circ-EIF4G3負調控miR-17-5p對非小細胞肺癌細胞的增殖、細胞周期和凋亡的影響

夏 奎，王 安，鐘昌秀

（1.博鰲超級醫院胸心外科，瓊海 571400；2.瓊海市人民醫院胸心外科，瓊海 571400）

肺癌是世界范圍內與癌癥相關死亡的主要原因，非小細胞肺癌（non-small-cell lung cancer，NSCLC）約占所有肺癌患者的85%。目前，盡管診斷技術和治療策略取得了巨大進步，但NSCLC 患者的預后仍然較差，且患者的總體5 年生存率僅為10%[1]。早期發現率低是導致高發病率和高死亡率的主要原因之一[2]。因此，探索NSCLC的新型治療靶點對改善患者預后，提高患者生存率至關重要。環狀RNA（circular RNAs，circRNA）是由外顯子反向剪接形成的非編碼RNA分子，circRNA與人類癌癥的發展密切相關，包括NSCLC[3-4]。最近研究發現，circ-EIF4G3在NSCLC中表達上調，并可能參與NSCLC 發生過程[5]。但是，circ-EIF4G3 在NSCLC中的作用機制仍不清楚。微小RNA（microRNA，miRNA）是另一組內源性非編碼RNA，先前研究表明，circRNA 可通過充當miRNA 海綿發揮作用[6]。Wang等[7]研究顯示，circ-EIF4G3通過海綿吸附miR-335 促進胃癌的增殖、侵襲和遷移。但是，circ-EIF4G3 及其靶miRNA 在NSCLC 進展中的作用仍不清楚。本研究旨在探討circ-EIF4G3在NSCLC腫瘤發生中的功能及分子機制，以期為NSCLC 的診斷和治療提供新的生物標志物和靶標。

1 材料與方法

1.1 細胞和主要試劑

人非小細胞肺癌細胞系（NCI-H1299、NCIH520和NCI-H460）和人正常肺上皮細胞系（BEAS-2B）由中國科學院上海細胞庫提供；DMEM 高糖培養基由美國Gibco 公司提供；胎牛血清由南京凱基生物科技有限公司提供；Lipofectamine 3000脂質體轉染試劑由美國Invitrogen 公司提供；circ-EIF4G3 siRNA 和siRNA 對照、miR-17-5p mimics 和mimics對照由廣州銳博生物科技有限公司提供；CCK-8試劑由日本同仁化學研究所提供；Trizol試劑、逆轉錄試劑盒和SYBR Green qPCR 檢測試劑盒由賽默飛世爾科技有限公司提供；引物由上海生工生物工程有限公司提供；Annexin V-FITC/PI雙染色細胞凋亡檢測試劑盒由大連寶生物工程有限公司提供；雙熒光素酶報告系統檢測試劑盒由上海翊圣生物科技有限公司提供；circ-EIF4G3-Wt 和circ-EIF4G3-Mut重組載體質粒由上海吉瑪制藥技術有限公司提供；Cleaved Caspase-3單克隆抗體和二抗由美國CST公司提供；Western blotting 檢測所需試劑由碧云天生物技術研究所提供。

1.2 細胞培養和轉染

BEAS-2B、NCI-H1299、NCI-H520 和NCI-H460細胞培養在含10%胎牛血清、1%青霉素—鏈霉素的DMEM 培養基中，放置在常規細胞培養箱中，培養條件：5%CO2，37 ℃，飽和濕度。當細胞融合至90%左右時，使用0.25%的胰蛋白酶消化細胞并傳代培養，取對數期的細胞進行實驗。取對數生長期的NCI-H1299細胞接種到6孔板中，過夜培養，待細胞生長匯合度在50%左右時進行轉染，轉染circ-EIF4G3 siRNA的NCI-H1299細胞記為轉染（si-circ-EIF4G3）組，轉染siRNA 對照的NCI-H1299 細胞記為轉染對照（si-NC）組，其中未行轉染的NCI-H1299細胞記為空白對照（Mock）組。具體轉染步驟嚴格按照Lipofectamine 3000轉染試劑使用說明進行，轉染6 h 時更換成正常培養液，48 h 后收集各組NCIH1299細胞，進行相關指標的檢測。

1.3 qPCR檢測

BEAS-2B、NCI-H1299、NCI-H520 和NCI-H460細胞以及轉染48 h 后的各組NCI-H1299 細胞分別采用Trizol試劑提取總RNA，分別測定RNA樣品的濃度和純度，取合格的RNA 進行逆轉錄，具體步驟參照逆轉錄試劑盒進行操作。以合成的cDNA為模板，使用SYBR Green qPCR 檢測試劑盒行qPCR 檢測，反應程序為：95 ℃預變性5 min，隨后設40個循環：95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸15 s。以GAPDH 為內參，分析circ-EIF4G3 的相對表達量，以U6 為內參，分析miR-17-5p 的相對表達量。每組實驗重復3 次。采用相對定量2-ΔΔCt法進行定量。qPCR 所用引物序列為，GAPDH，F：5’-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3’；R 5’-ATGGCATGG ACTGTGGTCAT-3’。circ-EIF4G3，F：5’-CCTACCCCATCCCCTTATTC-3’；R：5’-ACCGTGCTGTAGACTGCTGAG-3’。U6，F：5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’；R：5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’。miR-17-5p，F：5’-CCAGGATCCTTTATAGTTGTTAGAGTTT-3’；R：5’-CGGAATTCTAATCTACTTCACTATCTGCAC-3’。

1.4 CCK-8實驗

將對數期NCI-H1299細胞鋪板96孔板，分組轉染48 h時檢測細胞增殖活力，即向每孔細胞中加入10 μL CCK-8試劑，37 ℃孵育2 h，棄上清，使用全自動酶標儀測定490 nm 處各孔細胞吸光度（A）值。每組實驗重復3次。

1.5 流式細胞術檢測

收集轉染48 h 后的NCI-H1299 細胞，調整細胞濃度為1×105個/mL，向細胞中加入預冷的75%的乙醇，于4 ℃冰箱固定12 h，使用PBS 洗滌細胞，加入適量核糖核酸酶，37 ℃避光水浴30 min，隨后加入PI 染液，避光孵育5 min，使用流式細胞儀檢測細胞周期分布。每組實驗重復3次。

1.6 Annexin V-FITC/PI雙染色法檢測

NCI-H1299 細胞轉染48 h 后，加入胰蛋白酶消化并收集細胞，向細胞中加入400 μL結合緩沖液重懸細胞，再向細胞懸液中依次添加Annexin V-FITC和PI各5 μL，輕輕分混勻，室溫下避光反應15 min，立即上流式細胞儀，檢測細胞凋亡情況，檢測結果以Cell Quest軟件分析細胞凋亡率。每組實驗重復3次。

1.7 Western blotting檢測

收集轉染48 h 后的各組NCI-H1299 細胞，加入細胞裂解液，放置在冰上裂解15 min，離心取上清即為總蛋白，采用BCA蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白濃度，取40 μg 蛋白樣品進行SDS-PAGE 電泳，待蛋白分離后電轉至PVDF 膜上，室溫封阻2 h。加入1∶1 000 稀釋的Cleaved Caspase-3 單克隆抗體，4 ℃過夜孵育，次日加入1∶2 000稀釋的二抗，室溫孵育2 h，滴加ECL 化學發光液進行顯影，在暗室使用凝膠成像系統采集圖像，采用Imag J 軟件分析條帶灰度值，以GAPDH 進行標定，計算Cleaved Caspase-3相對表達水平。每組實驗重復3次。

1.8 雙熒光素酶報告基因實驗

根據生物信息學預測結果，擴增circ-EIF4G3和miR-17-5p 結合位點和突變位點序列，并插入熒光素酶報告載體上，分別構建circ-EIF4G3-Wt 和circ-EIF4G3-Mut 重組載體質粒。使用Lipofectamine 3000 轉染試劑將circ-EIF4G3-Wt 和circ-EIF4G3-Mut重組載體質粒分別和miR-17-5p mimics或mimics 對照共轉染NCI-H1299 細胞，48 h 后收集細胞，并使用雙熒光素酶報告系統檢測試劑盒測定海腎和螢火蟲熒光素酶活性，分別計算細胞的相對熒光素酶活性。每組實驗重復3次。

1.9 統計學分析

采用SPSS 21.0 軟件進行數據統計分析，計量資料以均數±標準差（）表示，兩組均數比較采用t檢驗，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 circ-EIF4G3 和miR-17-5p 在NSCLC 細胞中的表達

與人正常肺上皮細胞系BEAS-2B 相比，人NSCLC 細胞系NCI-H1299、NCI-H520 和NCI-H460中circ-EIF4G3 的表達水平顯著升高（P＜0.05），而miR-17-5p 的表達水平顯著降低（P＜0.05），見表1。circ-EIF4G3在NCI-H1299細胞中基礎表達量最高，因此，選擇NCI-H1299細胞用于后續實驗。

表1 circ-EIF4G3 和miR-17-5p 在NSCLC 各細胞系中的相對表達水平比較，n=3

表1 circ-EIF4G3 和miR-17-5p 在NSCLC 各細胞系中的相對表達水平比較，n=3

與BEAS-2B細胞系相比，*P＜0.05。

2.2 抑制circ-EIF4G3 對NCI-H1299 細胞增殖活力的影響

與Mock 組和si-NC 組相比，si-circ-EIF4G3 組NCI-H1299 細胞中circ-EIF4G3 的表達水平顯著降低（P＜0.05）；Mock 組和si-NC 組相比，NCI-H1299細胞中circ-EIF4G3 的表達水平差異不明顯（P＞0.05）。與Mock 組和si-NC 組相比，si-circ-EIF4G3組NCI-H1299 細胞增殖活力顯著降低（P＜0.05）；Mock 組和si-NC 組相比，NCI-H1299 細胞增殖活力差異不明顯（P＞0.05），見表2。

表2 各組NCI-H1299 細胞增殖活力和circ-EIF4G3 相對表達量比較，n=3

表2 各組NCI-H1299 細胞增殖活力和circ-EIF4G3 相對表達量比較，n=3

與Mock組相比，*P＜0.05；與si-NC組相比，&P＜0.05。

2.3 抑制circ-EIF4G3 對NCI-H1299 細胞周期的影響

與Mock 組和si-NC 組相比，si-circ-EIF4G3 組G0/G1期細胞比例顯著增多（P＜0.05），而S 期和G2/M期細胞比例隨之減少（P＜0.05）；Mock組和si-NC組相比，G0/G1期、S 期和G2/M 期細胞比例差異不明顯（P＞0.05），見表3。

表3 各組G0/G1期、S期和G2/M期細胞比例比較，n=3

表3 各組G0/G1期、S期和G2/M期細胞比例比較，n=3

與Mock組相比，*P＜0.05；與si-NC組相比，&P＜0.05。

2.4 抑制circ-EIF4G3 對NCI-H1299 細胞凋亡的影響

與Mock 組和si-NC 組相比，si-circ-EIF4G3 組NCI-H1299細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3的表達水平明顯升高（均P＜0.05）；Mock 組和si-NC 組相比，細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3 的表達水平差異不明顯（P＞0.05），見圖1和表4。

表4 各組NCI-H1299細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3的表達水平比較，n=3

表4 各組NCI-H1299細胞凋亡率和Cleaved Caspase-3的表達水平比較，n=3

與Mock組相比，*P＜0.05；與si-NC組相比，&P＜0.05。

圖1 抑制circ-EIF4G3對NCI-H1299細胞凋亡的影響

2.5 circ-EIF4G3靶向調控miR-17-5p關系驗證

生物信息學Starbase 在線數據庫預測結果顯示，circ-EIF4G3 和miR-17-5p 間存在靶向結合位點。與miR-NC 組相比，過表達miR-17-5p 的circ-EIF4G3-Wt 細胞相對熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05），而過表達miR-17-5p的circ-EIF4G3-Mut細胞相對熒光素酶活性差異不明顯（P＞0.05）。與Mock組和si-NC 組相比，si-circ-EIF4G3 組NCI-H1299 細胞中的miR-17-5p表達水平明顯降低（均P＜0.05）；Mock 組和si-NC 組相比，miR-17-5p 的表達水平差異不明顯（P＞0.05），見圖2和表5。

表5 各組NCI-H1299細胞中miR-17-5p表達水平比較，n=3

表5 各組NCI-H1299細胞中miR-17-5p表達水平比較，n=3

與Mock組相比，*P＜0.05；與si-NC組相比，&P＜0.05。

圖2 circ-EIF4G3和miR-17-5p靶向關系驗證

3 討論

circRNA 是一類新的廣泛存在的內源性RNA。circRNA具有兩個最重要的特性即它們高度保守且非常穩定，這些優點使circRNA 具有成為癌癥診斷的理想生物標志物的潛力[8]。circRNA 報道最多的功能模式是充當miRNA 海綿。這種“海綿狀”特征類似于長非編碼RNA（lncRNA），這表明circRNA是與miRNA結合作為miRNA的分子吸收劑發揮調控作用。例如，circ-MYBL2 作為miR-361-3p 的海綿，可促進宮頸癌細胞的增殖和侵襲[9]。在前列腺癌中，circ-MTO1與患者良好的預后相關，并能夠通過靶向抑制miR-17-5p表達抑制前列腺癌細胞的增殖和侵襲[10]。在NSCLC 中，circ-CMPK1 通過海綿吸附miR-302e 來增加細胞周期蛋白D1 的表達，從而促進NSCLC細胞增殖[11]。NSCLC是最常見的肺部惡性腫瘤，其特征是肺組織中細胞的增殖不受控制[12]。近年來，基因芯片技術已公開了許多與NSCLC 相關的circRNA[13]。先前的研究表明，circRNA 參與了一系列涉及NSCLC 腫瘤發生和發展的生理過程[14-15]。在以往研究中，與匹配的非癌組織和正常肺16HBE細胞相比，在肺癌患者標本組織和肺癌細胞中circ-EIF4G3表達被證實過表達[5]。本實驗的數據同樣證實了circ-EIF4G3在NSCLC細胞系中的表達上調，這意味著circ-EIF4G3可能是肺癌中的一種癌基因。

既然已驗證circ-EIF4G3 在肺癌組織和肺癌細胞中上調表達，則進一步的功能實驗對于驗證其他生物學效應是必要的。體外試驗揭示了抑制circ-EIF4G3 能夠阻礙NSCLC 細胞增殖和細胞周期進程，并促進細胞凋亡。Caspase-3是細胞凋亡過程中終末剪切酶，在細胞凋亡中扮演重要角色[16]。Caspase-3 激活水平在一定程度上反映細胞凋亡程度。本實驗結果發現，抑制circ-EIF4G3后NCI-H1299細胞中Cleaved Caspase-3 的表達水平顯著升高，表明抑制circ-EIF4G3 可通過上調Cleaved Caspase-3 的表達促進NCI-H1299 細胞凋亡。因此，發現circ-EIF4G3具有NSCLC致癌作用，為NSCLC的治療提供了有價值的標志物。此外，本實驗還發現，與circ-EIF4G3 的表達水平相反，miR-17-5p 在NSCLC細胞系中的表達顯著降低，且抑制circ-EIF4G3能夠促進miR-17-5p的表達。筆者推測circ-EIF4G3可能通過調控miR-17-5p 的表達參與NSCLC 的發展。在各種類型的癌癥（包括甲狀腺癌、結直腸癌和前列腺癌）中，miR-17-5p 的表達均下調，發揮抑癌基因的作用[17-19]。多項研究已證實，miR-17-5p 在NSCLC 組織和細胞系中顯著降低，且miR-17-5p 過表達明顯抑制細胞增殖，同時誘導細胞凋亡[20-22]。本實驗生物信息學軟件預測結果顯示，circ-EIF4G3和miR-17-5p 存在靶向結合位點，表明circ-EIF4G3和miR-17-5p之間可能存在靶向關系。后續通過雙熒光素酶報告基因實驗和qPCR 技術證實，circ-EIF4G3 能夠負向調控miR-17-5p 的表達。以上的實驗結果，證明了circ-EIF4G3 通過海綿miR-17-5p在NSCLC中起致癌作用。

綜上，circ-EIF4G3在NSCLC中表達上調，抑制circ-EIF4G3通過調節miR-17-5p抑制NCI-H1299細胞增殖和細胞周期進程，并誘導細胞凋亡，在NSCLC中起癌基因的作用。本研究結果表明，miR-17-5p作為NSCLC的預后預測因子和治療靶標可能具有較大的潛力。