PRMT1通過調控ZEB1對高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡和上皮—間充質轉化的影響*

李海玲，董陸玲，楊亞萍，楊秀紅，張貴山

（張家口市第一醫院 1.內分泌科，2.呼吸科，張家口 075000）

糖尿病腎病是糖尿病最常見的微血管并發癥之一，是終末期腎病的主要原因。目前，糖尿病腎病患者數約占終末期腎病患者的50%[1]。在糖尿病腎病的發展過程中，腎功能的下降與腎纖維化的程度密切相關，尤其是腎小管間質纖維化[2]。腎小管上皮細胞損傷誘導的細胞上皮—間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)被認為是導致腎纖維化的關鍵因素[3]。但糖尿病中腎小管上皮細胞EMT 的詳細分子機制尚不明確。蛋白質精氨酸甲基轉移酶-1(protein arginine methyltranferase-1，PRMT1)可控制多種底物基因的表達，并調節正常生理和病理發育過程中的一系列生物學進程[4]。已有研究表明，高糖可誘導糖尿病腎病小鼠足細胞中PRMT1表達上調。抑制PRMT1表達可減輕足細胞凋亡和EMT，從而改善糖尿病腎病小鼠足細胞損傷[5]。PRMT1 的主要下游底物可能涉及EMT 信號通路的幾個關鍵成分，如鋅指蛋白SNAⅠ1(zinc finger protein SNAⅠ1，Snail)、鋅指蛋白SNAⅡ(zinc finger protein SNAⅡSLUG)、扭曲相關蛋白1(twistrelated protein 1，Twist1)和鋅指E 盒結合同源框1(zinc finger E-box binding homeobox 1，ZEB1)[6]。目前，已有證據顯示，PRMT1 可通過上調ZEB1 表達調節人類乳腺癌細胞EMT 和衰老[7]。然而，目前還不清楚PRMT1 是否通過調控ZEB1 表達在糖尿病腎病EMT 中發揮作用。因此，本研究旨在探究PRMT1 是否通過調控ZEB1 表達在高糖誘導的腎小管上皮細胞凋亡和EMT中發揮作用，以期為明確糖尿病中腎小管上皮細胞EMT 的詳細分子機制及開發新的糖尿病腎病治療靶點提供新的依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人腎小管上皮細胞系HK-2購自中國科學院細胞庫；siRNA 陰性對照（si-NC）、過表達載體陰性對照（oe-NC）、PRMT1 特異性siRNA（si-PRMT1）、ZEB1 過表達載體（oe-ZEB1）購自蘇州泓迅生物科技有限公司；Lipofectamine 2000轉染試劑購自賽默飛世爾科技(中國)有限公司；CCK-8 檢測試劑盒購自吉滿生物科技(上海)有限公司；Annexin V FITC/PI 凋亡檢測試劑盒購自北京索萊寶科技有限公司；2×SYBR Green qPCR Master Mix購自美國Bimake；PRMT1、ZEB1 和GAPDH 抗體購自英國Abcam 公司；E-cadherin、Fibronectin 和α-SMA 抗體購自美國Santa Cruz Biotechnology；SimpleChIP? Plus Sonication Chromatin IP 試劑盒購自美國Cell Signaling Technology。

1.2 細胞培養及高糖處理

取出凍存的HK-2細胞，37 ℃水浴快速解凍，離心收集細胞。用含10%FBS、100 U/mL青鏈霉素的DMEM培養基重懸細胞，并將凍存管內的細胞轉移至培養皿內。將盛有細胞的培養皿放入37 ℃、5%CO2培養箱內培養。待細胞密度達到80%～90%時，用0.25%胰酶液消化細胞。將細胞接種于6 孔板內，1×105個/孔，細胞繼續培養24 h 后，將細胞隨機分為空白對照組和高糖組，對照組細胞用含2%FBS、葡萄糖5.5 mmol/L 的DMEM 培養基培養，高糖組細胞用含2%FBS、葡萄糖30 mmol/L的DMEM培養基培養。

1.3 細胞分組及轉染

將對數期生長的HK-2細胞接種于6孔板中，2×105個/孔，細胞繼續培養24 h后，將細胞隨機分為空白對照組（正常培養且無轉染處理）、si-NC組（轉染si-NC）和si-PRMT1組（轉染si-PRMT1）或者是空白對照組（正常培養且無轉染處理）、si-NC+oe-NC 組（轉染si-NC 和oe-NC）、si-PRMT1+oe-NC 組（轉染si-PRMT1和oe-NC）、si-NC+oe-ZEB1組（轉染si-NC和oe-ZEB1）、si-PRMT1+oe-ZEB1組（轉染si-PRMT1和oe-ZEB1），根據分組，按照Lipofectamine 2000 轉染試劑說明書所示，將si-NC、oe-NC、si-PRMT1、oe-ZEB1 轉染至細胞中。細胞繼續培養48 h 后，將各組細胞培養基更換為含2%FBS、葡萄糖30 mmol/L的DMEM培養基培養繼續培養48 h后，進行后續實驗操作。

1.4 CCK-8檢測細胞增殖

將對數期生長的HK-2 細胞或者是轉染后的HK-2細胞接種于96孔板中，5×103個/孔。細胞繼續培養24 h 后，將HK-2 細胞分為空白對照組和高糖組，將轉染后的HK-2細胞分為空白對照組、si-NC+oe-NC組、si-PRMT1+oe-NC組、si-NC+oe-ZEB1組、si-PRMT1+oe-ZEB1組，按照“1.2”項和“1.3”項所述進行細胞處理。細胞繼續培養24 h、48 h和72 h后，向細胞中添加CCK-8溶液（10 μL/孔），細胞于37 ℃培養箱中靜置孵育4 h后，用酶標儀測定每孔在450 nm處的光密度（OD）值。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡

收集HK-2 細胞，向細胞中添加預冷PBS 清洗細胞，共清洗2次。重新收集細胞，向細胞中加入1×結合緩沖液重懸細胞沉淀，并將細胞密度調整為1×106個/mL。取上述細胞懸液100 μL，向細胞中添加5 μL FITC-Annexin V 和5 μL PI 工作液，充分混勻后，將細胞置于室溫條件下避光孵育15 min。向細胞中加入400 μL 1×結合緩沖液，充分混勻后，立即用流式細胞儀檢測。

1.6 qRT-PCR 檢測細胞PRMT1 和ZEB1 mRNA 表達

收集HK-2細胞，Trizol法提取細胞RNA。微量分光光度計測定RNA 的純度及濃度，隨后將RNA逆轉錄，得到cDNA。按照2× SYBR Green qPCR Master Mix 說明書所示，進行qRT-PCR 實驗。反應程序：95 ℃、1 min；95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，72 ℃、30 s，共40 個循環；95 ℃、15 s，60 ℃、60 s，95 ℃、15 s。實驗中所需引物序列，見表1。以GAPDH 為內參，采用2-ΔΔCt法計算PRMT1和ZEB1 mRNA相對表達量。

表1 qRT-PCR實驗所需引物序列

1.7 Western blotting 檢測細胞PRMT1、ZEB1、Ecadherin、Fibronectin和α-SMA蛋白表達

收集HK-2 細胞，加入含有苯甲基磺酰氟的蛋白裂解液，冰上裂解細胞沉淀。離心收集裂解上清液并對其進行濃度的測定。根據所測濃度，取30 μg蛋白加至凝膠上樣孔內，進行SDS-PAGE 凝膠電泳。電泳結束后，進行轉膜操作。5%脫脂奶粉室溫孵育2 h，去除非特異性結合位點。分別加入PRMT1（1∶2 000）、ZEB1（1∶1 000）、E-cadherin（1∶1 000）、Fibronectin（1∶2 000）、α-SMA（1∶1 000）和GAPDH（1∶2 000）抗體稀釋液，置于4 ℃條件下，搖床孵育過夜。加入特異性二抗（1∶5 000）抗體稀釋液，室溫條件下搖床孵育1 h。均勻涂抹ECL 發光液，凝膠成像系統檢測蛋白條帶，Image J 軟件分析各蛋白條帶的灰度值。

1.8 CHIP-PCR 和CHIP-qPCR 實驗檢測PRMT1 對ZEB1啟動子的調控作用

棄去HK-2細胞培養基，加入1%甲醛于37 ℃條件下孵育10 min，冰上終止固定，預冷PBS 清洗細胞。將細胞收集于離心管內。加入SDS 裂解緩沖液重懸細胞沉淀，冰上反應10 min，超聲剪切染色質DNA，獲得200～1 000 bp 的染色質片段。超聲破碎后的產物用5 mol/L的NaCl解交聯。離心收集上清液，根據SimpleChIP? Plus Sonication Chromatin IP 試劑盒說明書進行后續實驗操作。向上清液中添加CHIP 緩沖液和蛋白酶抑制劑混合物，再加入蛋白A瓊脂糖珠，4 ℃條件下搖床孵育1 h。離心收集上清液，將上清液平均分為3 組：Input 組、IgG 組和PRMT1 組，根據分組，分別加入Histone H3、IgG和PRMT1 抗體，在4 ℃搖床輕柔搖動過夜。加入蛋白A瓊脂糖珠4 ℃搖床孵育1 h，以形成抗體—蛋白A 免疫復合物。離心收集沉淀，用低、高鹽洗滌液、LiCl 洗滌液、TE Buffer 依次洗滌沉淀。加入200 μL洗脫緩沖液洗滌沉淀，離心收集上清。加入20 μL 5 mol/L 的NaCl 解交聯。隨后加入10 μL 0.5 mol/L EDTA、20 μL 1 mol/L Tris-HCl（pH=6.5）、2 μL 10 mg/mL 蛋白酶K，45 ℃條件下孵育10 min。按照膠回收試劑盒說明書回收DNA 片段。以回收的DNA 為模板，用PCR 擴增法檢測ZEB1 啟動子DNA，PCR 產物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。另外，以回收DNA 為模板進行qPCR 實驗。ZEB1 上游引物：5’-CCAAAATGGAGGGCTCAACA-3’；ZEB1下游引物：5’-AATGTGGCTGATTATTTGGC-3’。

1.9 統計學方法

采用SPSS 21.0 軟件進行數據統計分析。數據以均值±標準差（）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 高糖對HK-2細胞增殖、凋亡和EMT的影響

與空白對照組相比，高糖組細胞增殖能力明顯降低（P＜0.05），細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05），Ecadherin蛋白相對表達量明顯降低（P＜0.05），而Fibronectin 和α-SMA 蛋白相對表達量明顯升高（P＜0.05），見圖1。

圖1 高糖對HK-2細胞增殖、凋亡和EMT的影響

2.2 高糖對HK-2細胞中PRMT1和ZEB1表達的影響

與空白對照組相比，高糖組細胞中PRMT1 和ZEB1 mRNA 相對表達水平明顯升高（P＜0.05），PRMT1 和ZEB1 蛋白相對表達量明顯升高（P＜0.05），見圖2。

圖2 高糖對HK-2細胞中PRMT1和ZEB1表達的影響

2.3 PRMT1 通過與ZEB1 啟動子區域結合調控ZEB1的表達

與空白對照組相比，si-NC 組細胞中PRMT1 和ZEB1 蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）；與si-NC 組相比，si-PRMT1 組細胞中PRMT1 和ZEB1 蛋白表達明顯降低（P＜0.05）（圖3A）。Consite（http://consite.genereg.net/）和JASPAR（http://jaspar.binf.ku.dk/）軟件分析ZEB1 啟動子區域潛在的PRMT1結合位點，CHIP-PCR 實驗檢測PRMT1 對ZEB1 啟動子的調控作用，結果顯示，PRMT1組和Input組含有ZEB1 被擴增區段DNA，而陰性對照IgG 組沒有（圖3B）。與IgG組相比，PRMT1組ZEB1啟動子區域（-327至-179 bp）明顯富集（P＜0.05）（圖3C）。

圖3 PRMT1通過與ZEB1啟動子區域結合調控ZEB1的表達

2.4 si-PRMT1 和oe-ZEB1 對HK-2 細胞中PRMT1和ZEB1表達的影響

與空白對照組相比，si-NC+oe-NC 組細胞中PRMT1 和ZEB1 蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05）；與si-NC+oe-NC組相比，si-PRMT1+oe-NC組細胞中PRMT1 和ZEB1 蛋白表達明顯降低（均P＜0.05），si-NC+oe-ZEB1 組細胞中PRMT1 蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05），ZEB1 蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；與si-PRMT1+oe-NC 組相比，si-PRMT1+oe-ZEB1 組細胞中PRMT1 蛋白表達差異無統計學意義（P＞0.05），ZEB1 蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；與si-NC+oe-ZEB1 組相比，si-PRMT1+oe-ZEB1 組細胞中PRMT1 蛋白表達明顯降低（P＜0.05），ZEB1蛋白表達明顯降低（P＜0.05），見圖4。

圖4 si-PRMT1和oe-ZEB1對HK-2細胞中PRMT1和ZEB1表達的影響

2.5 PRMT1/ZEB1 軸對HK-2 細胞增殖和凋亡的影響

高糖處理各組細胞，結果顯示，與空白對照組相比，si-NC+oe-NC組細胞增殖能力和細胞凋亡率差異無統計學意義（P＞0.05）；與si-NC+oe-NC組相比，si-PRMT1+oe-NC 組細胞增殖能力明顯升高（P＜0.05），細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05），si-NC+oe-ZEB1組細胞增殖能力明顯降低（P＜0.05），細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與si-PRMT1+oe-NC 組相比，si-PRMT1+oe-ZEB1 組細胞增殖能力明顯降低（P＜0.05），細胞凋亡率明顯升高（P＜0.05）；與si-NC+oe-ZEB1組相比，si-PRMT1+oe-ZEB1組細胞增殖能力明顯升高（P＜0.05），細胞凋亡率明顯降低（P＜0.05），見圖5。

圖5 PRMT1/ZEB1軸對HK-2細胞增殖和凋亡的影響

2.6 PRMT1/ZEB1軸對HK-2細胞EMT的影響

高糖處理各組細胞，結果顯示，與空白對照組相比，si-NC+oe-NC 組細胞中E-cadherin、Fibronectin 和α-SMA 蛋白表達差異無統計學意義（均P＞0.05）；與si-NC+oe-NC組相比，si-PRMT1+oe-NC組細胞E-cadherin 蛋白表達明顯升高（P＜0.05），Fibronectin 和α-SMA 蛋白表達明顯降低（P＜0.05），si-NC+oe-ZEB1 組細胞E-cadherin 蛋白表達明顯降低（P＜0.05），Fibronectin和α-SMA蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；與si-PRMT1+oe-NC 組相比，si-PRMT1+oe-ZEB1 組細胞E-cadherin 蛋白表達明顯降低（P＜0.05），Fibronectin和α-SMA蛋白表達明顯升高（P＜0.05）；與si-NC+oe-ZEB1 組相比，si-PRMT1+oe-ZEB1 組細胞E-cadherin 蛋白表達明顯升高（P＜0.05），Fibronectin和α-SMA蛋白表達明顯降低（P＜0.05）。見圖6。

圖6 PRMT1/ZEB1軸對HK-2細胞EMT的影響

3 討論

糖尿病腎病已經成為人類一個主要的公共衛生問題，給個人、家庭和社會帶來了巨大的經濟負擔[8]。腎小管上皮細胞EMT被認為是糖尿病腎病腎小管間質纖維化形成的關鍵過程。盡管已有多種信號通路或介質在體外或體內調控腎小管上皮細胞轉化或纖維化形成，但糖尿病誘導腎小管上皮細胞轉化的詳細分子機制尚不完全清楚[9]。鑒于EMT在糖尿病腎病腎組織損傷發展過程中的致病作用，闡明導致糖尿病腎病腎纖維化的相關分子機制對于確定治療靶點是至關重要的。

EMT在纖維化的發展過程中起著重要作用，上皮細胞處于特定的生理或病理情況下，可激活一系列信號轉導途徑，抑制上皮細胞上皮相關蛋白(Ecadherin)表達，促使間充質標志物(Fibronectin 和α-SMA)表達增加，最終獲得具有侵襲能力的間充質表型，從而產生更多的成纖維細胞樣細胞[10]。PRMTs家 族由Ⅰ型PRMTs(PRMT1、PRMT 2、PRMT 3、PRMT 4、PRMT 6 和PRMT 8) 和Ⅱ型PRMTs(PRMT5和PRMT9)組成。其中PRMT1已被證實參與調控乳腺癌細胞EMT 過程。此外，PRMT1 可促進心外膜侵襲和EMT過程，是調節心室形態發生和冠狀動脈形成的重要因子[11]。PRMT1 還可促進糖尿病高血糖，在生理和病理條件下可調節糖異生和介導葡萄糖穩態，肝臟特異性PRMT1 缺乏可明顯改善糖尿病高血糖[12]。已有研究表明，棕櫚酸鹽可上調PRMT1 表達，敲低PRMT1 可明顯抑制棕櫚酸鹽誘導的腎小球系膜細胞凋亡和內質網應激[13]。Chen等[14]的研究結果顯示，糖尿病腎病患者血清中PRMT1的水平和糖尿病腎病小鼠腎組織中PRMT1的表達明顯升高。高糖可誘導體外培養的腎小管細胞中PRMT1表達增加。敲低PRMT1可抑制高糖誘導的腎小管細胞內質網應激、細胞凋亡和EMT。腎臟細胞在高糖等損傷性刺激后的表型轉化在糖尿病腎病的進展中起著至關重要的作用[15]，本研究用含葡萄糖30 mmol/L 的DMEM 培養基培養HK-2細胞，結果顯示，高糖可抑制HK-2 細胞增殖，誘導細胞凋亡，促進細胞EMT。此外，高糖還可促進HK-2 細胞中PRMT1 的表達，而敲低PRMT1 后，可促進HK-2 細胞增殖，抑制細胞凋亡和EMT。該研究結果與Chen等[14]的研究結果一致，表明高糖誘導的PRMT1表達可促進糖尿病腎病疾病進展。

PRMT1 是催化蛋白質精氨酸甲基化過程的關鍵酶，其甲基化底物蛋白包括組蛋白H4 和非組蛋白FOXO1、ERα、MRE11 和53BP1 等[16]。PRMT1 甲基化組蛋白H4R3 發生非對稱性二甲基化（H4R3me2as），進而激活ZEB1 的表達。ZEB1 位于人類染色體10p11.22 上，是PRMT1 所介導的EMT及其相關功能的關鍵轉錄因子。ZEB1 可以通過EMT 促進細胞增殖、遷移和膠原形成，最終誘導纖維化[17]。已有研究表明，ZEB1參與肝纖維化疾病進展，果糖通過上調ZEB1表達促進EMT，從而誘導肝纖維化[18]。ZEB1 介導的人肺泡上皮Ⅱ型細胞中的EMT通過旁分泌信號傳遞給潛在的成纖維細胞，促進了肺纖維化的發展。靶向ZEB1可能是治療肺纖維化的一個可行的策略[19]。Tang等[20]的研究結果顯示，高糖刺激可誘導HK-2 細胞中ZEB1 的表達，促進細胞EMT。敲低ZEB1 表達可逆轉高糖誘導的EMT。此外，目前已有證據顯示，在胰腺癌中，PRMT1通過與ZEB1啟動子區域結合上調ZEB1的表達，從而促進胰腺癌細胞增殖和侵襲[21]。本研究結果顯示，高糖刺激可誘導HK-2細胞中ZEB1的表達，進一步抑制細胞增殖，促進細胞凋亡和EMT。敲低PRMT1 后，HK-2 細胞中ZEB1 的表達下調，而過表達ZEB1對HK-2細胞中PRMT1表達無明顯影響。進一步實驗結果表明，過表達ZEB1 可逆轉敲低PRMT1對高糖誘導的HK-2細胞的影響，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡和EMT。敲低PRMT1 則可逆轉過表達ZEB1對高糖誘導的HK-2細胞的影響，促進細胞增殖，抑制細胞凋亡和EMT。表明高糖誘導的PRMT1 通過上調ZEB1 表達促進糖尿病腎病疾病進展。

綜上所述，高糖刺激可抑制HK-2細胞增殖，促進細胞凋亡和EMT，上調PRMT1 和ZEB1 表達。PRMT1通過與ZEB1啟動子區域結合上調ZEB1的表達，從而抑制高糖刺激的HK-2細胞增殖，促進細胞凋亡和EMT。本研究結果為明確糖尿病腎病腎纖維化的相關分子機制及開發新的治療靶點提供了新的依據。