黑點根腐病菌和鐮孢菌復合侵染引起的甜瓜根腐病的鑒定

吳會杰　嚴蕾艷　郭珍　彭斌　康保珊　劉莉銘　古勤生

摘 要：為明確甘肅皋蘭地區甜瓜根腐病的病菌，通過病菌分離、致病性測定，采用真菌形態學結合基因序列分析對該病菌進行了鑒定。結果表明，引起甜瓜根腐病的主要病原菌為尖孢鐮孢菌甜瓜專化型（Fusarium oxysporum f. sp. melonis，FOM）及引起黑點根腐病的子囊真菌（Monosporascus cannonballus）。致病性分析表明，尖孢鐮孢菌甜瓜專化型及M. cannonballus均可引起甜瓜胚根的壞死、腐爛，側根不能生長;其中M. cannonballus使瓜類砧木-南瓜品種思壯12的胚根變褐，但不影響主根和側根的生長。明確了甘肅皋蘭地區甜瓜根腐病的主要致病菌，為防控該病害提供了理論依據。

關鍵詞：甜瓜;根腐病;病原鑒定;致病性分析

中圖分類號：S652 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）10-015-05

Identification of melon root rot pathogen of Monosporascus cannonballus and Fusarium oxysporum f. sp. melonis

WU Huijie1， YAN Leiyan2， GUO Zhen1， PENG Bin1， KANG Baoshan1， LIU Liming1， GU Qinsheng1

（1. Zhengzhou Fruit Research Institute， Chinese Academy of Agricultural Sciences， Zhengzhou， 450009， Henan， China; 2. Institute of Vegetables， Ningbo Academy of Agricultural Sciences， Ningbo 315040， Zhejiang， China）

Abstract： In order to clarify the pathogens of melon root rot in Gansu province of Chian， the isolation， identification and pathogenicity of the pathogens were conducted. The results showed that the main pathogens causing melon root rot were Fusarium oxysporum f.sp. melonis （FOM） and Monosporascus cannonballus. The pathogenicity test showed that the two pathogens cause necrosis and rot of melon radicle. The lateral roots could not grow in infected plant， and the main roots were damaged. Moreover， M. cannonballus can also cause the radicle of the pumpkin variety Sizhuang 12 to appear brown， but the growth of the main root and lateral roots were not affected. This result laid the foundation for the prevention and control of melon root rot.

Key words： Melon;Root rot;Pathogen identification;Pathogenicity test

甜瓜是非常典型的連作障礙極為嚴重的作物，甜瓜連作會導致植株生長發育緩慢，病蟲害發生加重，產量及品質下降，嚴重時甚至導致作物絕產[1]，甜瓜根腐病是甜瓜連作時發生嚴重且較為普遍的病害。甜瓜根腐病大多是多種病原菌復合侵染的病害，在我國常見的病原菌為尖孢鐮孢菌甜瓜專化型（ Fusarium oxysporum f. sp. melonis，FOM）、立枯絲核菌（Rhizoctonia solani Kuhn）[2]、瓜類腐皮鐮孢菌（Fusarium solani （Mart.） App. et Wollenw）[3]及引起甜瓜黑點根腐病的子囊真菌（Monosporascus cannonballus）[4]等。其中甜瓜枯萎病是由尖孢鐮孢菌甜瓜專化型引起的真菌病害，是世界類土傳維管束病害[5]。M. cannonballus是Pollack 和 Uecker在1974年將從洋香瓜的病株根部分離的病原菌定名為子囊菌屬的新種，命名為 M. cannonballus[6]。M. cannonballus是土傳真菌，引起甜瓜根部腐爛，主要危害瓜類根系和莖基部。植株發病初期病部呈水漬狀，隨后至深褐色腐爛，病部不縊縮，維管束變褐色，侵染后期根部變糟，表皮脫落，僅有絲狀維管，果實成熟過程中，藤蔓逐漸萎蔫直至萎凋死亡[7]。該病菌在我國甘肅首次發現（2005年）[4]，隨后在甘肅武威（2009年）及酒泉市金塔縣（2018年）發現該病菌侵染甜瓜[8]，2020年7月在甘肅皋蘭發現甜瓜受害嚴重，病程發展非常迅速，從最初的冠頂葉子出現癥狀到最后植株死亡的歷程為5～10 d。該病害可造成30%～50%的經濟損失[4，9]，嚴重時甚至達100%[7]。

甜瓜根腐病害是設施甜瓜栽培發生普遍且難以防治的病害，鑒別病菌是防控該病的前提條件，筆者旨在明確甘肅省皋蘭縣甜瓜大面積萎蔫、死亡的主要病因，為防控該病提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 病害調查及樣本采集

2020年6月份調查甘肅省皋蘭縣大棚種植的甜瓜品種甘甜3號表現根腐癥狀的甜瓜，隨機采集10株。甘甜3號是薄皮甜瓜，瓜闊梨形，果皮綠色，果肉翠綠，是甘肅農業科學院選育的品種。

1.2 培養基制備

稱取洗凈去皮的馬鈴薯200 g，切成小塊，加水1000 mL煮沸0.5 h，紗布過濾，加入瓊脂粉15 g，加熱徹底溶化后，再加入葡萄糖20 g，攪拌均勻并溶解后，加自來水至總體積為1000 mL，分裝于250 mL三角瓶，121 ℃ 0.1 MPa滅菌20 min，隨后倒入直徑90 mm的培養皿備用。

1.3 病原菌的分離與鑒定

1.3.1 病原菌的分離 取根和莖部發生病變的組織，采用常規組織分離法，切取甜瓜根和莖基部病健交界處5 mm×5 mm的樣本，先用75%酒精消毒15 s，無菌水沖洗3遍，隨后再用2%次氯酸鈉消毒2 min，無菌水沖洗3遍，放置于滅過菌的濾紙上，干燥，最后把組織放置于PDA培養基上，培養，3 d后挑取菌絲，純化、培養。2020年8月將分離、純化的菌株保存于中國農業科學院鄭州果樹研究所瓜類病害課題組的-80 ℃冰箱。

1.3.2 形態學鑒定 將分離的菌株接種于PDA平板上，27 ℃恒溫黑暗培養6 d后，觀察記錄菌落特征、產孢結構及孢子形態。

1.3.3 分子鑒定 采用CTAB方法提取真菌DNA，用ITS1（5'-TCC GTA GGT GAA CCT GCG G-3'）和ITS4（5'-TCC TCC GCT TAT TGA TAT GC-3'）[10]為引物進行PCR擴增。擴增產物用1.0%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，發現有目的片段后，送生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序。采用ClustalX進行序列比對，采用MEGA X最大相似自然法（maximum likelihood method）進化樹分析 [11]。

1.4 致病性鑒定

致病性鑒定采用胚根接種法[3]進行。接種厚皮甜瓜品種金香玉（農友種苗（中國）有限公司提供）和南瓜品種思壯12（市售）。挑選胚根長約5 mm的發芽種子移入直徑90 mm的含潮濕濾紙的培養皿內，用5 mm打孔器打取新鮮培養的菌落周圍，取菌餅接種到胚根位置，接種后27 ℃黑暗保濕培養，接種24 h后開始觀察4 d。每個菌株接種10粒發芽種子，3次重復。

2 結果與分析

2.1 病害癥狀

甜瓜根腐病早期主要表現為植株萎蔫，形成發病中心，隨著病害的發展，根部出現大量的褐色水漬，后水漬變褐腐爛、須根大量減少，主根腐爛，發病嚴重的地塊植株枯萎死亡（圖1）。

2.2 病原菌的分離

在PDA培養基上共獲得可分離的29個純化株系，依據形態學觀察分為4種類型，其中尖孢鐮孢菌甜瓜專化型有14個，檢出頻率為48.28%（14/29）;M. cannonballus有9個，檢出頻率為31.03%（9/29），其他的病原菌占據20.69%（6/29）。

2.3 形態學及分子生物學鑒定

2.3.1 形態學鑒定 M. cannonballus在PDA培養基上菌絲生長速度快，27 ℃恒溫黑暗培養5 d后菌落直徑可達8 cm，氣生菌絲白色薄絨狀，不產生分生孢子，培養35 d以后才有零星的子囊殼及子囊孢子出現，每個子囊只含1個子囊孢子。尖孢鐮孢菌甜瓜專化型呈淺紫色，培養7 d后在顯微鏡下可觀察到大型的分生孢子和小孢子（圖2）。

2.3.2 分子生物學鑒定 取真菌的DNA，用ITS1/ITS4擴增獲得大約600 bp的條帶，將PCR產物送樣測序。其中一種是尖孢鐮孢菌甜瓜專化型，BLAST分析發現與Gen Bank中Fusarium oxysporum的序列一致性為99%（HE974453.1）。另外一種基因序列為608 bp，與Gen Bank中的M. cannonballus的序列一致性達99%（AM167937.1）。進化樹分析表明，甘肅分離物與黑點根腐病菌為一個分支，認定為黑點根腐病菌造成甘肅甜瓜根部腐爛，植株萎蔫死亡（圖3）。

2.4 致病性鑒定

將M. cannonballus和尖孢鐮孢菌甜瓜專化型接種厚皮甜瓜品種金香玉的胚芽，接種72 h后，M. cannonballus接種甜瓜胚芽后接種部位表現為褐色壞死，須根減少，主根正常生長，接種5 d后根部腐爛。尖孢鐮孢菌甜瓜專化型接種甜瓜后根部表現褐色，主根和須根均不能正常生長，表現出比M. cannonballus更強的致病力（圖4第1行）。從2種病菌接種發病后的組織中均能再次分離到與原接種菌株一致的病原菌，空白PDA接種對照表現為正常，主根和須根均正常生長。該結果表明，2種菌株均可侵染甜瓜根部，是造成甜瓜根腐的致病菌。

將2種病原菌接種生產上常用的嫁接砧木南瓜上品種思壯12，結果表明M. cannonballus接種南瓜后，接種部位表現褐色狀壞死，主根和須根生長正常，從接種發病的根部組織中可分離到該病原菌;而尖孢鐮孢菌甜瓜專化型接種南瓜后，在接種部位沒有觀察到根部組織病變。空白PDA接種南瓜后主根和須根均正常生長。該結果說明M. cannonballus可在南瓜品種思壯12的根部定植，但南瓜主根及側根生長依舊發達;而尖孢鐮孢菌甜瓜專化型不能引起南瓜品種思壯12發病（圖4第2行）。

3 討論與結論

甜瓜根腐病是甜瓜重要的土傳病害，筆者分析了造成甘肅皋蘭甜瓜根部腐爛的主要病原菌并進行了致病性鑒定，結果表明，尖孢鐮孢菌甜瓜專化型和黑點根腐病菌是主要致病菌。尖孢鐮孢菌甜瓜專化型在甜瓜的主栽區均有發生，而M. cannonballus主要在甘肅省發生[4，8]。M. cannonballus主要適生于干旱及半干旱的環境[12]，甘肅大部分地區氣候干燥，全年降水少，蒸發量大，有利于黑點根腐病菌的發生，因此M. cannonballus在甘肅的發生和發展較快。此外，2016年寧波農業科學院從寧波種植的甜瓜上分離到該病菌;2020年筆者在鄭州也鑒定到該病菌侵染甜瓜根部。這些結果表明，該病菌的適生范圍在擴大，對我國的中部及東部沿海地區的甜瓜均有可能造成大的危害，威脅著我國中部及東部沿海地區的甜瓜生產。因此，應加強對該病害發生情況的調查，針對發生區的自然條件進行合理的水肥管理，開展該病害的綜合防控，保障甜瓜產業的健康發展。

近年來，設施甜瓜高效栽培模式的推廣及全年連續種植的土壤環境有利于土傳病害的繁殖、傳播。嫁接是最經濟、高效的防控根部土傳病害的有效措施之一[13]，把感病香瓜和西瓜嫁接到南瓜屬或葫蘆屬砧木上，可降低黑點根腐病的發生[14]，嫁接南瓜能降低黑點根腐病在西瓜和甜瓜上的發病率，而土壤中黑點根腐病菌的孢子數量并沒有下降，但南瓜根部分離出黑點根腐病菌的分離頻率大大降低[15]。因而，筆者檢測了該病菌對南瓜思壯12的致病性，結果表明，M. cannonballus可在南瓜根部定殖，使南瓜根部變褐，與之前發現南瓜嫁接可降低黑點根腐病發生[14]的結果不一致，分析可能是不同的南瓜砧木對病菌的抗性不同導致的差異。此外，從接種南瓜和甜瓜后的癥狀比較可以看出，該病菌對南瓜的致病力弱，而對甜瓜的致病力強，嫁接仍是防控該病菌的一個重要手段，需要進一步加大砧木的篩選范圍，為該病害的防控奠定基礎。

本試驗結果明確了造成甘肅皋蘭甜瓜根部腐爛的主要病原菌是尖孢鐮孢菌甜瓜專化型和黑點根腐病菌;發現了M. cannonballus可使南瓜思壯12根部變褐。

致謝：感謝甘肅省農業科學蔬菜研究所程鴻研究員和楊永剛研究員協助實地調研和取樣！

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