉胺、咯菌腈、腐霉利、異菌脲共有8種敏感性類型，以三抗類型Pyr^RFlu^RPcm^RIpr^S（對嘧霉胺、咯菌腈、腐霉利表現抗性，對異菌脲表現敏感）類型為主（占65.57%），在8個獼猴桃產區均有發現，說明嘧霉胺、咯菌腈、腐霉利等3種殺菌劑對獼猴桃灰霉病的防治效果已不佳，且不宜混用。這一結果與喬廣行、劉圣明、張亞和鄭媛萍等人在番茄、草莓、葡萄等上的檢測結果相似，灰霉菌群體具有豐富的敏感性類型，且以抗多種殺菌劑的敏感性類型為主。但在四川獼猴桃灰霉病菌群體中發現的敏感性類型比其他作物更加豐富，可能由于四川潮濕多雨，灰霉病易暴發，加上獼猴桃產值高，果農為了快速控制病情，常常多種殺菌劑同時施用和頻繁施用，且隨意提高施用濃度，勢必導致多重抗藥性的產生。應注意藥劑的交替使用，并進一步監測獼猴桃灰霉病的周年流行動態，提前做好預測預報，避免盲目用藥。

本文在明確四川獼猴桃灰霉病菌對常用殺菌劑的抗藥性的前提下，建議在獼猴桃產區限制使用嘧霉胺、咯菌腈和腐霉利等3種殺菌劑，而異菌脲應與其他殺菌劑輪換使用，避免長期、大量地在同一產區使用。同時，還需進一步對更多殺菌劑進行抗藥性檢測，掌握灰霉病菌對不同殺菌劑抗性變化趨勢，篩選并應用高效防控藥劑。另外，還需建立完善的病害預測預警體系，合理搭配獼猴桃抗病品種，建造避雨設施及其配套措施，從而達到對獼猴桃灰霉病的綠色綜合防控。