燒雞中產(chǎn)芽孢菌的分離鑒定及耐受性比較研究

宋萌萌 黃天然 周興虎 張亞莉 黃明

摘 要：從燒雞中篩選出產(chǎn)芽孢菌，探究高溫巴氏殺菌后燒雞腐敗的主要原因。利用劃線純化法、革蘭氏染色法結(jié)合芽孢染色法從燒雞及其鹵湯中篩選出產(chǎn)芽孢菌，然后對(duì)菌株進(jìn)行16S rRNA分析及生理生化鑒定，確定菌株的種屬，并對(duì)菌株的生長(zhǎng)曲線及耐鹽、耐酸和耐熱性進(jìn)行研究。結(jié)果表明：從燒雞及其鹵湯中共篩選分離出4 株革蘭氏陽(yáng)性芽孢桿菌，分別為海水芽孢桿菌（Bacillus aquimaris）、黃海芽孢桿菌（Bacillus marisflavi）、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌（Bacillus methylotrophicus）和地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis），其中，地衣芽孢桿菌的生長(zhǎng)繁殖速度最快，至6 h就基本進(jìn)入生長(zhǎng)穩(wěn)定期;海水芽孢桿菌和黃海芽孢桿菌的耐鹽性最強(qiáng)，在NaCl質(zhì)量濃度達(dá)到12 g/100 mL時(shí)仍然有部分存活;甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌的耐酸性最強(qiáng)，在pH值4.5條件下培養(yǎng)6 h后菌落數(shù)能夠達(dá)到約8（lg（CFU/mL））;在4 株產(chǎn)芽孢菌中，地衣芽孢桿菌的耐熱性最強(qiáng)，且不受處理溫度和時(shí)間的影響。

關(guān)鍵詞：燒雞;產(chǎn)芽孢菌;分離鑒定;腐敗;耐受性

Isolation and Identification of Spore-Forming Bacteria from Braised Chicken and Comparison of

Their Environmental Tolerance

SONG Mengmeng1，2， HUANG Tianran1， ZHOU Xinghu1， ZHANG Yali2， HUANG Ming1，2，*

（1.National R&D Center for Poultry Processing， Jiangsu Research Center for Livestock and Poultry Products Processing Engineering Technology， Nanjing Huangjiaoshou Food Science and Technology Co. Ltd.， Nanjing 211225， China;

2.Key Laboratory of Meat Processing and Quality Control， Ministry of Education， College of Food Science and Technology，

Nanjing Agricultural University， Nanjing 210095， China）

Abstract： This study was conducted to select spore-forming strains from braised chicken for the purpose of figuring out the major cause of its spoilage after high-temperature pasteurization. The target strains were isolated from braised chicken and the remaining marinade by the streak plate method as well as through Gram staining and spore staining and were identified as Bacillus by 16S rRNA analysis and physiological and biochemical characterization. Their growth curves and tolerance to salt， acid and heat were investigated. The results indicated that a total of four Gram-positive Bacillus were obtained and they were identified as B. aqimaris， B. marisfavi， B. methyltrophicus and B. licheniformis. Among them， B. licheniformis grew fastest， which entered the stationary phase of growth at 6 h. In the presence of 12 g/100 mL NaCl solution， B. aquimaris and

B. marisflavi survived partially， showing the highest salt tolerance. B. methylotrophicus could grow to ～ 8 （lg （CFU/mL）） after 6 h cultivation at pH 4.5， having the highest acid resistance. B. licheniformis was the most heat resistant among the four strains ， which was not affected by heat treatment temperature and time.

Keywords： braised chicken; spore-forming bacteria; isolation and identification; spoilage; tolerance

DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210817-203

中圖分類號(hào)：TS251.1? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A 文章編號(hào)：1001-8123（2021）10-0018-07

引文格式：

宋萌萌， 黃天然， 周興虎， 等. 燒雞中產(chǎn)芽孢菌的分離鑒定及耐受性比較研究[J]. 肉類研究， 2021， 35（10）： 18-24. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210817-203.? ? http：//www.rlyj.net.cn

SONG Mengmeng， HUANG Tianran， ZHOU Xinghu， et al. Isolation and identification of spore-forming bacteria from braised chicken and comparison of their environmental tolerance[J]. Meat Research， 2021， 35（10）： 18-24. DOI：10.7506/rlyj1001-8123-20210817-203.? ? http：//www.rlyj.net.cn

燒雞是我國(guó)典型的傳統(tǒng)醬鹵肉制品，至今已有幾百年的歷史，因其濃郁的香味以及獨(dú)特的口感，備受中國(guó)消費(fèi)者的喜愛(ài)和關(guān)注，有著“天下第一雞”的美稱[1]。燒雞營(yíng)養(yǎng)豐富，水分活度高，微生物很容易在其表面和內(nèi)部大量繁殖而引起腐敗。鹵煮是燒雞的主要加工步驟，其溫度相對(duì)較低，雖然可以導(dǎo)致大部分細(xì)菌的死亡，但對(duì)于超耐熱的微生物，尤其是一些細(xì)菌的芽孢，則難以殺滅[2]。

引起食品腐敗的微生物，除了普通的假單胞菌、大腸桿菌、乳酸菌屬等，還有芽孢桿菌屬[3]。芽孢桿菌屬是革蘭氏陽(yáng)性桿菌[4]，在空氣、土壤[5]甚至外太空[6]中都有分布，在不利條件下產(chǎn)生的芽孢能夠存活數(shù)年[7]，這種休眠體結(jié)構(gòu)復(fù)雜[8]，對(duì)熱[9]、紫外線[10]、化學(xué)物質(zhì)[11]、溶菌酶[12]、干燥[13]具有很強(qiáng)的抗逆性，是造成肉制品腐敗[14]

和食源性疾病[15-16]的主要原因，并且很難通過(guò)巴氏殺菌方式除去[17]。芽孢在食品中存在的原因有以下幾點(diǎn)：1）巴氏殺菌幾乎殺死了所有具有潛在競(jìng)爭(zhēng)作用的營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞;2）產(chǎn)芽孢菌會(huì)附著于不銹鋼表面，形成生物膜，生物膜脫落時(shí)釋放的芽孢會(huì)導(dǎo)致食品在加工過(guò)程中被污染。當(dāng)外界環(huán)境適宜時(shí)，食品中殘留的芽孢便開(kāi)始萌發(fā)，導(dǎo)致食品腐敗變質(zhì)，甚至在代謝過(guò)程中產(chǎn)生毒素。芽孢主要通過(guò)以下2 種方式致病：1）存在于食品中的芽孢在萌發(fā)時(shí)產(chǎn)生毒素，消費(fèi)者食用了被芽孢毒素污染的食品;2）消費(fèi)者食用了有芽孢殘留的食品，芽孢在人體腸道內(nèi)萌發(fā)，產(chǎn)生毒素，從而誘發(fā)食源性疾病。并且，芽孢可污染多種食品，包括肉類、蔬菜、水果、糧食等，給食品行業(yè)帶來(lái)巨大挑戰(zhàn)。研究燒雞中的產(chǎn)芽孢菌有助于了解燒雞腐敗的原因，改善燒雞保鮮方法。

細(xì)菌種屬的鑒定方法分為2 種，一種是經(jīng)典法，即通過(guò)肉眼及顯微鏡觀察菌落形態(tài)、染色結(jié)果，并檢測(cè)碳、氮源的利用等;另一種是分子法，其中最常見(jiàn)的是16S rRNA測(cè)序。16S rRNA基因存在于所有細(xì)菌的基因組中，保守性高，可用來(lái)揭示菌種之間的親緣關(guān)系。此外，多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST）也被用于菌種鑒定，是一種基于核酸序列測(cè)定的細(xì)菌分型方法，能夠分析菌株的變異，具有較高的分辨能力。16S rRNA測(cè)序具有高度的靈敏性和特異性，且速度快，檢測(cè)能力強(qiáng)，被廣泛應(yīng)用于菌種鑒定、菌群結(jié)構(gòu)及數(shù)量測(cè)定等[18-19]。

因此，本研究從燒雞及其老鹵湯中分離篩選出其中的產(chǎn)芽孢菌，通過(guò)生理生化反應(yīng)和16S rRNA鑒定確認(rèn)分離出的產(chǎn)芽孢菌株的種類，然后對(duì)其生長(zhǎng)曲線和耐酸、耐鹽、耐熱性進(jìn)行研究，為肉品中產(chǎn)芽孢菌的控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

燒雞由某食品科技有限公司提供。

營(yíng)養(yǎng)瓊脂、革蘭氏染色試劑盒、生理生化鑒定管? ?南京丁貝生物科技有限公司;LB肉湯 南京沃博生物科技有限公司;芽孢染色試劑盒 南京邁博生物科

技有限公司;氯化鈉（分析純） 國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SG403A生物安全柜 美國(guó)Baker公司;B1-150A生化培養(yǎng)箱 施都凱儀器設(shè)備（上海）有限公司;Multitron Standard振蕩培養(yǎng)箱 伊孚森生物技術(shù)（中國(guó)）有限公司;Allegra-64R高速冷凍離心機(jī) 美國(guó)Beckman公司;HH-W恒溫水浴箱 金壇市恒豐儀器制造有限公司;Scope.A1正置熒光顯微鏡 德國(guó)Carl Zeiss公司;FP-1100-C全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀 芬蘭Bioscreen公司。

1.3 方法

1.3.1 采樣

老鹵：吸取1 mL燒雞鹵湯于9 mL無(wú)菌生理鹽水中，渦旋。

燒雞：拭子蘸取無(wú)菌生理鹽水，在燒雞的口腔處選擇合適的取樣框進(jìn)行涂抹，另取幾只新的拭子，分別在腹腔、腿及表皮處涂抹，取樣完成后將拭子放入10 mL生理鹽水中，渦旋。

1.3.2 分離純化

采用傾注法，吸取1 mL上述均質(zhì)液于無(wú)菌培養(yǎng)皿中，37 ℃培養(yǎng)48 h，挑取可疑單菌落進(jìn)行劃線分離。觀察并記錄純化單菌落的表面狀況、凸起情況、邊緣狀況、菌落形狀、表面光澤、菌落顏色、透明程度等。再次挑取可疑純化單菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)（37 ℃、180 r/min、24 h）。

1.3.3 染色鏡檢

革蘭氏染色：使用革蘭氏染色試劑盒染色，油鏡觀察。

芽孢染色采用Schaeffer-Fulton法[20]：活化的菌懸液按體積分?jǐn)?shù)1%接種于LB液體培養(yǎng)基，搖床（37 ℃、220 r/min）培養(yǎng)72 h，吸取1 mL用磷酸鹽緩沖鹽溶液（phosphate buffered saline，PBS）離心（7 000 r/min、15 min、4 ℃）洗滌4 次，棄上清液，取沉淀重懸于PBS中，適量稀釋。涂片，自然干燥后，吸取適量孔雀綠染色液覆蓋涂片，弱火間斷加熱染色10 min后，沖洗去多余染色液;干燥后用芽孢復(fù)染液覆蓋染色2～3 min，用水沖洗，晾干后鏡檢觀察。

1.3.4 生理生化鑒定

參照《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》[21]中芽孢菌屬鑒別特征，選擇生理生化指標(biāo)進(jìn)行菌種的初步鑒定。

1.3.5 16S rRNA鑒定

純化分離的菌懸液送至上海凌恩生物科技有限公司進(jìn)行16S rRNA鑒定，使用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)，確定菌種并上傳獲得登錄號(hào)。

1.3.6 生長(zhǎng)曲線測(cè)定

將活化的菌懸液接種于LB肉湯，調(diào)節(jié)菌懸液濃度為4（lg（CFU/mL））。吸取400 μL于全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀自帶的孔板中，用全自動(dòng)生長(zhǎng)曲線分析儀測(cè)定600 nm波長(zhǎng)處光密度（OD600 nm）（儀器參數(shù)：溫度37 ℃、時(shí)間24 h）;剩余樣品搖床（37 ℃、220 r/min）培養(yǎng)24 h，每3 h取一次樣，進(jìn)行適宜梯度稀釋并涂板計(jì)數(shù)，繪制生長(zhǎng)曲線[22]。

1.3.7 耐鹽性測(cè)定

配制NaCl質(zhì)量濃度分別為1、3、6、9、12 g/100 mL的LB營(yíng)養(yǎng)肉湯，接入4（lg（CFU/mL））菌懸液，搖床（37 ℃、220 r/min）培養(yǎng)12 h，涂板計(jì)數(shù)[23]。

1.3.8 耐酸性測(cè)定

將約6（lg（CFU/mL））的菌懸液接種于pH值分別為2.5、3.5、4.5、6.5、7.0的LB營(yíng)養(yǎng)肉湯中，搖床（37 ℃、220 r/min）培養(yǎng)6 h后，涂板計(jì)數(shù)[24]。

1.3.9 耐熱性測(cè)定

將活化的菌懸液以4（lg（CFU/mL））接種于LB營(yíng)養(yǎng)肉湯中，37 ℃培養(yǎng)12 h。于85、90、95 ℃水浴分別處理0、5、15、25 min，迅速冰浴，平板計(jì)數(shù)，并求出D值[25]。D值是一定溫度條件下殺死細(xì)菌中90%原有活菌所需要的時(shí)間，計(jì)算公式如下。

式中：t為處理時(shí)間/min;a為初始菌數(shù)/（CFU/mL）;b為經(jīng)一定時(shí)間（t）處理后的菌數(shù)/（CFU/mL）。

1.4 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（n=3）。微生物計(jì)數(shù)以菌落形成單位的對(duì)數(shù)值（lg（CFU/mL））表示，采用Origin 9.0軟件進(jìn)行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 燒雞及其鹵湯中產(chǎn)芽孢菌的分離

共篩選出4 個(gè)可疑菌落，分別編號(hào)為T17、T19、T27和T29，對(duì)這4 株可疑菌株進(jìn)一步鑒定。

2.1.1 分離菌株的單菌落形態(tài)觀察及染色結(jié)果

觀察記錄4 個(gè)菌落的形態(tài)特點(diǎn)，如表1所示。

通過(guò)Schaeffer-Fulton法對(duì)培養(yǎng)菌液染色，由圖1可知，可疑菌株T17、T19、T27、T29染色后，通過(guò)油鏡均能觀察到呈現(xiàn)綠色的芽孢，說(shuō)明這4 株菌均能生成芽孢。此外，從菌體（紅色）形態(tài)觀察可知，4 株菌的菌體都呈桿狀。

2.1.2 生理生化鑒定結(jié)果

依據(jù)《常見(jiàn)細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊(cè)》和《伯杰氏細(xì)菌鑒定手冊(cè)》，進(jìn)行生理生化指標(biāo)測(cè)定，結(jié)果如表2所示。結(jié)合菌落形態(tài)（表1）可初步判斷篩選出的菌株T17、T19、T27、T29均屬于芽孢桿菌屬。

2.1.3 16S rRNA鑒定結(jié)果

將分離出的4 株菌進(jìn)行16S rRNA鑒定，并上傳序列至Genbank以獲得登錄號(hào)。由表3可知，4 株菌的相似度均達(dá)到99%以上，說(shuō)明16S rRNA鑒定結(jié)果較好。4 株菌分別為海水芽孢桿菌、黃海芽孢桿菌、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。

2.2 燒雞及其鹵湯中芽孢桿菌的生長(zhǎng)特性

2.2.1 不同芽孢桿菌的生長(zhǎng)曲線

通過(guò)繪制生長(zhǎng)曲線，了解各芽孢桿菌生長(zhǎng)特性，為后續(xù)各菌培養(yǎng)時(shí)間提供參考。由圖2可知，各株芽孢桿菌在LB肉湯中的生長(zhǎng)特性有所不同，但菌落數(shù)最終都能達(dá)到9～10（lg（CFU/mL））。菌株T17（海水芽孢桿菌）在0～12 h處于增長(zhǎng)期，12～18 h生長(zhǎng)緩慢，18 h后生長(zhǎng)較為穩(wěn)定（圖2A）;T19（黃海芽孢桿菌）前6 h生長(zhǎng)緩慢，6～12 h為快速生長(zhǎng)期，12 h后菌落數(shù)緩慢增加（圖2B）;T27（甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌）在0～6 h為生長(zhǎng)遲緩期，6～15 h為生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，而后生長(zhǎng)緩慢（圖2C）;T29（地衣芽孢桿菌）在前6 h呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，6 h后生長(zhǎng)緩慢（圖2D）。

海水芽孢桿菌、黃海芽孢桿菌和甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌3 株芽孢桿菌在3～12 h期間生長(zhǎng)最快，12 h基本穩(wěn)定，符合芽孢桿菌的生長(zhǎng)特性[26]。陳秀秀等[27]分離的凝結(jié)芽孢桿菌也有類似的生長(zhǎng)趨勢(shì)，菌株在4 h進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，14 h進(jìn)入穩(wěn)定期。并且，4 株芽孢桿菌在37 ℃培養(yǎng)結(jié)束后菌落數(shù)能達(dá)到8～10（lg（CFU/mL）），這與游佳欣等[28]實(shí)驗(yàn)結(jié)果相似，枯草芽孢桿菌在35 ℃條件下培養(yǎng)，菌落數(shù)可達(dá)8.56（lg（CFU/mL）），其中地衣芽胞桿菌的生長(zhǎng)繁殖速度較快，6 h之后緩慢增長(zhǎng)，魏強(qiáng)等[29]也得出了類似結(jié)果，地衣芽孢桿菌在3 h開(kāi)始快速增長(zhǎng)。

2.2.2 不同芽孢桿菌的耐鹽性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將初始菌落數(shù)約為4（lg（CFU/mL））的菌液接種于含不同質(zhì)量濃度NaCl的LB營(yíng)養(yǎng)肉湯中，搖床培養(yǎng)12 h后計(jì)數(shù)。由圖3可知，在低質(zhì)量濃度NaCl（≤3 g/100 mL）培養(yǎng)肉湯中，對(duì)4 株芽孢桿菌的生長(zhǎng)幾乎無(wú)影響，其菌落數(shù)可達(dá)到8～10（lg（CFU/mL））。當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度達(dá)到6 g/100 mL時(shí)，4 株芽孢桿菌的生長(zhǎng)均受到不同程度的抑制作用，其中菌株T19（黃海芽孢桿菌）和T27（甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌）受到的抑制作用較小，而T29（地衣芽孢桿菌）的菌落數(shù)小于初始菌落數(shù)。NaCl質(zhì)量濃度為9 g/100 mL時(shí)，除了T19，其余芽孢桿菌的菌落數(shù)均低于初始值。而T17（海水芽孢桿菌）和T19（黃海芽孢桿菌）在NaCl質(zhì)量濃度達(dá)到12 g/100 mL時(shí)依然有約3（lg（CFU/mL））的菌存活。

含低質(zhì)量濃度NaCl（≤3 g/100 mL）的LB營(yíng)養(yǎng)肉湯對(duì)本研究中芽孢桿菌的生長(zhǎng)沒(méi)有影響，高質(zhì)量濃度NaCl（>6 g/100 mL）不利于芽孢桿菌的生長(zhǎng)，這與駱琦[30]從燒雞老湯中篩選出的枯草芽孢桿菌的耐鹽性一致，NaCl質(zhì)量濃度高于5 g/100 mL時(shí)，枯草芽孢桿菌的生長(zhǎng)受到抑制，當(dāng)NaCl質(zhì)量濃度達(dá)到12 g/100 mL時(shí)，有些芽孢桿菌則不生長(zhǎng)。陳蒙恩等[31]分離的一株產(chǎn)香芽孢桿菌在NaCl質(zhì)量濃度小于10 g/100 mL時(shí)有生長(zhǎng)，NaCl質(zhì)量濃度大于10 g/100 mL時(shí)則無(wú)生長(zhǎng)，與本研究結(jié)果類似。菌株T17（海水芽孢桿菌）和T19（黃海芽孢桿菌）表現(xiàn)出高耐鹽性，其耐鹽機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)自身耐鹽基因的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)[32]。

2.2.3 不同芽孢桿菌的耐酸性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

將初始菌落數(shù)約為6（lg（CFU/mL））的菌液在不同pH值條件下培養(yǎng)6 h。由圖4可知，當(dāng)培養(yǎng)基pH值為6.5時(shí)，4 株芽孢桿菌的生長(zhǎng)基本不受影響。當(dāng)pH<4.5時(shí)，所有芽孢桿菌的菌落數(shù)均小于初始菌落數(shù)。在分離出的4 株芽孢桿菌中，菌株T27（甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌）耐酸能力最強(qiáng)，當(dāng)pH值為4.5時(shí)，仍能生長(zhǎng)良好且菌落數(shù)最終達(dá)到約8（lg（CFU/mL））。菌株T17（海水芽孢桿菌）和T19（黃海芽孢桿菌）耐酸能力較弱，當(dāng)培養(yǎng)基pH值為5.5時(shí)，培養(yǎng)6 h后，其菌落數(shù)低于初始菌落數(shù)。而T29（地衣芽孢桿菌）在pH≥5.5時(shí)，生長(zhǎng)繁殖不受影響，說(shuō)明地衣芽孢桿菌耐酸能力較好。4 株菌在pH值為2.5時(shí)菌落數(shù)很少，李新等[33]分離的沙福芽孢桿菌的耐酸性實(shí)驗(yàn)也有類似的結(jié)果，在pH值為2左右時(shí)，菌株的生長(zhǎng)很微弱。

2.2.4 不同芽孢桿菌的耐熱性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

由圖5可知，4 株芽孢桿菌經(jīng)過(guò)85、90、95 ℃水浴處理5 min后，菌落數(shù)下降4～8（lg（CFU/mL））。且隨著處理溫度的升高，芽孢桿菌的存活率下降。85 ℃和95 ℃熱處理菌株T17時(shí)，15 min前菌落數(shù)呈下降趨勢(shì)，但是當(dāng)處理時(shí)間大于15 min后，殘存菌落數(shù)不降反升;而在90 ℃條件下，T17菌落數(shù)隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而減少，當(dāng)處理時(shí)間達(dá)到25 min時(shí)，T17營(yíng)養(yǎng)體細(xì)胞被全部殺滅。菌株T19在3 個(gè)不同溫度條件下，菌落數(shù)均隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)而減少，但處理5 min后，菌落數(shù)減少緩慢。相對(duì)于其他3 株菌，T27處理5 min能得到最大致死數(shù)，菌落數(shù)下降約8（lg（CFU/mL）），但繼續(xù)持續(xù)加熱時(shí)，T27的菌落數(shù)基本不變。在不同溫度熱處理5 min時(shí)，T29的菌落數(shù)減少值（4（lg（CFU/mL）））遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于T27的減少值（8（lg（CFU/mL）））;且隨著處理時(shí)間延長(zhǎng)，T17和T19的殘存菌落數(shù)都呈現(xiàn)不同程度的下降，而處理5 min之后，T29的菌落數(shù)隨著處理溫度的升高及處理時(shí)間的延長(zhǎng)減少較小。

5 min的熱處理可以有效殺滅大部分芽孢桿菌營(yíng)養(yǎng)體，但5 min后，不同的芽孢桿菌對(duì)溫度呈現(xiàn)出不同程度的抗性。這可能是由于隨著溫度和處理時(shí)間的變化，菌株細(xì)胞膜中的長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸比例升高，增加其耐熱性[34]。

85 ℃處理下芽孢桿菌的存活率高于90 ℃和95 ℃，這與謝曉佩等[35]從西藏牦牛的新鮮糞便中分離出的枯草芽孢桿菌的耐熱性相似。另外，由于T29（地衣芽孢桿菌）在不同溫度條件下處理5 min時(shí)的存活率整體較高，且處理5 min后其菌落數(shù)基本不受處理溫度和時(shí)間的影響，說(shuō)明地衣芽孢桿菌在4 株菌中的耐熱性最強(qiáng)。在90 ℃條件下處理5 min后，T29（地衣芽孢桿菌）的耐熱性在每個(gè)時(shí)間點(diǎn)均高于其余菌株，這與羅鵬[36]的結(jié)果類似，即地衣芽孢桿菌在90 ℃的耐熱性較好。

2.2.5 地衣芽孢桿菌的D值

T29（地衣芽孢桿菌）的耐熱性優(yōu)于其他3 株菌，因此，制作T29的耐熱性曲線。由圖6可知，不同溫度熱處理?xiàng)l件下T29的D值分別為：D85 ℃=24.36 min（R2=0.978 69）、D90 ℃=17.19 min（R2=0.780 78）、D95 ℃=78.93 min（R2=0.891 72）。在95 ℃時(shí)，D值不降反升，而羅鵬[36]所分離的地衣芽孢桿菌在90 ℃條件下的D值大于100 ℃條件下;吳霜[37]發(fā)現(xiàn)，蠟樣芽孢桿菌的D值隨著溫度的升高而降低，這與本研究結(jié)果不符，可能是由于在95 ℃處理時(shí)，部分營(yíng)養(yǎng)體裂解生成芽孢，芽孢的抗熱性是營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞的104 倍，主要是由于芽孢核內(nèi)2，6-吡啶二羧酸的存在，此種成分的積累使芽孢核內(nèi)水分排出，導(dǎo)致芽孢核水分含量極低，從而增加了抗熱性[38-39]。

3 結(jié) 論

經(jīng)純化篩選，燒雞及其鹵湯中共分離得到4 株芽孢桿菌，通過(guò)生理生化鑒定以及16S rRNA鑒定確認(rèn)為海水芽孢桿菌、黃海芽孢桿菌、甲基營(yíng)養(yǎng)型芽孢桿菌和地衣芽孢桿菌。測(cè)定4 株菌的生長(zhǎng)曲線，并分別進(jìn)行耐受性實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明：地衣芽孢桿菌最快進(jìn)入生長(zhǎng)對(duì)數(shù)期，到6 h基本穩(wěn)定;4 株菌都呈現(xiàn)出不同程度的耐酸和耐鹽能力，而地衣芽孢桿菌耐熱性在4 株菌中最強(qiáng)，這為燒雞中芽孢的防控及貨架期的延長(zhǎng)提供了很好的理論依據(jù)。

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收稿日期：2021-08-17

基金項(xiàng)目：國(guó)家現(xiàn)代農(nóng)業(yè)（肉雞）產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-41-Z06）;

南京市科技計(jì)劃項(xiàng)目（國(guó)際聯(lián)合研發(fā)項(xiàng)目）（202002040）

第一作者簡(jiǎn)介：宋萌萌（1998—）（ORCID： 0000-0002-4993-132X），女，碩士研究生，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工和質(zhì)量控制。

E-mail： 2020108022@stu.njau.edu.cn

*通信作者簡(jiǎn)介：黃明（1970—）（ORCID： 0000-0001-9026-1850），男，教授，博士，研究方向?yàn)樾螽a(chǎn)品加工和質(zhì)量控制。

E-mail： mhuang@njau.edu.cn