連作對不同類型植煙土壤化學性狀、酶活性及細菌群落的影響

杜杏蓉，李運國，鄧小鵬，李軍營，姜永雷，童文杰，歐陽鋮人，趙正雄，王娜

摘? 要：為探明不同類型植煙土壤對連作的響應差異，以云南的紅壤、水稻土和紫色土為研究對象，分析烤煙連作5年土壤化學指標、酶活性和細菌群落特征的變化。結果表明，連作5年后，與輪作處理比較，水稻土和紅壤的有機質、全氮、全磷、堿解氮、有效磷含量顯著增加，pH、速效鉀含量顯著降低，紫色土僅速效鉀含量顯著增加，其他指標無明顯變化。3種土壤的過氧化氫酶活性顯著下降，脲酶活性不同程度增加，但紫色土增加不顯著;水稻土的蔗糖酶活性顯著下降，紅壤和紫色土則變化不明顯。3種類型土壤均以變形菌門、藍細菌門、酸桿菌門、綠彎菌門和擬桿菌門等5個菌門為優勢菌群。連作5年后，不同類型土壤的細菌群落相對豐度與活性存在一定差異，其中紫色土的細菌群落結構組成與輪作處理最為相似，其ACE和Shannon指數在3種土壤中變幅較小。綜合比較來看，烤煙連作對紫色土的主要生化指標微生物群落結構影響較小，說明紫色土對烤煙連作響應相對不敏感。

關鍵詞：土壤類型;連作;化學性狀;酶活性;細菌群落

Effects of Continuous Cropping on Chemical Properties， Enzyme Activities and Bacterial Communities in Different Types of Tobacco-Planted Soil

DU Xingrong1， LI Yunguo1， DENG Xiaopeng2， LI Junying2， JIANG Yonglei2， TONG Wenjie2，

OUYANG Chengren1， ZHAO Zhengxiong1， WANG Na1*

（1. College of Tobacco Science， Yunnan Agriculture University， Kunming 650201， China; 2. Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences， Yuxi， Yunnan 653199， China）

Abstract： In order to find out the difference in response to continuous cropping of three tobacco-planted soil types， taking red soil， paddy soil and purple soil in Yunnan Province as research objects， the changes of soil chemical indexes， enzyme activities and bacterial community characteristics under continuous cropping flue-cured tobacco for 5 years were analyzed. The results showed： after 5 years of continuous cropping， compared with the rotation treatment， the contents of organic matter， total nitrogen， total phosphorus， alkali hydrolyzable nitrogen and available phosphorus of paddy soil and red soil increased significantly， and the contents of pH value and available potassium decreased significantly， meanwhile only the content of available potassium of purple soil increased significantly， and other indexes did not change significantly. The catalase activity of the three soil types decreased significantly， the urease activity increased in varying degrees， but the increase of purple soil was not significant. The sucrase activity of paddy soil decreased significantly， and the change of red soil and purple soil were not obvious. The dominant flora of the three soil types were proteobacteria， cyanobacteria， acidobacteria， chloroflexi and bacteroidetes. After 5 years of continuous cropping， there were some differences in the relative abundance and activity of bacterial communities of different soil types. The structural composition of bacterial communities in purple soil was the most similar to that in the rotation treatment， and the changes of ACE and Shannon index were smaller in the three soil types. Comprehensive comparison showed that continuous cropping of flue-cured tobacco had little effect on the main biochemical indexes and microbial community structure of purple soil， indicating that purple soil was relatively insensitive to continuous cropping of flue-cured tobacco.

Keywords： soil type; continuous cropping; chemical property; enzyme activity; bacterial community

近年來我國烤煙種植區域不斷壓縮，烤煙連作現象愈加嚴重，連作障礙已成為制約我國煙草產業可持續發展的重要因素[1-2]。前人研究表明，長期連作可導致烤煙土壤理化性狀惡化、養分比例失調、酶活性受到抑制、微生物群落特征明顯改變[3-7];同時這些環境因子相互作用對土壤環境產生綜合影響，導致病蟲害加劇和植株的減產降質。目前關于

不同類型土壤對烤煙連作耐受性的差異研究鮮見報道。為此，本研究選擇云南3類典型植煙土壤——紅壤、紫色土和水稻土，分析烤煙連作對其化學性狀、酶活性指標及微生物群落結構與豐度的影響，旨在探討不同土壤類型對烤煙連作的響應差異，為不同土壤類型的連作耐受性研究提供參考依據。

1? 材料與方法

1.1? 試驗地基本情況

試驗于2014—2019年在紅壤、紫色土和水稻土的長期定位植煙試驗田進行，其基礎化學性狀見表1。紅壤田位于云南省尋甸縣河口鎮雙龍村水井村民小組（N25°41′19″，E103°26′13″，海拔2020 m），紫色土田位于石林縣鹿阜鎮阿烏村干山沖村民小組（N 47°33′13″，E 157°23′15″，海拔1970 m），水稻土田位于云南省石林縣板橋鎮板橋村虎街村民小組（N 25°17′48″，E 103°21′51″，海拔1950 m）。土壤質地均為壤土，烤煙品種均為云煙87，連作采用了“烤煙-小麥→烤煙-小麥”的復種連作模式;作為對比的輪作采用了“烤煙-小麥→玉米-小麥”的復種輪作模式。紅壤田每年烤煙施純氮75 kg/hm2，m（N）∶m（P2O5）∶m（K2O）=1∶2∶2，施農家肥500 g/株;紫色土田每年烤煙施純氮75 kg/hm2，m（N）∶m（P2O5）∶m（K2O）=1∶1∶2.5;水稻土田每年烤煙施純氮75 kg/hm2，m（N）∶m（P2O5）∶m（K2O）=1∶2∶2。連作模式下每年小麥施純氮82.5 kg/hm2，m（N）∶m（P2O5）∶m（K2O）=1∶0.4∶1。輪作模式下每年小麥施純氮67.5 kg/hm2，m（N）∶m（P2O5）∶m（K2O）=1∶0.4∶1;玉米施純氮180 kg/hm2，m（N）∶m（P2O5）∶m（K2O）=1∶0.38∶0.47?？緹煹脑耘喙芾矸椒ň凑债數貎炠|煙葉生產技術規程執行。

1.2? 土樣采集

水稻土代號為A、紫色土代號為B，紅壤代號為C，輪作處理編號為0，連作5年處理編號5，每個處理3次重復，每個小區面積為0.067 hm2。2019年于烤煙成熟期在每個小區隨機選取3個點，去除地表凋落物，采集表層土樣（利用環形取土器取土，直徑3 cm，深度0～20 cm），充分混均勻后采用四分法留取1.5 kg。土壤樣品采集后過2 mm篩，然后分為兩份：一份風干后用于土壤理化性狀和酶活性的測定;另一份在液氮中速凍后置于–80 ℃低溫保存，用于土壤細菌的測定。

1.3? 測定項目與方法

1.3.1? 土壤化學指標測定? pH測定采用美國SPECTRUM公司IQ150 pH儀，有機質測定采用重鉻酸鉀氧化法，全氮測定采用高氯酸-硫酸消化、半微量開氏蒸餾法（NY/T53—1987），全磷測定采用高氯酸-濃硫酸消化、鉬藍比色法（NY/T 88—1988），全鉀測定采用NaOH熔融-火焰光度計法（NY/T 87—1988），堿解氮測定采用堿解擴散法（LY/T 1229—1999），有效磷測定采用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法（NY/T 1121.7—2006），速效鉀測定采用醋酸銨浸提-火焰光度計法（NY/T 889—2004）[8]。每個測定指標均設置3次重復。

1.3.2? 土壤酶活性測定? 過氧化氫酶活性測定采用高錳酸鉀滴定法，蔗糖酶活性測定采用3，5-二硝基水楊酸比色法，脲酶活性測定采用苯酚鈉-次氯酸鈉比色法，磷酸酶活性測定采用磷酸苯二鈉比色法[9]。每個指標測定均設置3次重復。

1.3.3? 土壤細菌群落結構和多樣性測定? 使用PowerSoil DNA提取試劑盒，從1.0 g土壤樣本中提取基因組DNA;用紫外分光光度計檢測DNA濃度和純度;用0.8%瓊脂糖凝膠電泳測定DNA分子量。將DNA保存在–20 ℃以進行PCR擴增。用細菌V4-16S rRNA基因特異性引物515F和806R進行PCR擴增。通過Illumina MiSeq PE300平臺進行測序。

使用SILVA 16S數據庫作為細菌參考數據庫，將過濾后的Tags進行拼接，以97%的相似度為界，聚類成可操作分類單元（OTUs），并對OTUs代表性序列進行注釋[10]。

1.4? 數據處理與統計分析

數據處理、統計分析制圖運用IBM SPSS Statistics 24.0和Microsoft Excel 2010進行。

2? 結? 果

2.1? 烤煙連作對不同類型植煙土壤化學指標的影響

由表2可知，相較輪作而言，烤煙連作5年后，3種土壤的pH呈不同程度降低，水稻土和紅壤的pH分別顯著下降2.20和1.26，紫色土pH僅降低0.42，降低不顯著;水稻土和紅壤的有機質、全氮、全磷、堿解氮、有效磷含量均顯著增加，紫色土的有機質、全氮含量增加不顯著，僅增加了1.68、0.01 g/kg，其全磷、堿解氮和有效磷含量略有下降，分別下降了0.07 g/kg、1.80 mg/kg、0.63 mg/kg，降低不顯著;水稻土和紅壤的速效鉀含量顯著下降，分別降低了340.67、72.33 mg/kg，紫色土速效鉀含量則顯著增加了120.00 mg/kg;紅壤全鉀含量顯著下降了15.53 g/kg，水稻土的全鉀含量則增加了1.36 g/kg，增加不顯著，紫色土全鉀含量僅下降了1.03 g/kg，降幅不顯著。

2.2? 烤煙連作對不同土壤酶活性的影響

由表3可知，相較輪作而言，烤煙連作5年后，3種土壤的過氧化氫酶活性均顯著下降，其中，紫色土的降幅最小為6.06%;水稻土的蔗糖酶活性顯著下降了7.08 mg/（g·d），紫色土僅下降了0.17 mg/（g·d），下降不顯著，紅壤的蔗糖酶活性則增加了0.42 mg/（g·d），增加不顯著;3種土壤的脲酶和磷酸酶活性均有所增加，其中，紫色土脲酶活性增幅最小，為0.01 mg/（g·d），增加不顯著，但其磷酸酶活性則增幅最大，顯著增加了1.66 mmol/（g·h）。

2.3? 烤煙連作土壤細菌群落結構和多樣性變化特征分析

2.3.1? 細菌群落結構變化? 利用Mothur方法將所有處理土樣的門水平細菌分為41種（圖1），并將相對豐度最大的前10種進行比較分析后發現，3種土壤共有的相對豐度最大的5個優勢菌門為：變形菌門（Proteobacteria，占總測序數據的27.32%）、藍細菌門（Cyanobacteria，占總測序數據的12.37%）、酸桿菌門（Acidobacteria，占總測序數據的19.82%）、綠彎菌門（Chloroflexi，占總測序數據的9.58%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，占總測序數據的8.10%），5個菌門共占總測序數據的77.19%。連作5年后，水稻土的酸桿菌門、綠彎菌門、硝化螺旋菌門（Nitrospirae）相對豐度較輪作處理明顯降低，而藍細菌門、變形菌門相對豐度卻增加明顯;紫色土的藍細菌門、硝化螺旋菌門、放線菌門（Actinobacteria）相對豐度明顯降低，而綠彎菌門、擬桿菌門、酸桿菌門則明顯增加;紅壤的藍細菌門相對豐度明顯降低，但綠彎菌門、酸桿菌門和硝化螺旋菌門則明顯增加。

2.3.2? 細菌α多樣性變化? 由圖2可知，16S rDNA擴增子測序的覆蓋率（Coverage）均在95.5%以上，表明測序結果符合所取土壤樣本中微生物的實際情況，且測序的長度符合后續分析要求。相較輪作而言，烤煙連作5年后，水稻土的Chao1指數、ACE指數分別顯著下降了80.09%和80.48%，Shannon指數下降了43.68%，Simpson指數顯著升高了97.15%;紫色土和紅壤的Chao1指數、ACE指數和Shannon指數則有所升高，其中，Chao1指數分別升高了14.77%和29.48%，ACE指數分別升高了14.47%和29.45%，Shannon指數分別升高了3.99%和9.83%，Simpson指數下降了3.99%和9.83%，且除紫色土的Chao1指數外，其余指數變化均不顯著。綜合以上結果來看，烤煙連作5年對水稻土細菌群落結構的豐度和多樣性影響最大、紅壤次之，紫色土影響最小，且連作導致水稻土細菌群落結構的豐度和多樣性顯著降低。

2.3.3? 細菌β多樣性變化? 主坐標分析（Principal Co-ordinates Analysis， PCoA）結果顯示（圖3），第一坐標軸和第二坐標軸分別解釋了細菌總變異數的32.35%和15.80%，共計48.15%。圖3還表明，烤煙連作5年后，水稻土和紅壤的細菌群落結構與輪作處理差異較大，細菌群落結構組成發生明顯改變，且水稻土的變化大于紅壤;紫色土的細菌群落結構相較而言變化較小，細菌群落結構組成與輪作最為相似。

3? 討? 論

本研究發現連作導致了不同類型植煙土壤pH下降，這與白羽祥等[1]的研究結果一致。主要原因可能是連作條件下，每年投入的肥料養分一致，并且煙株對養分的選擇性吸收相對固定，使得土壤膠體上吸附的H+或Al3+在土壤中逐年積累[11];并且土壤本身含有的非腐質如有機酸、氨基酸，以及烤煙根系和微生物的有機酸類分泌物，均會釋放H+和酸性物質，使根區的pH下降[2]。

連作導致3種土壤的有機質、全氮、堿解氮和有效磷含量不同程度增加，這與王鵬[12]、王棋等[13]的研究結果相一致，即隨著連作年限增加，部分養分會在土壤中積累，出現土壤養分含量增加的現象。

連作導致3種土壤的過氧化氫酶活性顯著降低，磷酸酶、脲酶活性則不同程度地增強。該結果與蔡秋燕等[14]的研究結果不完全一致，其研究發現植煙連作土壤酶活性隨連作年限的延長不同程度下降。分析原因可能與不同類型土壤的質地有關，不同質地的土壤其機械組成不同，而土壤酶活性與土壤黏粒含量呈正相關[15]，土壤質地越粘重，其土壤酶的活性越強，反之，土壤粒徑越大，其土壤酶尤其是水解酶類活性越弱。

連作5年后，3種類型土壤的細菌群落結構雖然組成基本相似，但不同種類細菌的相對豐度卻存在明顯差異，這與前人研究結果相一致。齊虹凌等[16]研究表明，土壤類型對細菌、真菌、放線菌、古菌等微生物的生長發育與動態消長有較大影響。周賽等[17]研究認為，土壤類型對土壤微生物分布格局具有較大影響，其貢獻率達60%。同時，水稻土的綠彎菌門、酸桿菌門和藍細菌門等3個門水平的菌群相對豐度與紅壤和紫色土的變化趨勢相反，這可能是由于水稻土長期處于淹水條件下，土壤容重較大，透氣性較差，與另外兩種土壤的物理性狀存在較大差異，進而影響了生活在其中的厭氧、好氧和兼性菌群的數量與活性;而淹水和好氣條件下土壤微生物的群落結構是朝不同方向演替的，這與高林等[18]的研究結果一致。

本研究顯示，烤煙連作5年后，3種土壤的化學性狀、酶活性和細菌群落組成與結構，相較輪作而言均發生了一定改變，但不同土壤類型的變化趨勢或程度是有差異的。連作導致了水稻土和紅壤的主要化學指標、酶活性以及細菌群落組成和結構發生較大變化，而紫色土的變化相對不明顯，紫色土對連作的耐受性相對較好。我們推測這可能與不同類型土壤的土壤恢復力有關，即土壤可以通過自身調節機制，在一定限度內抵抗外因脅迫而保持狀態相對穩定。紫色土的土壤恢復力強于其余兩種土壤，從而可為烤煙生長和土壤生物的活動提供一個相對穩定的土壤環境條件，而關于不同類型土壤恢復力強弱差異的內在機制和具體原因有待下一步深入研究。

4? 結? 論

本研究結果表明，與輪作相比，連作5年后3種類型植煙土壤的化學性狀和酶活性均有不同程度的改變。其中水稻土和紅壤的主要化學指標、酶活性以及細菌群落組成和結構發生較大變化，而紫色土對連作響應相對不敏感，其化學性狀、酶活性指標相對穩定，細菌群落組成、豐度與多樣性變化較小。紫色土對烤煙連作的耐受性相對較好。

參考文獻

[1] 白羽祥，藺忠龍，鄧小鵬，等. 基于逐步回歸模型的連作植煙土壤化學性狀和酶活性關系分析[J]. 南方農業學報，2018，49（12）：2387-2393.

BAI Y X， LIN Z L， DENG X P， et al. Analysis of relationships between chemical properties and enzyme activity in continuous cropping tobacco-planted soil based on stepwise regression model[J]. Journal of Southern Agriculture， 2018， 49（12）： 2387-2393.

[2] LIU J J， YAO Q， LI Y S， et al. Continuous cropping of soybean alters the bulk and rhizospheric soil fungal communities in a Mollisol of Northeast PR China[J]. Land Degradation & Development， 2019， 30（14）： 1725-1738.

[3] 李奉國，馬龍傳，孔勇，等. 連作對大蒜土壤養分、微生物結構和酶活的影響[J]. 中國農業科技導報，2019，21（1）：141-147.

LI F G， MA L C， KONG Y， et al. Effect of continuous garlic cropping on soil nutrients，microbial structure and enzyme activity[J]. Journal of Agricultural Science and Technology， 2019， 21（1）： 141-147.

[4] 張會慧，金微微，岳冰冰，等. 連作對東北地區烤煙生長和葉片光合特性的影響[J]. 中國煙草科學，2013，34（2）：18-22，27.

ZHANG H H， JIN W W， YUE B B， et al. Effects of continuous cropping on growth and photosynthetic characteristics in leaves of flue-cured tobacco in northeast of China[J]. Chinese Tobacco Science， 2013， 34（2）： 18-22， 27.

[5] 陳繼峰，孫會，夏陽，等. 不同連作年限煙田土壤酶活性及養分含量變化[J]. 河南農業科學，2016，45（10）：60-64.

CHEN J F， SUN H， XIA Y， et al. Changes in soil enzyme activity and nutrient content in tobacco fields with different continuous cropping years[J]. Henan Agricultural Sciences， 2016， 45（10）： 60-64.

[6] 高林，王新偉，申國明，等. 不同連作年限植煙土壤細菌和真菌群落結構差異[J]. 中國農業科技導報，2019，21（8）：147-152.

GAO L， WANG X W， SHEN G M， et al. Differences of bacteria and fungi community structure in tobacco-planting soil of different continuous cropping years[J]. Journal of Agricultural Science and Technology， 2019， 21（8）： 147-152.

[7] 楊敏，裴衛華，董家紅，等. 魔芋連作對根際土壤微生物數量及酶活性的影響[J]. 北方園藝，2018（23）：110-115.

YAN M， PEI W H， DONG J H， et al. Effect of longterm continuous cropping with amorphophallus konjac on rhizosphere soil microflora and enzyme activities[J]. Northern Horticulture， 2018（23）： 110-115.

[8] 鮑士旦. 土壤農化分析[M]. 3版. 北京：中國農業出版社，2000.

BAO S D. Soil agrochemical analysis[M]. 3rd edition. Beijing： China Agriculture Press， 2000.

[9] 梅守榮. 土壤酶活性及其測定[J]. 上海農業科技，1985（1）：17-18.

MEI S R. Soil enzyme activity and its determination[J]. Shanghai Agricultural Science and Technology， 1985（1）： 17-18.

[10] BOKULICH N A， SUBRAMANIAN S， FAITH J J， et al. Quality-filtering vastly improves diversity estimates from Illumina amplicon sequencing[J]. Nature methods， 2013， 10（1）： 57-59.

[11] 王瑞，鄧建強，譚軍. 連作條件下植煙土壤保育與修復[J]. 中國煙草科學，2016，37（2）：83-88.

WANG R， DENG J Q， TAN J. Ecological protection and remediation of tobacco-growing soils in continuous cropping regions[J]. Chinese Tobacco Science， 2016， 37（2）： 83-88.

[12] 王鵬，孟蕾，張吉立，等. 不同連作時期對烤煙氮素吸收和利用的影響[J]. 中國煙草科學，2012，33（4）：75-78.

WANG P， MENG L， ZHANG J L， et al. Nitrogen uptake and utilization of flue-cured tobacco in various continuous cropping years[J]. Chinese Tobacco Science， 2012， 33（4）： 75-78.

[13] 王棋，徐傳濤，王昌全，等. 烤煙連作對土壤生態化學計量特征的影響[J]. 農業資源與環境學報，2020，37（5）：702-708.

WANG Q， XU C T， WANG C Q， et al. Effects of continuous cultivated flue-cured tobacco on soil eco-stoichiometric characteristics[J]. Journal of Agricultural Resources and Environment， 2020， 37（5）： 702-708.

[14] 蔡秋燕，陽顯斌，孟祥，等. 不同連作年限對植煙土壤性狀的影響[J]. 江西農業學報，2020，32（10）：93-98.

CAI Q Y， YANG X B， MENG X， et al. Effects of continuous cropping years on properties of flue-cured tobacco soil[J]. Acta Agriculturae Jiangxi， 2020， 32（10）： 93-98.

[15] 吳禮樹. 土壤肥料學[M]. 2版. 北京：中國農業出版社，2011.

WU L S. Soil and fertilizer science[M]. second edition. Beijing： China Agriculture Press， 2011.

[16] 齊虹凌，賀國強，李恒全，等. 輪作與連作對烤煙不同生育期根際土壤細菌群落結構的影響[J]. 中國煙草學報，2015，21（5）：42-48.

QI H L， HE G Q， LI H Q， et al. Effects of rotational and continuous cropping on bacterial community structures in rhizospheric soil at different growth stages of flue-cured tobacco[J]. Acta Tabacaria Sinica， 2015， 21（5）： 42-48.

[17] 周賽，梁玉婷，孫波. 紅壤微生物群落結構及其演變影響因素的研究進展[J]. 土壤，2015，47（2）：272-277.

ZHOU S， LIANG Y T， SUN B， et al. Research advances in environmental and human factors affecting microbial community structure and evolution in red soils[J]. Soils， 2015， 47（2）： 272-277.

[18] 高林，董建新，武可峰，等. 土壤類型對煙草生長發育的影響研究進展[J]. 中國煙草科學，2012，33（1）：98-101.

GAO L， DONG J X， WU K F， et al. Effect of soil types on tobacco growth and development： a review[J]. Chinese Tobacco Science， 2012， 33（1）： 98-101