LncRNA SNHG3通過調控miR-410-3p對膿毒癥血管內皮細胞增殖、凋亡的影響*

宋 蕾，張建國，劉英勛

（山東省青島市城陽區人民醫院重癥醫學科，青島 266109）

膿毒癥主要是由感染引發的全身炎癥反應的綜合征，是ICU 常見的一種疾病，感染源主要有真菌、病毒、細菌和寄生蟲等，嚴重時可引發休克或死亡，病死率高達30%[1-2]。據統計，每年超過3 000萬人次確診為膿毒癥，其發病機制較為復雜，可導致心、肝、腎等重要器官損傷[3-4]。脂多糖（LPS）是革蘭陰性細菌感染疾病的主要因素，也常用于誘導建立膿毒癥細胞模型[5]。長鏈非編碼RNA（lncRNA）小核仁RNA 宿主基因3（SNHG3）在多種疾病中異常表達，位于染色體1p35.3上，與多種疾病的增殖、凋亡等生物學過程密切相關[6]。Zhang等[7]研究結果顯示，SNHG3在缺氧和葡萄糖剝奪誘導腦微血管內皮細胞（BMVEC）中高表達，利用干擾shRNA技術，沉默SNHG3 可以明顯抑制葡萄糖剝奪誘導腦微血管內皮細胞BMVEC 的增殖、轉移，誘導其細胞凋亡，但是在膿毒癥的研究尚不明確。miRNA 可以作為膿毒癥的潛在生物標志物，如miR-25、miR-133a、miR-146、miR-150 和miR-223 等，與疾病的分期、預后有關[8]。有研究發現，miR-410-3p 在LPS 誘導的小鼠心肌細胞中低表達，miR-410-3p 通過抑制TLR2減緩膿毒癥心肌細胞的損傷[9]。因此，本研究通過LPS誘導建立膿毒癥血管內皮細胞模型，探討SNHG3 通過調控miR-410-3p 對膿毒癥血管內皮細胞增殖、凋亡的影響及其作用機制，旨在為膿毒癥的研究提供新的潛在標志物。

1 材料與方法

1.1 樣本收集 收集2018 年7 月至2019 年2 月青島市城陽區人民醫院收治的25例膿毒癥患者（研究組）以及同期在本院行體格檢查的25例健康志愿者（對照組）的血清，其中對照組排除血液系統疾病、嚴重肝、腎功能障礙等。研究組中男15 例，女10例，年齡18～65 歲；對照組中男12 例，女13 例，年齡23～57歲。本研究已取得本院倫理委員會批準。所有參與者均已簽署知情同意書。

1.2 細胞和主要試劑 人臍帶靜脈內皮細胞（HUVECs）購自美國ATCC 公司。LPS、MTT 試劑盒購自美國Sigma公司；10%胎牛血清、DMEM培養基購自Gibco 公司；Lipofectamine 2000 試劑盒、Trizol 試劑盒購自美國Invitrogen 公司；si-NC、si-SNHG3、miR-NC、miR-410-3p、anti-miR-NC 和anti-miR-410-3p 購自廣州銳博公司；引物購自上海吉瑪公司；反轉錄試劑盒、熒光定量試劑盒購自大連寶豐公司；凋亡試劑盒購自碧云天公司；CyclinD1抗體、Bax抗體、GAPDH抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；IgG抗體購自北京百奧萊博公司；雙熒光素酶報告系統試劑盒購自南京凱基生物公司。

1.3 細胞培養和處理 HUVECs用含有10%胎牛血清的DMEM培養基，并置于37 ℃、5%CO2恒溫培養箱中培養。取對數生長期的HUVECs 接種于6 孔板，每孔3×104個，用10 μg/mL 的LPS 處理細胞后，將si-NC、si-SNHG3、miR-NC、miR-410-3p、antimiR-NC 和anti-miR-410-3p 轉染至HUVECs 細胞。轉染時參照Lipofectamine 2000 說明書進行，轉染48 h后收集細胞。正常培養且未轉染的細胞作為對照（Con組）。

1.4 qRT-PCR 法檢測SNHG3 和miR-410-3p 的表達 取血清及HUVECs細胞，Trizol法提取總RNA，檢測其濃度和純度，反轉錄合成cDNA，配置反應體系，以cDNA 為模板，在ABI 7500 型PCR 儀（Applied Biosystems公司）上進行PCR擴增。PCR反應條件：95 ℃預變性6 min；95 ℃變性30 s，60 ℃退火40 s，72 ℃延伸45 s，共40 個循環。SNHG3 和miR-410-3p分別以GAPDH和U6為內參，采用2-ΔΔCt法計算SNHG3和miR-410-3p相對表達量。引物序列如下：SNHG3 上游：5’-GACTTCCGGGCACTTCGTAA-3’，下游：5’-TGCTCCAAGTCTGCCAAAGA-3’；miR-410-3p 上游：5’-CCGCCA ATATAACACAGATGGCC-3’，下游：5’-GGGTCCGAGGTATTCGCACCAGAGC-3’。

1.5 MTT 法檢測細胞增殖 收集HUVECs，以1×104個/孔細胞密度接種于96 孔板，培養48 h 后棄去各組細胞培養基，每孔內加入20 μL MTT 溶液，4 h后加入150 μL DMSO試劑，遮光反應5 min，用酶標儀檢測各孔490 nm波長處的吸光度（OD）值。

1.6 流式細胞術檢測細胞凋亡率 收集HUVECs細胞，以4×105個/孔細胞密度接種于6 孔板，加入500 μL 結合緩沖液，重懸細胞，參照凋亡試劑盒說明書，分別加入5μL Annexin V-FITC 及10μL PI 試劑，避光反應15 min 后置于流式細胞儀，計算細胞凋亡率。

1.7 Western blotting 法檢測CyclinD1、Bax 蛋白表達 收集HUVECs 細胞，裂解后提取細胞總蛋白，取20 μg 蛋白上樣，SDS-PAGE 電泳分離蛋白，將蛋白轉移至PVDF膜；5%脫脂牛奶封閉2 h后，加入一抗（CyclinD1、Bax 均為1:500）4 ℃孵育過夜；洗膜，加入HRP 標記的山羊抗兔IgG 抗體（1:2 000）室溫孵育2 h；ECL顯影、曝光，Lane 1D軟件分析蛋白條帶灰度值，以目的蛋白條帶灰度值與內參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值為目的蛋白表達量。

1.8 雙熒光素酶實驗驗證SNHG3和miR-410-3p的靶向關系 Starbase 預測SNHG3 和miR-410-3p 互補結合序列，構建SNHG3 野生型載體（SNHG3-wt）和突變型載體（SNHG3-mut），并與miR-NC 或miR-410-3p共轉染至HUVECs細胞，收集轉染24 h的細胞，按照雙熒光素酶報告檢測試劑盒說明書，檢測熒光素酶活性。

1.9 統計學方法 用SPSS 23.0 統計軟件分析數據，計量資料以均數±標準差（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 SNHG3 和miR-410-3p 在膿毒證患者血清及LPS 誘導的HUVECs 中的表達 與對照組比較，研究組血清SNHG3 表達顯著升高，miR-410-3p 表達顯著降低（均P＜0.05），見表1；與Con 組比較，LPS組SNHG3 表達顯著升高，miR-410-3p 表達顯著降低（均P＜0.05），見表2。

表1 SNHG3和miR-410-3p在膿毒證患者血清中的表達，n=25

表1 SNHG3和miR-410-3p在膿毒證患者血清中的表達，n=25

與對照組比較，*P＜0.05。

表2 SNHG3和miR-410-3p在LPS誘導的HUVECs中的表達

表2 SNHG3和miR-410-3p在LPS誘導的HUVECs中的表達

與Con組比較，*P＜0.05。

2.2 沉默SNHG3對LPS誘導的HUVECs增殖和凋亡的影響 與Con 組比較，LPS 組SNHG3 表達、細胞凋亡率和Bax 蛋白表達顯著升高，細胞活力和CyclinD1 蛋白表達顯著降低（均P＜0.05）；與LPS+si-NC組比較，LPS+si-SNHG3組SNHG3表達、細胞凋亡率和Bax蛋白表達顯著降低，細胞活力和CyclinD1蛋白表達顯著升高（均P＜0.05），見圖1、表3。

圖1 沉默SNHG3對LPS誘導的HUVECs增殖和凋亡的影響

表3 沉默SNHG3對LPS誘導的HUVECs增殖和凋亡的影響

表3 沉默SNHG3對LPS誘導的HUVECs增殖和凋亡的影響

與Con組比較，*P＜0.05；與LPS+si-NC組比較，#P＜0.05。

2.3 SNHG3調控miR-410-3p的表達 通過在線生物信息網預測了SNHG3和miR-410-3p存在互補的核苷酸序列，見圖2。與miR-NC 組比較，miR-410-3p組SNHG3-wt熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），而SNHG3-mut熒光素酶活性沒有顯著變化，見表4。

表4 雙熒光素酶報告實驗驗證SNHG3與miR-410-3p的靶向關系

表4 雙熒光素酶報告實驗驗證SNHG3與miR-410-3p的靶向關系

與miR-NC組比較，*P＜0.05。

2.4 過表達miR-410-3p 對LPS 誘導的HUVECs 增殖和凋亡的影響 與Con 組比較，LPS 組miR-410-3p 表達、細胞活力和CyclinD1 蛋白表達顯著降低，細胞凋亡率和Bax蛋白表達顯著升高（均P＜0.05）；與LPS+miR-NC 組比較，LPS+miR-410-3p 組miR-410-3p表達、細胞活力和CyclinD1蛋白表達顯著升高，細胞凋亡率和Bax 蛋白表達顯著降低（均P＜0.05），見圖3、表5。

表5 過表達miR-410-3p對LPS誘導的HUVECs增殖和凋亡的影響

表5 過表達miR-410-3p對LPS誘導的HUVECs增殖和凋亡的影響

與Con組比較，*P＜0.05；與LPS+miR-NC組比較，#P＜0.05。

圖3 過表達miR-410-3p對LPS誘導的HUVECs增殖和凋亡的影響

2.5 抑制miR-410-3p可以逆轉沉默SNHG3對LPS誘導的HUVECs增殖和凋亡的影響 與LPS+si-NC組比較，LPS+si-SNHG3組miR-410-3p表達、細胞活力和CyclinD1 蛋白表達顯著升高，細胞凋亡率和Bax蛋白表達顯著降低（均P＜0.05）；與LPS+si-SNHG3+anti-miR-NC 組比較，LPS+si-SNHG3+antimiR-410-3p 組miR-410-3p 表達、細胞活力和CyclinD1 蛋白表達顯著降低，細胞凋亡率和Bax 蛋白表達顯著升高（均P＜0.05），見圖4、表6。

表6 抑制miR-410-3p可以逆轉沉默SNHG3對LPS誘導的HUVECs增殖和凋亡的影響

表6 抑制miR-410-3p可以逆轉沉默SNHG3對LPS誘導的HUVECs增殖和凋亡的影響

與LPS+si-NC組比較，*P＜0.05；與LPS+si-SNHG3+anti-miR-NC組比較，#P＜0.05。

圖4 抑制miR-410-3p可以逆轉沉默SNHG3對LPS誘導的HUVECs增殖和凋亡的影響

3 討論

休克、急性肺損傷、心肌損傷均為膿毒癥常見的并發癥，也是膿毒癥病死率較高的主要原因[10]。近年來越來越多的研究表明，lncRNA 在膿毒癥的發生、發展中具有重要作用。張思敏等[11]研究顯示，過表達FEZF1-AS1 或抑制miR-363-3p 可明顯抑制LPS 誘導HUVECs 增殖并促進凋亡，提示lncRNA FEZF1-AS1 靶向調控miR-363-3p 的表達抑制膿毒癥的發生。Zhang 等[12]研究發現，NEAT1 在膿毒癥患者肝組織和LPS 誘導的Raw264.7 細胞中表達上調，其通過調控Let-7a/TLR4 軸減輕LPS 誘導的肝損傷。Wu等[13]發現，沉默HOTAIR可以保護LPS誘導的膿毒癥小鼠的心臟功能。此外，有學者通過微陣列篩查差異表達lncRNA，發現MEG3在膿毒癥患者的血清中表達上調，與較高的死亡率和不良預后有關；沉默MEG3 可以抑制LPS 誘導的腎上皮細胞和心肌細胞凋亡[14]。Shan等[15]通過LPS刺激心肌細胞建立膿毒癥心肌細胞模型，結果顯示，H19在LPS誘導的心肌細胞中表達下調，過表達H19可明顯抑制LPS 誘導的心肌細胞凋亡和炎癥反應；H19 通過調節miR-93-5p/SORBS2軸抑制膿毒癥誘發的心肌細胞損傷。SNHG3在多種癌癥中表達上調，與腫瘤的大小、晚期TNM分期、淋巴結轉移和不良的預后顯著相關，參與細胞的增殖、凋亡和轉移等過程[16-17]。SNHG3 在肝癌組織中表達上調，敲低SNHG3可以明顯抑制肝癌細胞的增殖、遷移和上皮間質轉化，并促進癌細胞凋亡，SNHG3 調控miR-326促進肝癌細胞發展[18]。本研究中，SNHG3在膿毒癥患者血清和LPS誘導HUVECs細胞中的表達上調，沉默SNHG3 明顯抑制LPS 誘導HUVECs 增殖，誘導細胞凋亡，說明SNHG3 可以作為膿毒癥的潛在生物標志物。

miRNA 是非編碼RNA 的一員，沒有編碼蛋白的功能，可抑制或促進mRNA的翻譯及轉錄調控基因的表達，進而參與膿毒癥的發展[19]。黃鐘等[20]建立膿毒癥大鼠模型，結果顯示miR-128-3p 表達上調，沉默miR-128-3p 可明顯減緩大鼠急性肺損傷，抑制大鼠肺細胞凋亡和炎癥反應。Yuan等[21]發現，過表達miR-30a可抑制膿毒癥大鼠肝細胞增殖并誘導細胞凋亡；miR-30a 負調控SOCS-1 激活JAK/STAT 信號通路調控膿毒癥誘發的肝損傷。miR-126a-3p 在LPS 誘導的小鼠血管內皮細胞中表達下調，過表達miR-126a-3p 可以抑制血管內皮細胞的增殖和遷移，并誘導細胞凋亡[22]。

SNHG3 可調控下游多個miRNA 的表達，通過在線數據庫顯示，SNHG3 與miR-410-3p 存在互補結合位點。miR-410-3p 在多種癌癥和疾病中異常表達，如miR-410-3p在類風濕關節炎患者的滑膜組織和成纖維細胞樣滑膜細胞中表達下調，miR-410-3p通過下調YY1抑制類風濕關節炎細胞的增殖，阻滯細胞周期，促進細胞凋亡[23]。本研究結果顯示，miR-410-3p在膿毒癥患者血清和LPS誘導HUVECs中表達下調，過表達miR-410-3p可明顯抑制LPS誘導HUVECs細胞增殖，誘導細胞凋亡。進一步實驗結果顯示，SNHG3 可靶向調控miR-410-3p 的表達，抑制miR-410-3p逆轉了沉默SNHG3對LPS誘導的HUVECs 增殖和凋亡的作用。提示沉默SNHG3 可能通過上調miR-410-3p 表達抑制膿毒癥的發展，SNHG3/miR-410-3p 可作為膿毒癥的診斷和治療的新靶點。