circ_0030018靶向miR-1298抑制急性淋巴細胞白血病細胞KOCL44增殖和誘導其凋亡的實驗研究*

楊 璇，劉天民，陳婷婷，劉 青，吳舒懋，左立旻△

（1.四川電子科技大學醫學院附屬婦女兒童醫院 成都市婦女兒童中心醫院急診科，成都 611731；2.四川大學華西第二醫院病理科，成都 610041；3.四川電子科技大學醫學院附屬婦女兒童醫院 成都市婦女兒童中心醫院兒童心血管科，成都 611731）

急性淋巴細胞白血病（ALL）是兒童和青少年發病率較高的惡性腫瘤，以白血病細胞在骨髓大量聚集，骨髓正常造血功能受到抑制為特征[1]。雖然化療在一定程度上提高了ALL 患兒的長期無病生存率，但依然有部分患者對化療敏感性低，或者緩解后出現復發，預后不甚理想[2]。因此，全面了解ALL進展的潛在機制，尋找抑制ALL 細胞增殖、誘導其的凋亡方法有助于開發有效的ALL 防治策略。環狀RNA（circRNA）是一類具有典型封閉環狀結構的非編碼RNA，其長度介于100 到數千個核苷酸之間，其可與微小RNA（miRNA）結合，在功能上抑制miRNA 從而恢復miRNA 靶基因mRNA 表達，參與細胞多個生物學過程，與包括ALL在內的人類疾病進展息息相關[3]。研究發現circRNA 0030018（circ_0030018）在食管癌中表達增加，沉默circ_0030018通過上調miR-599 可抑制食管癌細胞增殖、遷移和上皮間質轉化（EMT）過程[4]。但circ_0030018 在ALL 中的表達和功能目前尚不清楚。把基因預測到miR-1298 是circ_0030018 的潛在靶點。研究報道miR-1298 低表達與胃癌患者淋巴結轉移、TNM分期有關，并預示胃癌患者無病生存期和總生存期較差[5]。miR-1298下調還可預測非小細胞肺癌患者的不良預后，過表達miR-1298對非小細胞肺癌的發生具有抑制作用[6]。基于上述已有研究，本研究分析了ALL 患者骨髓組織中circ_0030018 和miR-1298 表達水平，研究circ_0030018 對ALL 細胞KOCL44增殖、凋亡的影響，并以miR-1298為切入點探討其分子機制，旨在為臨床治療ALL 提供有效靶點。

1 材料與方法

1.1 組織來源

本研究所有組織樣本來源于2017 年7 月至2019年12月在本院血液腫瘤科就診的23例ALL患兒的骨髓組織。23 例ALL 患兒均為初診ALL 患兒，男13 例，女10 例，年齡2.3～14.5 歲，中位年齡10.0歲。同時期招募23健康志愿者作為對照組，其中男13 例，女10 例，中位年齡10.5 歲。對照組和ALL 組比較年齡、性別差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。本研究獲得本院醫學倫理委員會的批準，所有受試者監護人均簽署知情同意書。

1.2 細胞和試劑

人ALL 細胞KOCL44 購于美國限定培養物保藏中心；RPMI-1640培養液購于美國Gibco公司；Lipofectamine 2000 購于美國Invitrogen 公司；Prime-Script 逆轉錄試劑盒購于日本Takara 公司；通用型SYBR qPCR Master Mix 購于南京諾唯贊生物科技公司；小干擾RNA（si-RNA）、miRNA 模擬物（mimics）、miRNA抑制物（anti-miRNA）、重組熒光素酶質粒購于上海生工生物公司；細胞計數試劑盒（CCK-8）購于福州飛凈生物科技公司；miRNA逆轉錄試劑盒、膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC）/碘化丙啶（PI）凋亡檢測試劑盒購于北京百奧萊博生物公司；兔抗人裂解的半胱氨酸蛋白酶3（cleavedcaspase-3）多克隆抗體、兔抗人cleaved-caspase-9 單克隆抗體、兔抗人磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）多克隆抗體、山羊抗兔IgG二抗購于美國Abcam公司。

1.3 方法

1.3.1 實時定量PCR（qPCR）檢測circ_0030018 和miR-1298 表達 ALL 組于治療前采集骨髓4 mL，對照組于入院時采集骨髓4 mL，加入EDTA抗凝保存備用。用TRIzol 試劑從ALL 患者和健康志愿者骨髓組織中提取總RNA，然后使用PrimeScript逆轉錄試劑盒、miRNA 逆轉錄試劑盒將其反轉錄為cDNA。RT-qPCR 分析采用通用型SYBR qPCR Master Mix 進行。反應條件：95 ℃30 s；95 ℃10 s，60 ℃30 s，40 個循環。以GAPDH 為circ_0030018的內參，以U6為miR-1298的內參，采用2-ΔΔCt公式分析circ_0030018和miR-1298相對表達水平。

1.3.2 細胞的培養、轉染和分組 KOCL44 細胞接種到12%胎牛血清的RPMI-1640 培養液中，在37 ℃、飽和濕度、含5% CO2培養箱內培養。取2×105個對數期KOCL44細胞接種到6孔板，參照Lipofectamine 2000 說明書轉染si-RNA、miRNAs，最終濃度為100 nmol/L。轉染48 h后，收集細胞進行進一步分析。實驗分組如下：si-NC 組（轉染si-NC）、si-circ_0030018 組（轉染si-circ_0030018）、miR-NC組（轉染miR-NC）、miR-1298 組（轉染miR-1298 mimics）、si-circ_0030018+anti-miR-NC 組（轉染sicirc_0030018與anti-miR-NC）、si-circ_0030018+antimiR-1298 組（轉 染si-circ_0030018 與anti-miR-1298）。

1.3.3 平板克隆實驗檢測細胞克隆能力 按照5×102個/孔的密度接種細胞到6孔板，米字型轉動平板均勻分散細胞。放入培養箱孵育10～14 d，當出現細胞集落時終止培養。分別用4%多聚甲醛、0.1%結晶紫對細胞集落進行固定和染色。用流水緩慢沖去染色液，空氣干燥。在顯微鏡下計數大于50個細胞的集落形成數。

1.3.4 CCK-8 法檢測細胞活力 取5×103個KOCL44細胞接種96孔板上，常規培養48 h，每孔加入10 μL CCK-8 試劑，細胞再孵育2 h，細胞活力以酶標儀測得的450 nm處的光密度（OD）值表示。

1.3.5 流式細胞術檢測細胞凋亡率 PBS漂洗KOCL44 細胞兩次，加入1×結合緩沖液調整細胞密度為1×106個/mL。取100 μL 細胞懸液加入到流式管內，加入5 μL 的Annexin V-FITC 和PI，暗室染色15 min。流式細胞儀分析細胞凋亡情況。

1.3.6 蛋白質印記法檢測cleaved-caspase 3和cleavedcaspase 9 蛋白表達 向KOCL44 細胞中加入RIPA緩沖液，于冰上裂解細胞提取總蛋白，BCA 法進行蛋白定量。按照4∶1 比例將蛋白樣品與5×上樣緩沖液混勻，沸水浴3 min 變性蛋白。蛋白（30 μg/泳道）用10%十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離，通過標準濕式轉膜儀轉移蛋白至硝酸纖維素膜。將膜在5%脫脂牛奶中在室溫下封閉1 h。TBST洗滌后，用以下一抗4 ℃孵育過夜：抗cleaved-caspase-3 抗體（1 μg/mL）、cleaved-caspase-9 抗體（1:500）、內參GAPDH 抗體（1:2 500）。TBST 洗滌后，用1:2 000 的IgG 二抗室溫孵育1 h。用吸水紙吸去膜上過多液體，放在保鮮膜上，滴加化學發光試劑孵育2 min。采用化學發光成像儀分析目的蛋白表達量。

1.3.7 雙熒光素酶報告實驗 將含有miR-1298 假定結合位點的circ_0030018 野生型（WT）序列或突變型（MUT）序列克隆到pGL3 載體中，命名為WTcirc_0030018 或MUT-circ_0030018。使 用Lipofectamine 2000 將miR-1298 mimics、miR-NC 與WTcirc_0030018或MUT-circ_0030018共轉染細胞。轉染48 h后，根據雙熒光素酶報告基因檢測系統說明書測定細胞的相對熒光素酶活性。

1.4 統計學方法

采用SPSS 20.0 軟件進行數據處理，每組設置3個復孔，實驗獨立重復3次，實驗數據以均數±標準差（）表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較，采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為有統計學意義。

2 結果

2.1 circ_0030018 和miR-1298 在ALL 組和對照組單核細胞中的表達

與對照組相比，ALL組骨髓組織中circ_0030018表達量顯著升高（P＜0.05），miR-1298 表達量顯著降低（P＜0.05）。見圖1。

2.2 干擾circ_0030018 表達對ALL 細胞KOCL44增殖和凋亡的影響

與si-NC組比較，si-circ_0030018組KOCL44細胞circ_0030018 表達量、細胞OD 值、克隆形成數顯著下降（P＜0.05），凋亡率、cleaved-caspase 3 和cleaved-caspase 9 蛋白表達量顯著升高（P＜0.05），見圖2。

圖2 干擾circ_0030018表達對ALL細胞KOCL44增殖和凋亡的影響

2.3 miR-1298 過表達對ALL 細胞KOCL44 增殖和凋亡的影響

與miR-NC 組比較，miR-1298 組KOCL44 細胞miR-1298表達量、凋亡率、cleaved-caspase 3 和cleaved-caspase 9 蛋白表達量顯著升高（P＜0.05），細胞活力、克隆形成數顯著下降（P＜0.05）。見圖3。

圖3 miR-1298過表達對ALL細胞KOCL44增殖和凋亡的影響

2.4 circ_0030018靶向調控miR-1298的表達

Circular RNA Interactome 預測到circ_0030018與miR-1298 序列間存在互補位點，見圖4A。雙熒光素酶報告實驗顯示，同與WT-circ_0030018 共轉染，miR-1298組KOCL44細胞的相對熒光素酶活性顯著低于miR-NC 組（P＜0.05）；同與MUT-circ_0030018 共轉染，miR-1298 組KOCL44 細胞的相對熒光素酶活性與miR-NC 組比較無明顯變化（P＞0.05），見圖4B。pcDNA-circ_0030018 組KOCL44細胞miR-1298 表達量顯著低于pcDNA 組（P＜0.05）；si-circ_0030018 組KOCL44 細胞miR-1298 表達量顯著高于si-NC組（P＜0.05），見圖4C。

圖4 circ_0030018靶向調控miR-1298的表達

2.5 抑制miR-1298 表達逆轉了干擾circ_0030018表達對ALL細胞KOCL44增殖和凋亡的作用

與si-circ_0030018+anti-miR-NC組比較，sicirc_0030018+anti-miR-1298 組KOCL44 細胞miR-1298 表達量、凋亡率、cleaved-caspase 3 和cleavedcaspase 9 蛋白表達量顯著降低（P＜0.05），細胞活力、克隆形成數顯著升高（P＜0.05），見圖5。

圖5 抑制miR-1298表達逆轉了干擾circ_0030018表達對ALL細胞KOCL44增殖和凋亡的作用

3 討論

與長鏈非編碼RNA不同，circRNA主要由前體RNA反向剪切形成，具有高度穩定性和組織分布特異性，在人類癌中可能作為潛在的預后、診斷標記物和治療靶點。研究發現通過分析circ_0012152和circ_0001857表達能夠準確區分ALL和急性髓系白血病[7]。ALL 細胞中circ_0000745 上調可通過激活細胞外信號調節激酶（ERK）通路增加ALL 細胞活力、降低細胞凋亡率[8]。circRNA漿細胞瘤多樣異位基因1（circPVT1）在ALL 骨髓樣本中高表達，沉默circPVT1通過抑制其原癌基因c-Myc和抗凋亡蛋白B 細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）表達來抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡[9]。本研究探討了circ_0030018 在ALL 進展中的作用，結果表明ALL 患者骨髓組織中circ_0030018表達顯著上調，提示circ_0030018表達增加可能促進ALL 進展。進行功能缺失實驗驗證circ_0030018 功能，結果表明轉染si-circ_0030018 干擾circ_0030018 表達顯著降低KOCL44 細胞活力和克隆形成能力，增加細胞凋亡。與本研究中干擾circ_0030018 的抗癌作用一致，Song 等[10]指出膠質瘤組織、細胞中circ_0030018 表達增加，干擾circ_0030018阻礙了膠質瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，加速了細胞凋亡。當受到凋亡刺激時線粒體釋放的細胞色素C 會介導caspase 9 激活，活化的caspase 9進一步加工其他caspase成員，啟動caspase級聯，進而導致細胞凋亡，因此cleaved-caspase 9 和cleavedcaspase 3 常被用作細胞凋亡的重要標記物[11-12]。本研究中干擾circ_0030018顯著增加cleaved-caspase 9和cleaved-caspase 3 蛋白表達水平，這與干擾circ_0030018的促凋亡作用吻合。

miR-1298在多種惡性腫瘤中廣泛下調，具有抑癌因子作用。研究發現膠質瘤組織中miR-1298-5p低表達，與膠質瘤患者的高組織學分級顯著相關，可預測預后不良[13]。miR-1298 的下調與乳腺癌患者晚期進展顯著相關，過表達miR-1298可抑制乳腺癌細胞增殖，誘導凋亡和細胞周期停滯[14-15]。miR-1298 通過下調黏著斑激酶（FAK）和層粘連蛋白亞基β3（LAMB3）抑制突變型鼠類肉瘤病毒癌基因（KRAS）驅動的腫瘤生長[16]。膀胱癌中miR-1298亦呈低表達，miR-1298通過靶向下調連接蛋白3（Cx43）表達明顯抑制膀胱癌細胞的惡性表型[17]。與上述發現類似，本研究證實miR-1298 在ALL 患者骨髓組織中表達下調，轉染miR-1298 mimics 過表達miR-1298降低了KOCL44細胞的活力和克隆形成能力，增加cleaved-caspase 9和cleaved-caspase 3蛋白表達量，誘導細胞凋亡，表明miR-1298 在膀胱癌中具有腫瘤抑制功能。進一步研究顯示，miR-1298是circ_0030018 的直接下游靶點，且miR-1298 受到circ_0030018的負性調控。由于過表達miR-1298與干擾circ_0030018 在ALL 中抗癌作用一致，本研究推測KOCL44細胞中可能存在circ_0030018/miR-1298調控途徑。深入分析發現，抑制miR-1298表達能夠明顯削弱干擾circ_0030018對KOCL44細胞增殖的增殖抑制和凋亡促進作用，這表明干擾circ_0030018通過靶向上調miR-1298 表達抑制ALL 進展。然而，本研究仍存在一些不足，是否存在其他miRNA參與circ_0030018調控ALL進展，miR-1298的下游靶點仍需要進一步研究。

綜上，干擾circ_0030018 可抑制ALL 細胞KOCL44增殖，誘導細胞凋亡，其機制與靶向上調miR-1298表達有關，這表明circ_0030018/miR-1298有望成為臨床治療ALL的新型靶點。