山羊地方性鼻內腫瘤病毒（ENTV-2）SYBR-GreenI實時熒光定量PCR檢測方法的建立與應用

張靖鵬 江錦秀 林裕勝 游偉 劉道泉 毛坤明 江斌 胡奇林

摘要：【目的】建立一種快速、敏感的ENTV-2檢測方法，用于ENT的早期診斷與流行病學調查?！痉椒ā客ㄟ^生物信息學的方法將ENTV-2與ENTV-I. ERVs. JSRV進行比對，尋找ENTV-2的保守序列并設計1對特異性引物，建立SYBR-Green I實時熒光定量PCR檢測方法，對所建立的PCR反應條件進行優化，將PCR擴增產物連接T載體構建的陽性質粒作為標準品，對SYBR-Green I實時熒光定量PCR檢測方法的特異性、敏感性和重復性進行驗證?！窘Y果】建立的檢測ENTV-2 qPCR方法標準曲線呈現良好的線性關系（R2=0.992）;該方法的特異性良好，對ENTV-2可以產生特異性擴增曲線，與 ENTV-2高度同源的ERVs沒有交叉反應，也無法擴增羊口瘡病毒（ ORFV）、綿羊肺炎支原體（ Mo）、絲狀支原體山羊業種（Mmc）等常見病原;敏感性良好，最低檢測限度為7.5×102 copies uL-1，敏感性可達常規PCR檢測方法的100倍;批內、批問的變異系數CV

關鍵詞：山羊地方性鼻內腫瘤病毒;SYBR-Green I;熒光定量PCR

中圖分類號：S 852.62

文獻標志碼：A

文章編號：1008-0384（ 2021） 07-077906

A SYBR-Green I RT-qPCR Assay for Detecting Enzootic

Nasal Tumor Virus in Goats

ZHANG Jingpeng 1， JIANG Jinxiu 1. LIN YuSheng 1， YOU Wei 1， LIUDaoquan 2，

MAO Kunming 3， JIANG Bin 1. Hu Qilin 1*

（1.Institute ofAnimal Husbandry and Veterinary Medicine. Fuzhou， Fujian 350013，China;2 Fuzhou Animal Disease

Prevention and Control Center. Fuzhou， Fujian

350002. China; 3.Fuqing Technical Service Center of

Animal Husbandry and Veterinary Medicine. Fuzhou， Fujian

350300. China）

Abstract： 【Objective】 A rapid， sensitive detection method for early diagnosis and epidemiological survey on enzootic nasaltumor （ENT） in goats was established.【Method】 Bioinformatics methods were employed for sequence alignment of ENTV-2with ENTV-1. ERVs. and JSRV in search for the conserved sequence of the virus. Primers for qPCR were designed to establisha SYBR-Green I RT-qPCR methodology for its detection. Reaction conditions were optimized， and a standard positive plasmidused to determine the specificity， sensitivity， and reproducibility of the newly developed assay. 【Result】A linear standardcurve was found for the detection with a R2=0.992. The method specifically detected only ENTV-2. not the highly homologousERVs， nor amplified ORFV， MO， or Mmc. It showed a detection sensitivity of up t0 7.51×102 copies·UL-1， which was 100times greater than the conventional PCR can deliver，a repeatability with a coefficient variations （CV） of less than l% on intra-and inter-batch tests. and a positive detection rate of 17.3% on 81 clinical samples. 【Conclusion】 The newly establishedSYBR-Green I RT-qPCR was specific， sensitive， repeatable. and considered adequate for early and rapid detection of ENTV-2in goats.

Key words： Enzootic nasal tumor virus of goats（ENTV-2）; SYBR-Green I ; RT-qPCR

0 引言

【研究意義】山羊地方性鼻內腫瘤（ Enzootic nasaltumor，ENT）是由山羊地方性鼻內腫瘤病毒（Enzooticnasal tumor virus of goats，ENTV-2）導致的鼻甲骨篩骨上皮細胞惡性轉化而發生的慢性、進行性、接觸性傳染病，該病的臨床特征主要表現為病羊食欲減退，呼吸困難，鼻漏，鼻腔內出現單側或兩側性增生物[1-2];后期可導致鼻甲骨變形，眼部突出，病程3個月到1年，通常以死亡為轉歸;該病的發病率為0.5%～15%，致死率可高達100%，白1939首次于德國報道以來，陸續在歐洲，亞洲，美洲，非洲等地被報道[3-4];國內于1995年首次報道，目前在湖南、四川、重慶、福建等地也有發生[5-7]。該病無特效藥物，也沒有疫苗用于預防，一旦出現臨床癥狀就只能淘汰，給羊的養殖業造成巨大損失和潛在威脅。由于ENT的臨床癥狀與細菌、支原體、過敏等癥狀相似，僅通過臨床癥狀難以對病原進行鑒別診斷，因此急需一種敏感、特異的方法對發病羊和羊群進行早期診斷，以便對感染羊進行淘汰，保護健康羊群。【前人研究進展】傳統的鑒定方法是通過臨床初步判斷結合剖檢發現鼻腔內贅生物而確診，但此方法不適用于該病的早期診斷，ENTV-2尚未建立體外培養體系[8]，導致血清學檢測方法的研究進展緩慢，因此分子生物學檢測方法就成為ENT早期診斷的主要研究方向。Cousens C.[9]結合RT-PCR與限制性內切酶分析建立了鑒定ENTV的方法;郝中香等[10]建立了一種快速檢測ENTV的RT-PCR方法，該方法最低可檢測出6 pg的ENTV; Apostolidi等[11]建立了Taqman實時熒光定量PCR以檢測ENTV，該方法可檢出到102 RNA轉錄本;Huang等[12]建立了基于EvaGreen的實時熒光定量PCR檢測方法并報道該方法的靈敏度可以達到3.0×10i copies·uL-l?！颈狙芯壳腥朦c】ENTV-2與綿羊肺腺瘤病毒（JSRV）及普遍分布于山羊和綿羊細胞基因組中的內源性反轉錄病毒（ ERVs）高度同源[13]。本研究通過基因信息學方法尋找與上述病毒有較大差異的ENTV-2保守基因?！緮M解決的關鍵問題】通過基因信息學的方法分析17株ENTV-2，并與ENTV-1（ Enzootic nasaltumor

vlrus

of

sheep）、

ERVs（ Endogenousretroviruses）、 JSRV（ Jaagsiekte sheep Retrovirus）進行比對，尋找其相對保守片段設計引物，建立檢測ENTV-2的SYBR-Green I實時熒光定量PCR檢測方法，以期對ENTV-2進行早期診斷并應用于該病的流行病學調查。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1菌（毒）株及臨床樣品 山羊鼻內腫瘤病毒（ENTV-2）、羊腎細胞、山羊皮膚細胞、綿羊肺細胞、羊口瘡病毒（ ORFV）、牛冠狀病毒（BCV）、綿羊肺炎支原體（ Mo）、絲狀支原體山羊亞種（Mmc）由本實驗室分離鑒定保存，山羊支原體山羊肺炎亞種（ Mccp）由蘭州獸醫研究所儲岳峰博士惠贈，81份羊鼻拭子樣品，為2017 2019年采集白福建省各地山羊養殖場。

1.1.2主要試劑和儀器 病毒RNA/DNA提取試劑盒、脫氧核糖核酸酶I（ DNasel）及反轉錄試劑盒TransScript?Reverse Transcriptase購白北京全式金生物技術有限公司，Hieff UNICON? Power qPCR SYBRGreen Master Mix購白Yeasen Biotech公司，pMD18-T、Nase-Free Water、DNA Marker，均購白寶生物工程（大連）有限公司，膠回收試劑盒、質粒提取試劑盒為天根生化科技有限公司產品;熒光定量PCR儀為Eppendorf公司生產。

1.2試驗方法

1.2.1引物設計合成 根據Genbank上已公布的17株ENTV的LTR區保守的基因片段，應用引物設計軟件DNAStar和Primer Premier 5.0，經NCBIBLAST對比驗證，設計1對引物，上游引物S1-140E：GAGATTTCTTACACATGAGAGC下游弓『物R2-140E： TCCCAGGACTTAACCATTC，引物的特異性目的片段，長度為143 bp。

1.2.2 RNA的提取及反轉錄 依照EasyPure ViralDNA/RNA Kit的說明書提取ENTV的RNA， 70℃保存， 參照TransScript One-STEP gDNA Removal andcDNA synthesis SuperMix的說明書去除基因組DNA并將RNA反轉錄為cDNA， 20℃保存。

1.2.3常規PCR 以1.2.2中獲得的cDNA為模板，按郝中香等[10]設計的引物和PCR方法進行。

1.2.4標準品的構建 利用方法1.2.2中獲得的cDNA為模板，以方法1.2.1設計的引物對ENTV-2進行PCR擴增。以20 uL PCR擴增體系：模板1 ul、上、下游引物各1 ul（終濃度0.5 umol·L-l）、Premix Taq 10 uL、加ddH20 7 uL。反應條件：94℃2 min;94℃30s、55℃15 s、72℃15 s，循環數為35;最后72℃延伸10 min。通過凝膠電泳實驗將PCR產物回收純化后克隆至pMD18-T載體上，然后轉化至大腸桿菌DH5a中，擴大培養、提取重組質粒，送生工生物有限公司進行測序。將序列正確的重組質粒作為陽性標準品，并用NanoDrop2000測定標準品的核酸含量。

1.2.5 qPCR反應條件的優化 20 uL反應體系，上下游引物S1-140E與R2-140E（ 10 umol·L-l）各1 uL，模板1 uL，SYBR Green Master Mix 10 uL，補水至20uL。擴增反應條件初步設定為：94℃預變性2min;94℃變性15 s，60℃退火15 s，72℃延伸15 s，40個循環;最后72℃延伸5 min。分別用55～65℃作為PCR反應的退火溫度，引物濃度（0.2、0.4、0.8、1.0、1.5、1.75、2.0 pmol·L-l）對反應條件進行優化，溶解曲線參數按儀器默認參數設置。

1.2.6 qPCR的特異性試驗 分別從山羊皮膚細胞、綿羊肺細胞與羊腎細胞中提取DNA作為內源性羊鼻內腫瘤病毒（ ERVs）的陽性樣本，羊口瘡病毒（ ORFV）、牛冠狀病毒（BCV）、綿羊肺炎支原體（ Mo）、絲狀支原體山羊亞種（Mmc）、山羊支原體山羊肺炎亞種（ Mccp）以及1.2.2中得到的羊鼻內腫瘤病毒（ENTV-2）cDNA為模板，按1.2.5反應體系和優化后的反應條件進行qPCR。

1.2.7敏感性試驗 以方法1.2.4中構建的標準陽性質粒為模板，用1.2.5的方法對其進行擴增，其擴增片段長度為146 bp，初始質量濃度23 ng·uL-l，換算成拷貝數約7.51×109.將其10倍倍比稀釋（109～100copies·uL-1）后，從中各取其1uL為模板，按最佳條件進行qPCR反應，以確定建立的qPCR的敏感性。同時，用1.2.3中的常規PCR方法與本實驗建立的qPCR方法進行比較。

1.2.8重復性試驗 對10 7、105、103 copies·uL-l的標準品DNA進行批內和批間重復性試驗。其中批內重復性試驗每個梯度設計3個平行重復，分析批內樣品的重復性;同時，對每個梯度再重復3次試驗，對比這3次試驗結果，分析批間樣品的重復性。

1.2.9臨床檢測 采用上述qPCR方法，設立陰性、陽性對照，對臨床上隨機采集的81份山羊鼻子進行檢測，并和常規PCR方法進行比較。

1.3數據統計與分析

平均數、變異系數通過Excel對數據進行整理分析;質粒的分子量換算為拷貝數濃度通過公式：拷貝·uL-l=（ ng·uL-l×109）×（ 6.02×1023）/（ DNA

length×660）進行換算;其余數據由Eppendorf熒光定量PCR儀白帶軟件進行分析。

2結果與分析

2.1 qPCR條件優化

優化后的反應體系為：SYBR Green I Master Mix10 uL，上下游引物各0.8 uL，模板1 uL，加去離子水至20 uL。最佳反應條件：94℃預變性2min，94℃15 s，60℃15 s，72℃15 s，40個循環，熔解曲線按儀器默認參數設置，熔解曲線參數：95℃5s，60℃30 s，95℃15 s，1個循環，退火延伸時檢測熒光信號。

2.2標準品的標準曲線

將1.2.4中構建的標準陽性質粒用EASY Dilution按10倍稀釋作為模板，進行SYBRGreen I PCR擴增，以模板濃度為X軸，Ct值為Y軸，繪制標準曲線。如圖1所示，模板濃度與Ct值的線性關系良好，相關系數R--0.992，直線方程：y=3.221×lgx+37.77，溶解曲線由圖2可見，熔解曲線TM值1.3±0.2℃，無引物二聚體及非特異峰現。

2.3特異性

運用建立的ENTV-2 SYBR-Green I qPCR方法檢測ENTV-2、山羊皮細胞、山羊腎細胞、綿羊肺細胞、ORFV、BCV、Mo、Mmc、Mccp等病原的基因組DNA，結果僅ENTV-2呈陽性，其他均為陰性，說明用本方法檢測ENTV-2與羊內源性鼻內腫瘤病毒及羊常見病毒均無交叉反應，特異性較好（圖3）。

2.4敏感性

將拷貝數為7 51×109 copies·uL-l的陽性標準質粒從7.51×10 7 copies·uL-l稀釋至7.51×10 0 copies·uL-l，進行qPCR試驗，結果顯示敏感性為7.51×102copies·uL-l，同時以常規PCR方法進行檢測，常規PCR的靈敏度為7.51×10 4 copies·uL-I。

2.5重復性

對7.51×10 3、7.51×10 5和7.51×10 7 copies·uL-l的陽性標準質粒進行檢測，每個濃度設3個重復，進行批內重復性試驗;進行批間試驗時對同一次試驗的每個濃度設3個重復，共檢測3次。結果如表1：批內、批間重復試驗的變異系數均小于l%，表明該方法重復性良好。

2.6臨床樣品的檢測

熒光定量PCR的部分結果見圖4，對81份臨床樣品以qPCR方法和常規PCR方法進行平行檢測，結果如表2顯示，二者同為陽性的數量為10份，二者同為陰性數量為67份，常規PCR檢測出10份陽性，71份為陰性，檢出率為12.3%，而qPCR方法檢出14份陽性，陰性67份，檢出率17.3%，說明本研究建立的qPCR方法敏感性高于常規PCR。二者的符合率為95.1%（ 77/81）。

3討論與結論

羊地方性鼻內腫瘤（ ENT）是一種在國內外較廣泛傳播的疾病，除了新西蘭和澳大利亞外，大部分國家均有報道。隨著國內山羊飼養規模的擴大和活畜貿易的頻繁，該病在一些地區頻繁發生，其高致死率給羊產業的健康發展帶來了嚴重挑戰，尤其影響了羊種質資源。該病毒有較長的潛伏期，在病羊和帶毒羊中可長期存在[14]，由于缺乏免疫應答，尚無疫苗可用于該病的防治[14]，因此，早期的診斷可以及時淘汰病羊，對該病的防控有重要意義。然而，該病的血清學檢測方法尚未實現，早期建立的傳統PCR方法敏感性不夠。本試驗通過對ENTV-2已發表的序列與ENTV-I、JSRV、ERVs等進行比對分析，找到了ENTV-2的保守特異性位點，建立了ENTV-2 SYBR-Green I熒光定量PCR檢測方法。

實時熒光定量PCR具有敏感性高、特異性強等優點，現已廣泛應用于分子生物學相關試驗，較傳統PCR而言，其檢測過程只需在熒光定量PCR儀上進行，擴增情況可以實時顯示于儀器自帶的軟件，檢測結果可通過Cf值和陽性標準曲線對樣品中的DNA進行定性和定量，無需進行凝膠電泳分析，縮短了試驗的時間，提高檢測的效率，近年來在動物疫病檢測中也得到廣泛應用，Ortin等[15]、林裕勝等[16-17]對絲狀支原體山羊亞種和綿羊肺炎支原體分別建立了SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測方法，汪偉等[18]建立了SYBR Green I熒光定量PCR的方法用于檢測山羊關節炎腦炎病毒，Wang Y[19]應用SYBR Green I實時熒光定量PCR對ORFV進行了檢測，付明哲等[20]建立了基于Eva Green染料的實時熒光定量PCR方法檢測小反芻獸疫病毒，這些方法的建立不斷地完善了羊病的檢測體系。由于ENT沒有有效的疫苗和治療藥物，一旦在羊場中出現，需要可靠的檢測方法和流行病學調查及時清除患病羊，而該病早期的臨床癥狀不明顯，易與其他上呼吸道疾病混淆，而且鼻拭子中的病毒含量較低，對敏感性的要求比較高，因此，熒光定量PCR非常適用于該病的檢測。本試驗建立了ENTV-2的SYBR GreenI實時熒光定量PCR檢測方法，該方法在7.51×10---7.51×10 7 copies·uL-l有良好的線性關系（ R2=0.992），最低檢測限度為7.51×10 2 copies·uL-l，比傳統PCR敏感性高100倍，該方法有較強的特異性，與內源性逆轉錄病毒（ ERVs）、羊口瘡病毒（ORFV）等病原均無交叉反應，應用本研究建立的qPCR方法和傳統PCR方法對81份臨床樣品進行檢測，檢出率分別為17.3%和12.3%，敏感性高于傳統PCR方法，而相較于Apostolidi等[11]建立的Taqman實時熒光定量PCR的方法，SYBR Green I實時熒光定量PCR檢測方法不需要合成昂貴的探針，只需要合成常規引物，昂貴的探針，相比之下更為經濟實用。

目前國內外關于ENTV-2檢測方法的報道較少，主要原因在于ENTV-2與ERVs、ENTV-I和JSRV均有較高的同源性，因此本研究通過設計針對ENTV-2特異性的引物，理論上排除了與ERVs、ENTV-l和JSRV交叉的可能性;并且應用山羊皮膚細胞、羊腎細胞、綿羊肺細胞作為對照，結果證明內源性逆轉錄病毒無法通過該方法擴增出來。ENTV-I和JSRV2種病毒只感染綿羊，目前尚無報道自然感染山羊的病例，所以試驗中沒有進行驗證，后續研究中應進行驗證。ERVs對檢測有一定的干擾，可以通過DNase I的酶切反應對宿主基因組DNA進行降解，以排除ERVs的干擾，但是增加該反應有可能帶人少量RNase導致病毒RNA部分降解，因此，利用傳統PCR進行檢測將漏檢相當一部分病例，而本研究基于SYBR Green I的實時熒光定量PCR檢測方法不僅特異性和重復性好，敏感性也達到7.51×102 copies·uL-l，為ENTV-2感染的早期檢測和流行病學調查提供了可靠的方法。

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（責任編輯：黃愛萍）

收稿日期：2020-1204初稿;2021-0325修改稿

作者簡介：張靖鵬（ 1988-），男，碩士，研究實習員，主要從事動物傳染病研究（E-mail： 870063543@qqcom）

通信作者：胡奇林（ 1963-）.男，研究員，主要從事動物傳染病學利免疫學研究（E-mail： hq1562713@163.com）

基金項目：福建省科技重大專項（2019N209007）：福建省科技計劃公益類專項（2018Rl023—1）