甜瓜粉霉病病原菌生物學特性及其寄主范圍測定

王軍節　趙魯迺克　范春霞　張琇　王鵬　穆風花

摘? ? 要：為明確甜瓜粉霉病菌（Trichothecium roseum）生物學特性和寄主范圍，研究了不同營養和環境條件對甜瓜粉霉病菌菌絲生長、產孢和孢子萌發的影響，并采用損傷接種法測定病菌在室內條件下對寄主的致病性。研究結果表明，甜瓜粉霉病菌菌絲最適生長條件為PDA、PDA+CMF或PSA培養基，果膠為碳源，甘氨酸或牛肉膏為氮源，溫度28 ℃，pH 5.0～9.0，全黑暗培養;最佳產孢條件為PDA培養基，果膠為碳源，牛肉膏為氮源，溫度22～28 ℃，pH 7.0，全黑暗或光暗交替培養;孢子最佳萌發條件為溫度28 ℃，pH 7.0，全黑暗高濕環境培養。此外，甜瓜粉霉病菌可侵染玉金香甜瓜、早酥梨、富士蘋果、金冠蘋果和AC番茄，但不能侵染金橘和紅地球葡萄。生物學特性和寄主范圍研究結果可為綜合防治采后粉霉病提供科學依據。

關鍵詞：厚皮甜瓜;粉霉病;粉紅單端孢;生物學特性;寄主范圍

中圖分類號：S635.1 文獻標志碼：A 文章編號：1673-2871（2021）10-020-06

Biological characteristics and host range of the pathogen causing pink rot of muskmelon

WANG Junjie， ZHAO Lunaike， FAN Chunxia， ZHANG Xiu， WANG Peng， MU Fenghua

（Ningxia Key Laboratory for the Development and Application of Microbial Resources in Extreme Environments/College of Biological Science and Engineering， North Minzu University， Yinchuan 750021， Ningxia， China）

Abstract： In order to determine the biological characteristics and host range of Trichothecium roseum， which is the pathogen of pink rot in muskmelon fruit， the effects of different nutritional and environmental conditions on mycelial growth， sporulation and conidial germination of the pathogen were studied. Meanwhile， the pathogenicity of T. roseum to hosts in indoor conditions was determined by the methodology of injury inoculation. The results of biological characteristics showed that the most suitable growth conditions for the pathogen were PDA， PDA+CMF or PSA medium， pectin as carbon source， glycine or beef extract as nitrogen source， 28 ℃， pH 5.0-9.0 and culture in total darkness; the best sporulation conditions were PDA medium， pectin as carbon source， beef extract as nitrogen source， 22-28 ℃， pH 7.0 and culture in total darkness or in alternating light and darkness; the favorable condition for conidia germination were 28 ℃， pH 7.0， high humidity and culture in total darkness. Furthermore， the pathogen could infect Yujinxiang muskmelon， Zaosu pear， Red Fuji apple， Golden Delicious apple and Ailsa Craig tomato except kumquat and Red Globe grape. These results provide basis to integrated control pink rot after harvest.

Key words： Muskmelon; Pink rot; Trichothecium roseum; Biological characteristics; Host range

厚皮甜瓜是我國西北地區重要的瓜菜類經濟作物，因其果實采收季節溫度高以及冷鏈措施不完整極易造成采后爛損，給產業帶來嚴重經濟損失[1-2]。研究表明，粉紅單端孢（Trichothecium roseum）侵染引起的粉霉病為甜瓜果實采后主要病害[3-6]，該病菌侵染還有產生單端孢菌毒素的風險[7-8]，給鮮果及其加工品帶來安全隱患。因此，控制甜瓜果實粉霉病發生有利于當地產業發展。雖有研究報道了寄主為棗果實[9]和甜瓜果實[3]T. roseum的生物學特性，但通過營養因子和環境因子開展T. roseum的生物學特性及其寄主范圍的研究鮮見報道。筆者以前期鑒定的寧夏半干旱地區甜瓜粉霉病菌（T. roseum）為研究對象，研究培養基、碳源和氮源等營養條件以及溫度、pH值、光照與濕度等環境因素對該病菌生長的影響，同時測定該菌對玉金香甜瓜、富士蘋果、金冠蘋果、早酥梨、金橘、AC番茄和紅地球葡萄等7種不同水果的致病性，為明確甜瓜粉霉病菌生物學特性以及后期開展粉霉病防控技術研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗于2019年8—10月于北方民族大學植物性農產品貯藏與加工重點實驗室進行。

1.1.1 供試菌株 粉紅單端孢（T. roseum） LC-1701菌株由北方民族大學植物性農產品貯藏與加工重點實驗室分離并保存，于2019年8月取出活化備用[4]。

1.1.2 供試培養基 水瓊脂培養基（WA，瓊脂15 g）、馬鈴薯葡萄糖培養基（PDA，馬鈴薯：200 g;葡萄糖：20 g;瓊脂：15 g）、馬鈴薯蔗糖培養基（PSA，馬鈴薯：200 g;蔗糖：20 g;瓊脂：15 g）、200 g·L-1甜瓜果實煎汁培養基（CMF，甜瓜鮮果肉：200 g;瓊脂：15 g）、PDA+200 g·L-1甜瓜果實煎汁培養基（PDA+CMF）、査氏培養基（Czapeks，K2HPO4：1 g;KCl：0.5 g;MgSO4：0.5 g;FeSO4：0.01 g;NaNO3：3 g;蔗糖：30 g;瓊脂：15 g）、麥芽汁瓊脂培養基（MEA，麥芽糖：20 g;瓊脂：15 g），上述各培養基均分別用蒸餾水定容至1 L，備好后121 ℃濕熱滅菌20 min[10]。

1.1.3 供試寄主 玉金香甜瓜（Cucumis melo L. cv. ‘Yujinxiang）采購自寧夏中衛市興仁鎮甜瓜種植農田;富士蘋果（Malus domestica ‘Red Fuji）、金冠蘋果（Malus domestica ‘Golden Delicious）、早酥梨（Pyrus bretchneideri ‘Zaosu）、金橘（Fortunella margarita ‘Swingle）、紅地球葡萄（Vitis vinifera ‘Red Globe）和AC番茄（Solanum lycopersicum ‘Ailsa Craig）采購自寧夏銀川市西夏區同心路綜合市場。

1.2 方法

1.2.1 培養基類型對病原菌生長和產孢的影響 將8 mm的菌餅接種于WA、PDA、PSA、CMF、PDA+CMF、Czapeks和MEA 7種培養基平板中央，于黑暗條件28 ℃、90%RH恒溫培養5 d。采用十字交叉法用游標卡尺測定菌落直徑，血球計數板法測定孢子濃度[11]。每處理5次重復。

1.2.2 營養條件對病原菌生長和產孢的影響 以Czapeks培養基為基礎培養基，以等質量的葡萄糖、麥芽糖、乳糖、果糖、果膠、可溶性淀粉、甘油和甘露醇為碳源;以等質量的磷酸銨、硫酸銨、牛肉膏、氯化銨、甘氨酸、尿素、蛋白胨和酵母粉作為氮源;以不加碳源、氮源為對照[12]。其余方法同1.2.1。

1.2.3 環境條件對病原菌生長、產孢和孢子萌發的影響 使用PDA培養基測定不同溫度（4、10、16、22、28、34、40 ℃于pH 7.0、黑暗培養）、pH（3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0于28 ℃、黑暗培養）和光照（連續光照、12 h光暗交替、連續黑暗于pH 7.0、28 ℃培養）[13]等環境條件對菌落生長和產孢的影響，菌絲生長及產孢方法同1.2.1。將WA培養基中接入100 μL 1×106個·mL-1孢子，放置于不同培養條件中培養4 h后，鏡檢孢子萌發情況并根據公式計算孢子萌發率，每處理5個視野，每視野200個孢子[14]。

孢子萌發率/%=（萌發孢子數/觀察孢子總數）×100。

1.2.4 相對濕度對病原菌孢子萌發的影響 利用不同的飽和鹽溶液將相對濕度分別設置為23%RH（CH3COOK）、33%RH（MgCl2）、43%RH（K2CO3）、53%RH（Mg（NO3）2）、65%RH（CoCl2）、75%RH（NaCl）、84%RH（KCl）、93%RH（KNO3）[7]。取濃度為1×106個·mL-1的分生孢子懸浮液20 μL，涂布在15 g·L-1瓊脂載玻片上，放置于上述不同相對濕度的密閉黑暗環境中28 ℃培養12 h，測定孢子萌發情況[15]，同1.2.3。

1.2.5 病原菌寄主范圍測定 參考郝曉娟等[16]方法，采用損傷接種來對病菌致病性進行測定。取大小和成熟度一致的玉金香甜瓜、富士蘋果、金冠蘋果、早酥梨、金橘、紅地球葡萄及AC番茄果實，用75%酒精表面消毒。無菌環境下于赤道部位均勻打4個3 mm深的接種點，靜置20 min后接種10 μL 1×106個·mL-1孢子懸浮液，以無菌水作對照。接種后果實密封于保鮮盒中，25 ℃ 60%～70%RH培養，統計發病率并測定菌落直徑，每處理5個果實，3次重復。

1.3 數據分析

試驗數據利用SPSS 19.0軟件進行統計分析，利用單因素方差分析比較差異顯著性，用Excel 2016制作圖表。

2 結果與分析

2.1 不同培養基對菌絲生長和產孢的影響

由表1可知，甜瓜粉霉病菌在不同供試培養基上均可生長，其中，病原菌在PDA、PDA+CMF和PSA培養基上生長最快，菌落直徑均在71.00 mm以上;病原菌在CMF培養基中生長較好，在Czapeks和MEA培養基中生長較差;病原菌在WA培養基上生長最差，菌落直徑僅為9.88 mm。病原菌在PDA培養基中產孢量最高，為231.67×106個·mL-1;WA、CMF、Czapeks和MEA培養基產孢量最低。因此，PDA、PDA+CMF和PSA培養基有利于甜瓜粉霉病菌菌絲生長，而PDA培養基更利于該菌產孢。

2.2 碳、氮源對菌絲生長和產孢的影響

甜瓜粉霉病菌能在各種碳、氮源上生長，但不同碳、氮源之間生長存在差異（表2）。其病原菌在果膠為碳源上生長最好，菌落直徑為57.29 mm;以葡萄糖和麥芽糖為碳源時菌絲生長較好，菌落直徑均在22.00 mm以上;以果糖、淀粉、甘油和甘露醇為碳源時菌絲生長較為緩慢;以蔗糖和乳糖為碳源時菌絲生長較差，菌落直徑均在14.00 mm以下。病原菌在果膠中產孢量最大，為98.00×106個·mL-1;在其余實驗用碳源中產孢量均低于14.00×106個·mL-1。由此可知，果膠作為碳源時最利于病原菌的菌絲生長和產孢。當氮源為甘氨酸和牛肉膏時病原菌菌絲生長最好，菌落直徑均在53.50 mm以上;以硫酸銨、氯化銨、尿素和蛋白胨為氮源時菌絲生長較好，菌落直徑在25.00～43.00 mm之間;以硝酸鈉、磷酸銨和酵母粉為氮源時菌絲生長最差，菌落直徑均低于19.00 mm。病原菌在牛肉膏為氮源時產孢量最多，為93.75×106個·mL-1;甘氨酸和蛋白胨為氮源時產孢量較多，在34.00～59.00×106個·mL-1之間;以硝酸鈉、磷酸銨、硫酸銨、尿素、氯化銨和酵母粉為氮源時產孢量最少，僅為2.00×106～11.00×106個·mL-1。因此，甘氨酸和牛肉膏為氮源時有利于病原菌菌絲生長，牛肉膏為氮源時有利于該菌產孢。

2.3 溫度對病原菌的菌絲生長、產孢及分生孢子萌發的影響

由圖1可知，病原菌對溫度的適應范圍較廣，菌絲在4～40 ℃內均可生長與產孢。在4～28 ℃內菌絲生長速度及產孢量隨溫度升高逐漸升高;28～40 ℃內菌絲生長速度與產孢量隨溫度升高逐漸降低。菌絲最適生長溫度為28 ℃，菌落直徑為68.14 mm，最適產孢溫度為22～28 ℃，產孢量均高于205.00×106個·mL-1，溫度低于4 ℃或高于40 ℃菌絲生長和產孢受到嚴重抑制。病原菌孢子在4～40 ℃內均可萌發，孢子萌發率在4～28 ℃內隨溫度的升高而升高，而在28～40 ℃內隨溫度的升高而下降，最適孢子萌發溫度為28 ℃，孢子萌發率達82.67%。

2.4 pH對病原菌的菌絲生長、產孢及分生孢子萌發的影響

病原菌對酸堿適應范圍較廣，pH為3.0～11.0之間病原菌均可生長和產孢，且孢子可以萌發（圖2）。菌絲生長、產孢量和孢子萌發率在pH為3.0～7.0內均隨pH的升高逐漸升高，而在pH為7.0～11.0內隨pH的升高逐漸下降。最適宜菌絲生長的pH為5.0～9.0，菌落直徑均在34.00～44.00 mm之間;最適宜病原菌產孢和孢子萌發的pH為7.0，產孢量和孢子萌發率分別為174.17×106個·mL-1和98.23%。

2.5 光照條件對病原菌的菌絲生長、產孢及分生孢子萌發的影響

不同光照處理對甜瓜粉霉病菌菌絲生長、產孢和孢子萌發的影響如圖3所示。全黑暗條件下培養有利于菌絲生長和分生孢子萌發，此時菌落直徑和孢子萌發率分別為76.15 mm和84.08%;全黑暗和光暗交替條件下培養有利于病原菌產孢，產孢量均在240.00×106個·mL-1以上。

2.6 相對濕度對病原菌孢子萌發的影響

不同濕度對病原菌孢子萌發具有一定的影響（圖4）。在23%～93%RH之內，濕度越大越有利于病原菌的孢子萌發。當低于53%RH時，分生孢子萌發率小于12.00%;高于73%RH時孢子萌發率大于65.00%。當相對濕度為93%RH時，孢子萌發率達到最大值90.95%。

2.7 病原菌寄主范圍測定

甜瓜粉霉病菌可以侵染玉金香甜瓜、早酥梨、富士蘋果、金冠蘋果以及AC番茄，不能侵染金橘和紅地球葡萄（圖5-A）。接種甜瓜粉霉病菌，早酥梨和富士蘋果3 d時開始發病，玉金香甜瓜和金冠蘋果5 d時開始發病，AC番茄6 d時開始發病。接種后6 d時，玉金香甜瓜、早酥梨和富士蘋果產生典型的粉霉病癥狀，其中玉金香甜瓜病斑直徑最大為（34.23±0.69）mm，早酥梨病斑直徑較大為（9.89±1.30）mm，富士蘋果較大為（5.08±0.27）mm，金冠蘋果較小為（3.03±1.33）mm，AC番茄最小為（1.38±0.97）mm（圖5-B）。病菌對玉金香甜瓜致病力最強，對AC番茄致病力最弱。接種后6 d，金橘的接種部位未見任何癥狀，而紅地球葡萄接種點雖有發黑現象，但果實未見壞死腐爛，更未見粉紅色菌絲霉層，對發黑組織進行再分離，未分離到粉霉病菌，徑剖檢發現接種部位果肉完好。

3 討論與結論

由生物學特性研究結果可知，甜瓜粉霉病菌在PDA和PDA+CFA上生長最快;在溫度為28 ℃、pH 5.0～9.0和全黑暗條件下最適菌絲生長;在22～28 ℃、pH 7.0、全黑暗和光暗交替條件下最適產孢;在28 ℃、pH 7.0、全黑暗的高濕環境條件下最適宜孢子萌發。這與張忠明[3]等的研究結果一致，而與何石蘭等[17]與王勇等[18]結果略有差異，可能是由于不同地理環境和不同宿主上的T. roseum的生物學特性存在差異所致。研究結果還表明，果膠為病菌菌絲生長和產孢的最適碳源，因此生長及采后環節中應當避免各種損傷造成的細胞壁果膠成分暴露;病原菌在硝酸鈉和磷酸銨氮源上生長較差，因此果實生長期間可優選硝酸鈉和磷酸銨作為肥料。

寄主范圍測定結果顯示，甜瓜粉霉病菌對玉金香甜瓜、早酥梨、金冠和富士蘋果、AC番茄、金橘和紅地球葡萄等果實致病力不同，這可能與接種時果實pH環境的差異有關。Prusky等[19]根據病原菌調控適宜自身侵染酸堿環境的能力可分為堿化菌和酸化菌，王振宇等[20]研究發現，甜瓜粉霉病病菌屬于堿化菌，可以解釋試驗中T. roseum對金冠蘋果（pH 3.74±0.01）、富士蘋果（pH 3.89±0.02）、早酥梨（pH 4.59±0.00）和玉金香甜瓜（pH 4.93±0.46）4種水果侵染能力增加的原因。金橘的pH為2.54±0.003，經損傷接種后并未發病，與本試驗中測得的該菌pH低于3.0時無法生長的結果相一致。AC番茄（pH 4.5±0.003）與紅地球葡萄（pH 4.13±0.002）的pH值相近，且均在適宜T. roseum生長的pH范圍內，然而損傷接種后AC番茄發病而紅地球葡萄未發病，這表明除了酸堿環境影響病原菌的致病力外，還可能存在其他致病機制及其影響因素，但這些復雜的互作機制有待進一步深入研究。

甜瓜粉霉病菌體外培養適宜在高溫高濕、pH 7.0和全黑暗條件下生長、產孢和孢子萌發，適當降低甜瓜的貯藏溫度和濕度可以減少甜瓜貯藏期間病害的發生。當果膠為碳源時病菌生長最好，應減少甜瓜果實的機械損傷。病菌可侵染玉金香甜瓜、早酥梨、金冠蘋果、富士蘋果和AC番茄，因此果實貯藏期間應采取措施避免污染。

參考文獻

[1] WANG J J，BI Y，ZHANG Z K，et al.Reduction of latent infection and enhancement of disease resistance in muskmelon by preharvest application of harpin[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，2011，59（23）：12527-12533.

[2] WANG J J，BI Y，WANG Y，et al.Multiple preharvest treatments with harpin reduce postharvest disease and maintain quality in muskmelon fruit（cv.Huanghemi）[J].Phytoparasitica，2014，42（2）：155-163.

[3] 張忠明，畢陽.粉紅聚端孢菌的生物學特性研究[J].甘肅農業大學學報，2006，41（4）：86-90.

[4] 范春霞，王軍節，彭期定，等.甜瓜粉霉病病原菌鑒定及三種藥物對病原菌的體外抑制作用[J].食品工業科技，2019，40（13）：78-83.

[5] 王鵬，王軍節，李貞彪.適用于蛋白質組分析的粉紅單端孢菌蛋白提取方法的建立[J].華北農學報，2019，34（3）：209-216.

[6] 范春霞，王軍節，趙魯迺克，等.甜瓜粉霉病菌效應蛋白編碼基因的預測與分析[J].植物病理學報，2020，50（5）：549-558.

[7] 魏晉梅，周圍，畢陽.粉紅單端孢體外產毒條件的探討及粗毒素活性測定[J].食品工業科技，2007，28（5）：110-112.

[8] XUE H L，BI Y，TANG Y，et al.Influence of storage temperature and cultivars on T-2 toxin and neosolaniol accumulation in apples inoculated with Trichothecium roseum[J].Journal of Food Processing and Preservation，2017，42（2）：1-7.

[9] 殷輝，周建波，常芳娟，等.棗果貯藏期紅粉病菌鑒定及環境因子對其分生孢子萌發的影響[J].植物病理學報，2018，48（1）：16-24.

[10] 陳全助，金亞杰，郭朦朦，等.閩楠葉斑病病原鑒定及其生物學特性測定[J].植物病理學報，2018，48（3）：313-323.

[11] 周潔，郭鳳領，符家平，等.明日葉葉斑病病原菌的生物學特性及室內藥效試驗[J].中國瓜菜，2019，32（12）：64-67.

[12] 康萍芝，白小軍，張麗榮，等.尖孢鐮刀菌黃瓜專化型生物學特性研究[J].北方園藝，2018（22）：65-69.

[13] 張麗，潘龍其，王生榮，等.苜蓿莖點霉葉斑病病原鑒定及生物學特性研究[J].中國農業大學學報，2015，20（4）：158-166.

[14] 陳南泉，林河通，陳藝暉，等.橄欖小孢擬盤多毛孢（Pestalotiopsis microspora）的生物學特性研究[J].保鮮與加工，2016，16（3）：5-10.

[15] 李金峰，劉佳，侯敏，等.美洲南瓜枯萎病菌分離鑒定及其生物學特性[J].中國瓜菜，2020，33（3）：23-28.

[16] 郝曉娟，高瑩，李新鳳，等.歐李褐腐病病原菌生物學特性及其寄主范圍[J].果樹學報，2014，31（1）：101-104.

[17] 何石蘭，劉增亮，劉曉妹，等.粉紅聚端孢引起的杧果新病害研究[J].果樹學報，2011，28（3）：474-478.

[18] 王勇，王萬立，劉春艷，等.AC番茄紅粉病致病病原的鑒定及其培養特性研究[J].華北農學報，2008，23（6）：97-100.

[19] PRUSKY D，BARAD A S，MENT D，et al.The pH modulation by fungal secreted molecules：a mechanism affecting pathogenicity by postharvest pathogens[J].Israel Journal of Plant Sciences，2016，63（1）：1-9.

[20] 王振宇，胡慧敏，龔迪，等.Trichothecium roseum的酸堿屬性及pH值對其胞外酶活性和致病性的影響[J].食品科學，2019，40（22）：161-166.