新型含硫吡唑雜環的合成及其抗稻瘟病菌活性研究

李明樺, 董守誠, 謝金鑫, 鄧志鵬, 湯日元

(華南農業大學 材料與能源學院，廣東 廣州 510642)

水稻是世界上近一半人口的主要糧食作物。然而，當前全球水稻每年因稻瘟病危害而導致的減產幅度高達10%～30%，極端情況下甚至絕收[1-2]。稻瘟病是水稻種植業中最具破壞性的疾病之一，而稻瘟病菌(MagnaportheGrisea)則是造成稻瘟病的典型病因[3-4]。

吡唑骨架上有多個不同化學環境的取代位點，可改變吡唑環活性基團的取代位置和種類[5]。在吡唑上進行多樣性衍生可獲得生理活性不同的吡唑衍生物，使其在農藥和醫藥領域有廣泛的應用，如作為蛋白糖基化抑制劑[6]、抗菌[7]、抗癌[8]、抗氧化劑[9]和抗病毒藥物[10]等。尤其是在農業方面，吡唑類農藥具有廣譜、高效、低毒、作用機理獨特、安全等特點，已成為新農藥創制研究中的焦點之一[11]。

Scheme 1

Scheme 2

本文通過底物設計，改變吡唑環活性取代基的種類和取代位置，以達到改變和豐富吡唑農藥生物活性的目的。通過5-氨基吡唑與便宜易得的秋蘭姆反應合成吡唑二硫代氨基甲酸酯衍生物(Scheme 1)，含氰基吡唑與秋蘭姆作為硫化試劑反應合成吡唑硫代酰胺及其衍生物(Scheme 2)，以及以氟蟲腈中間體為底物利用硫化、環化和氧化反應制備相應的衍生物(Scheme 3)。通過這3條路徑合成了14種含硫吡唑雜環衍生物，其結構經1H NMR,13C NMR和MS(ESI)表征。其中，化合物3j，4j和5j為新化合物。采用生長速率法，在100 mg·L-1濃度下，對化合物的稻瘟病菌(MagnaportheGrisea)抑制活性進行了初步測定。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

JH-30型熔點儀(溫度未校正)；Bruker-600 MHz/500 MHz型核磁共振儀(CDCl3或DMSO-d6為溶劑，TMS為內標)；API 3200型液相色譜串聯質譜聯用儀(ESI源)。

2j(黃色粉狀固體，收率95%)按文獻[12]方法合成；其余所用試劑均為分析純。

1.2 合成

(1) 吡唑-二硫代氨基甲酸酯(3a～3e)的合成(以3a為例)[13]

向反應管中依次加入1a0.0346 g(0.2 mmol)，2a0.0721 g(0.15 mmol)，碘化鉀0.0066 g(0.02 mmol)，過硫酸鉀0.1081 g(0.2 mmol)和DMF/H2O(2 mL,V/V=5/1)，攪拌下于60 ℃反應24 h。冷卻至室溫，依次用CH2Cl2(3×150 mL)和飽和食鹽水(3×150 mL)萃取，合并有機相，抽濾，濾餅用無水Na2SO4干燥，蒸除溶劑，殘余物經硅膠柱層析(洗脫劑： 乙酸乙酯/石油醚=1/1，V/V)純化得3a。

Scheme 3

3a： 白色固體，收率86%, m.p.177.6～178.3 ℃;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 7.72～7.69(m, 2H, Ph-H), 7.35(t,J=7.4 Hz, 2H, Ph-H), 7.32～7.29(m, 1H, Ph-H), 3.95(s, 2H, NH2), 3.75(s, 3H, Me), 3.55(s, 3H, Me), 3.47(s, 3H, Me);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 197.1, 152.5, 150.0, 132.8, 128.1, 127.9, 127.9, 88.3, 46.11, 41.64, 35.15; MS(ESI)m/z: 293.1{[M+H]+}, 315.3{[M+Na]+}。

3b： 黃色固體，收率61%, m.p.112.3～115.4 ℃;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 7.69(d,J=7.1 Hz, 2H, Ph-H), 7.34(t,J=7.3 Hz, 2H, Ph-H), 7.32～7.28(m, 1H, Ph-H), 4.03(q,J=7.1 Hz, 2H, CH2), 3.97(s, 2H, NH2), 3.85(q,J=7.1 Hz, 2H, CH2), 3.77(s, 3H, Me), 1.36(t,J=7.1 Hz, 3H, Me), 1.29(t,J=7.1 Hz, 3H, Me);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 195.6, 152.5, 150.3, 132.9, 128.1, 127.9, 127.9, 88.5, 50.4, 46.9, 35.2, 13.0, 11.7; MS(ESI)m/z: 321.3{[M+H]+}, 343.4{[M+Na]+}。

3c： 白色固體，收率71%, m.p.178.8～180.2 ℃;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 7.56(d,J=7.6 Hz, 2H, Ph-H), 7.45(t,J=7.9 Hz, 2H, Ph-H), 7.32(t,J=7.4 Hz, 1H, Ph-H), 4.17(s, 2H, NH2), 3.54(s, 3H, Me), 3.51(s, 3H, Me), 2.17(s, 3H, Me);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 196.8, 153.0, 149.1, 129.4, 127.3, 123.6, 89.5, 46.0, 41.57, 12.3; MS(ESI)m/z: 292.9{[M+H]+}, 315.4{[M+Na]+}。

3d： 白色固體，收率63%, m.p.78.8～79.7 ℃;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 7.82～7.79(m, 2H, Ph-H), 7.68(d,J=7.6 Hz, 2H, Ph-H), 7.51(t,J=7.9 Hz, 2H, Ph-H), 7.41～7.37(m, 3H, Ph-H), 7.35～7.32(m, 1H, Ph-H), 4.26(s, 2H, NH2), 3.56(s, 3H, Me), 3.49(s, 3H, Me);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 196.5, 150.1, 138.4, 132.6, 129.5, 128.1, 128.1, 128.1, 127.8, 124.0, 46.1, 41.7; MS(ESI)m/z: 355.3{[M+H]+}, 377.4{[M+Na]+}。

3e： 白色固體，收率60%, m.p.152.0～153.6 ℃;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 7.46(d,J=8.3 Hz, 2H, Ar-H), 7.26(d,J=8.0 Hz, 2H, Ar-H), 4.05(s, 2H, NH2), 3.56(s, 3H, Me), 3.53(s, 3H, Me), 2.38(s, 3H, Me), 1.36(s, 9H, Me);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 196.7, 161.6, 150.2, 137.3, 130.0, 123.9, 87.1, 46.1, 41.6, 33.4, 29.4, 21.1; MS(ESI)m/z: 349.3{[M+H]+}, 371.3{[M+Na]+}。

在對廈門市實施可持續發展策略的過程中，首先應通過資源調查確定廈門市旅游資源的承載力以及資源的自身優勢，進而保障可持續發展策略的實施。[1]

(2) 吡唑硫代酰胺衍生物和吡唑噻唑衍生物的合成(以2f,3f為例)[14]

向反應管中依次加入1f0.0286 g(0.2 mmol)，二硫化四甲基秋蘭姆0.0721 g(0.3 mmol)，碘化鉀0.0066 g(0.02 mmol)，過硫酸鉀0.2162 g(0.4 mmol)和DMF/H2O(2 mL，V/V=5/1)，攪拌下于120 ℃反應12 h。冷卻至室溫，依次用CH2Cl2(3×150 mL)和飽和食鹽水(3×150 mL)萃取，合并有機相，抽濾，濾餅經無水Na2SO4干燥，蒸除溶劑，殘余物經硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯/石油醚=1/2，V/V)純化得2f。

向反應管中加入2f0.0354 g(0.2 mmol)和1 mL無水乙醇，于0 ℃攪拌使其溶解；用針筒注射溴丙酮酸乙酯38 μL(0.3 mmol)的無水乙醇(1 mL)溶液，于60 ℃反應6 h。抽濾，濾餅用無水Na2SO4干燥，蒸除溶劑，殘余物經硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯/石油醚=1/4，V/V)純化得3f。

2f： 黃色固體，收率85%, m.p.209.0～210.3 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 13.69(s, 1H, NH), 9.57(brs, 1H, NH2), 9.44(brs, 1H, NH2), 8.69(d,J=8.3 Hz, 1H, Ar-H), 7.61(d,J=8.4 Hz, 1H, Ar-H), 7.42～7.39(m, 1H, Ar-H), 7.27(t,J=7.6 Hz, 1H, Ar-H);13C NMR(151 MHz, DMSO-d6)δ: 191.3, 142.1, 141.8, 126.7, 123.8, 122.8, 122.8, 111.2; MS(ESI)m/z: 178.1{[M+H]+}, 200.2{[M+Na]+}。

2g： 黃色固體，收率77%, m.p.104.5～105.3 ℃;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 8.11(brs, 1H, NH2), 7.77(s, 2H, Ar-H), 7.39(brs, 1H, NH2), 6.46(s, 1H, Ar-H), 3.67(brs, 2H, NH2);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 191.7, 151.5, 147.2, 136.6, 136.1, 134.0(JC-F=34.5 Hz), 126.1(JC-F=3.7 Hz), 122.0(JC-F=273.9 Hz), 94.1; MS(ESI)m/z: 355.0{[M+H]+}, 377.0{[M+Na]+}。

2h： 黃色固體，收率87%, m.p.198.1～199.7 ℃;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 8.11(brs, 1H, NH2), 7.79(s, 2H, Ar-H), 7.47(brs, 1H, NH2), 5.27(brs, 2H, NH2), 3.46～3.33(m, 2H, CH2), 1.40(t,J=7.1 Hz, 3H, CH3);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 189.4, 150.9, 147.2, 136.7, 136.6, 134.9, 134.5(JC-F=34.6 Hz), 126.2, 121.9(JC-F=274.0 Hz), 98.8, 48.5, 6.0; MS(ESI)m/z: 431.0{[M+H]+}, 452.8{[M+Na]+}。

2i： 黃色固體，收率62%, m.p.78.4～79.9 ℃;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 8.06(brs, 1H, NH2), 7.81(s, 2H, Ar-H), 7.44(brs, 1H, NH2), 5.31(brs, 2H, NH2);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 188.3, 151.9, 148.9, 136.8, 136.7, 134.9(JC-F=34.9 Hz), 134.3, 126.5(JC-F=341.5 Hz), 126.4(JC-F=3.8 Hz), 126.3(JC-F=3.9 Hz), 121.9(JC-F=274.1 Hz), 92.9; MS(ESI)m/z: 470.9{[M+H]+}, 493.2{[M+Na]+}。

3f： 白色固體，收率81%, m.p.163.6～164.3 ℃;1H NMR(600 MHz, DMSO-d6)δ: 13.69(s, 1H, NH), 8.53(s, 1H, Ar-H), 8.36(d,J=8.1 Hz, 1H, Ar-H), 7.66(d,J=8.4 Hz, 1H, Ar-H), 7.50～7.47(m, 1H, Ar-H), 7.34(t,J=7.4 Hz, 1H, Ar-H), 4.37(q,J=7.1 Hz, 2H, CH2), 1.36(t,J=7.1 Hz, 3H, CH3);13C NMR(151 MHz, DMSO-d6)δ: 162.7, 161.2, 147.3, 141.9, 138.6, 128.6, 127.7, 123.0, 121.8, 120.1, 111.4, 61.3, 14.7; MS(ESI)m/z: 273.8{[M+H]+}, 295.8{[M+Na]+}。

3i： 白色固體，收率35%, m.p.119.9～120.8 ℃;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 8.16(s, 1H, Ar-H), 7.79(s, 2H, Ar-H), 5.36(brs, 2H, NH2), 4.42～4.32(m, 2H, CH2), 1.40(t,J=7.1 Hz, 3H, CH3);13C NMR(151 MHz, CDCl3)δ: 161.0, 158.5, 151.3, 147.8, 146.0, 137.0, 136.9, 134.8(JC-F=34.6 Hz), 134.4, 127.9, 126.2(JC-F=339.6 Hz), 126.4, 126.3, 121.9(JC-F=274.3 Hz), 89.2, 61.5, 14.1; MS(ESI)m/z: 566.8{[M+H]+}, 588.9{[M+Na]+}。

(3)2j的合成

在反應瓶中加入19.3 g(60 mmol) 5-氨基-3-氰基-1-(2,6-二氯-4-三氟甲基苯基)吡唑(1j)和150 mL二氯甲烷，于-15 ℃攪拌使其溶解；滴加氯化硫2.5 mL(31 mmol)的二氯甲烷(20 mL)溶液，攪拌反應過夜。加入三乙胺調節pH至6～7，抽濾，濾餅依次用二氯甲烷和蒸餾水洗滌兩次，用環己烷重結晶得淡黃色針狀晶體2j18.4 g，收率84.6%。

(4)3j的合成

在100 ml圓底燒瓶中，依次加入2j0.7019 g(1 mmol)，連二硫酸鈉0.0348 g(3 mmol)， 1,2-二溴乙烷129 μL(4 mmol)，DMF/H2O(9 mL，V/V=8/1)，橡膠塞封口，加裝氮氣球，40 ℃攪拌反應12 h后冷卻至室溫。用CH2Cl2(3×150 mL)和飽和食鹽水(3×150 mL)萃取，合并有機相，抽濾，經無水Na2SO4干燥，蒸除溶劑，殘余物經硅膠柱層析(乙酸乙酯/石油醚=1/3，V/V)純化得新型含硫吡唑雜環化合物3j。

3j： 白色固體，收率56%, m.p.161.1～162.5 ℃;1H NMR(500 MHz, CDCl3)δ: 7.80(s, 2H, Ar-H), 4.29(s, 2H, NH2), 3.51(t,J=7.4 Hz, 2H, CH2), 3.10(t,J=7.4 Hz, 2H, CH2);13C NMR(126 MHz, CDCl3)δ: 150.3, 136.6, 134.9(JC-F=32.3Hz), 132.5, 126.5(JC-F=3.8 Hz), 123.1, 120.9, 112.5, 94.5, 38.7, 30.3; MS(ESI)m/z: 458.5{[M+H]+}, 480.3{[M+Na]+}。

(5)4j的合成

向反應管中依次加入3j0.0912 g(0.2 mmol)，無水碳酸鉀0.0553 g(0.2 mmol)，DMF/H2O(2 mL，V/V=400/1)，封管，80 ℃攪拌反應12 h后冷卻至室溫。用CH2Cl2(3×150 mL)和飽和食鹽水(3×150 mL)萃取，合并有機相，抽濾，經無水Na2SO4干燥，蒸除溶劑，殘余物經硅膠柱層析(乙酸乙酯/石油醚=1/2，V/V)純化得新型含硫吡唑雜環化合物4j。

4j： 淡黃色固體，收率50%, m.p.180.4～182.3 ℃;1H NMR(600 MHz, CDCl3)δ: 7.76(s, 2H, Ar-H), 3.67(t,J=3.8 Hz, 3H, NH, CH2), 3.00～2.95(m, 2H, CH2);13C NMR(151 MHz, DMSO-d6)δ: 143.7, 136.2, 136.0, 133.3(JC-F=33.7 Hz), 127.0(JC-F=3.6 Hz), 123.7(JC-F=182.7Hz), 113.6, 91.80, 60.2, 42.4, 24.6;MS(ESI) m/z: 378.9{[M+H]+}, 400.7{[M+Na]+}。

(6)5j的合成

向反應管中依次加入4j0.0756 g(0.2 mmol)和乙醇1 mL，于0 ℃攪拌使其溶解；緩慢滴加間氯過氧苯甲酸(m-CPBA)0.0518 g(0.3 mmol)的乙醇(1 mL)溶液，封管，攪拌下于40 ℃反應15 min。冷卻至室溫，抽濾，濾餅用無水Na2SO4干燥，蒸除溶劑，殘余物經硅膠柱層析(洗脫劑：乙酸乙酯)純化得5j。

5j： 白色固體，收率85%, m.p.235.7～237.8 ℃;1H NMR(500 MHz, DMSO-d6)δ: 8.32(d,J=1.4 Hz, 1H, Ar-H), 8.29(d,J=1.4 Hz, 1H, Ar-H), 8.24(d,J=4.5 Hz, 1H, NH), 3.76～3.46(m, 2H, CH2), 3.21～2.55(m, 2H, CH2);13C NMR(126 MHz, DMSO-d6)δ: 146.3, 135.9, 135.8, 134.8, 133.3(JC-F=34.0 Hz), 126.8(JC-F=3.4 Hz), 126.0, 122.4(JC-F=269.1 Hz), 112.0, 102.0, 43.5, 31.0; MS(ESI)m/z: 394.8{[M+H]+}, 416.2{[M+Na]+}。

1.3 抗菌活性測定

采用生長速率法[15-16]測試了目標產物對稻瘟病菌的抑菌活性。將化合物溶于二甲基亞砜中，制備為濃度10 mg·mL-1的母液，將母液(150 μL)與15 mL熔融的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基(PDA)在低溫(約40 ℃)下混合，最終藥物濃度為100 mg·L-1(1%二甲基亞砜)。隨后，立即倒入直徑為90 mm的培養皿中，形成2～3 mm厚的平板。實驗設含有濃度為1%的二甲基亞砜作空白對照。

冷卻后，將培養好的待測病原菌，在無菌條件下用直徑為5 mm的滅菌打孔器，自菌落邊緣切取菌餅，用接種針將菌餅將直徑5 mm的菌絲盤放置在每個平板的中心，接種器一側朝下。將培養皿于28 ℃避光培養，直到菌絲到達對照培養皿的邊緣，每個實驗重復3次。用十字交叉法測量抑菌圈直徑(D)3次，取平均值，計算抑菌率,結果見表1。

2 結果與討論

2.1 抗稻瘟病菌活性

表1為14種含硫吡唑雜環化合物對稻瘟病菌的抗菌活性結果。由表1可知，當用藥量為100 mg·L-1時，所有化合物對稻瘟病菌都有一定的抑制效果。其中，化合物3c對稻瘟病菌的抑制率達到63.6%，化合物2f對稻瘟病菌的抑制率達到81.9%，化合物2i對稻瘟病菌的抑制率達到65.3%，相較于合成的其他化合物表現出較好的抑制稻瘟病菌的生物活性。但是，與市場主流殺菌劑多菌靈(Carbendazim)的活性相比，還有較大差距。對標高效、廣譜的多菌靈，有利于后續對含硫吡唑雜環化合物繼續改造以提高其抗菌活性。

表1 含硫吡唑雜環化合物對稻瘟病菌的抗菌活性

2.2 構效關系

目標化合物的活性測試結果顯示，當吡唑的1-位取代基為苯基，3-位取代基為甲基時，表現出較好的抗菌活性，達63.6%；若3-位取代基由甲基替換成苯基，其抗菌活性大幅度下降，為3.4%。因此，3-位的取代基對抗菌活性可能有較大影響，在此位點活性取代基的衍生有待進一步的深入研究；對比化合物2f和3f以及2i和3i，將硫代酰胺基團成環為噻唑，其抗菌活性分別從81.9%急劇下降為8.1%， 65.3%下降為56.4%，說明硫代酰胺基團對反應活性的影響較大。此外，對比化合物2g～2i，吡唑的4-位的三氟甲基亞磺?；欣谔岣呖咕钚浴?/p>

合成了14種含硫吡唑雜環化合物，其中化合物3j，4j，5j為新化合物。抑菌實驗結果表明，在100 mg·L-1濃度下，大部分化合物對稻瘟病菌表現出一定的抑制活性。其中化合物3c對稻瘟病菌的抑制率達到63.6%；化合物2f對稻瘟病菌的抑制率達到81.9%；化合物2i對稻瘟病菌的抑制率達到65.3%。后續課題組將會對含有硫代酰胺基團的化合物作進一步衍生和擴展，合成活性更好的含硫吡唑雜環衍生物。