基于HPLC 指紋圖譜與多元化統(tǒng)計(jì)法的黃芩質(zhì)量評(píng)價(jià)研究

連赟芳

（1.漳州片仔癀藥業(yè)股份有限公司，福建 漳州 363000；2.福建省片仔癀天然醫(yī)藥研發(fā)企業(yè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 漳州 363000）

黃芩為唇形科植物黃芩的干燥根，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎的功效，是中醫(yī)臨床常用清熱藥之一［1］。 黃芩具有多種化學(xué)成分，主要為黃酮類、甾體類、揮發(fā)油及多種微量元素［2］。 現(xiàn)代研究表明：黃芩中黃酮類的成分黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素具有抗癌、抗氧化等藥理作用［3-6］。 中藥指紋圖譜能全面反映中藥所含內(nèi)在化學(xué)成分的種類與數(shù)量，進(jìn)而有效表征中藥的質(zhì)量及穩(wěn)定性［7］，同時(shí)結(jié)合多元化統(tǒng)計(jì)法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，已成為國(guó)際公認(rèn)的控制中藥質(zhì)量的有效手段之一［8］。 本研究通過(guò)收集30批黃芩樣品，建立HPLC 指紋圖譜，同時(shí)結(jié)合相似度評(píng)價(jià)、聚類分析、主成分分析（PCA）和偏最小二乘-判別分析（OPLS-DA），進(jìn)行多產(chǎn)地、多批次黃芩的質(zhì)量評(píng)價(jià)，為黃芩中藥資源、利用及質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

Waters Arc 高效液相色譜儀（美國(guó)Waters 公司）；Waters 2998 光電二極管陣列檢測(cè)器；Empower 3（2998）色譜工作站；METTLERAE XS-205DR 十萬(wàn)分之一電子天平、METTLERAE XPE504 萬(wàn)分之一電子天平［梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司］；KQ 500DE 型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

對(duì)照品黃芩苷（批號(hào)：110715-201821，純度：95.4%）、黃芩素（批號(hào)：111595-201808，純度：97.9%）、漢黃芩素（批號(hào)：111514-201706，供鑒別使用）均購(gòu)自中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇為色譜純（美國(guó)Merck 公司）；水為超純水；磷酸為分析純。

黃芩樣品來(lái)源見(jiàn)表1。

表1 黃芩樣品來(lái)源

2 方法與結(jié)果

2.1 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對(duì)照品各約10.0 mg，分別置100 mL 量瓶，加70%乙醇適量溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為0.1 mg／mL 黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素對(duì)照品儲(chǔ)備液。 分別精密量取黃芩苷對(duì)照品儲(chǔ)備液、黃芩素對(duì)照品儲(chǔ)備液、漢黃芩素對(duì)照品儲(chǔ)備液各5 mL至100 mL 量瓶，加70%乙醇適量溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液。

2.2 供試品溶液的制備 取黃芩樣品粉末約0.3 g，精密稱定，置250 mL 具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇50 mL，稱定重量，超聲提取30 min，取出，放冷，再稱定重量，用70%乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 采用Waters Arc高效液相色譜儀，色譜柱GL Sciences Inertsil ODS-3 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相為甲醇（A）-0.2%磷酸（B）。 梯度洗脫程序：0～10 min，35%～45%（A）；10～15 min，45%～70%（A）；15～40 min，70%（A）；40～45 min，70%～35%（A）；柱溫為20 ℃；流速為1.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)為280 nm。 分別精密量取混合對(duì)照品溶液、供試品溶液5 μL，注入高效液相色譜儀，測(cè)定，即得。

2.4 特征圖譜方法學(xué)考察

2.4.1 色譜柱及參照物峰的選擇及專屬性考察 分別精密吸取供試品溶液5 μL，注入液相色譜儀，記錄60 min 色譜圖，考察色譜柱GL Sciences Inertsil ODS-3 C18、PX-C18、Waters SunFireTM C18、Ultimate XB-C18 及Thermo BDS HYPERSIL C18 5 個(gè)廠家的色譜柱，分析測(cè)定同一供試品。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：PX-C18、Ultimate XB-C18 分 析 柱 保 留 時(shí) 間 延后，Thermo BDS HYPERSIL C18 柱的分離效果不夠穩(wěn)定，故選擇GL Sciences Inertsil ODS-3 C18 色譜柱。

采用GL Sciences Inertsil ODS-3 C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），記錄60 min 色譜圖，黃芩苷色譜峰在供試品色譜圖上保留時(shí)間適中，且黃芩苷又是黃芩含量測(cè)定指標(biāo)性成分，色譜峰面積最大，與相鄰峰分離良好，故選擇黃芩苷為參照物峰（S），按黃芩苷峰計(jì)理論塔板數(shù)應(yīng)＞2 500。

分別考察混合對(duì)照品溶液色譜圖、供試品溶液運(yùn)行60 min 及120 min 色譜圖，結(jié)果顯示各組分在60 min 內(nèi)均流出色譜柱，故確定樣品的運(yùn)行時(shí)間為60 min。 結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 混合對(duì)照品溶液和供試品溶液高效液相色譜圖

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6 次，計(jì)算各共有峰的相對(duì)保留時(shí)間（RRT）和峰面積比值（PAR）。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：各供試品溶液色譜峰RRT 的RSD＜0.1%，PAR 的RSD＜1.1%，符合規(guī)定。

2.4.3 重復(fù)性試驗(yàn) 分別取同一批樣品6 份（編號(hào)S13），按“2.2”和“2.3”項(xiàng)下同法操作，進(jìn)樣，計(jì)算各共有峰的RRT 和PAR。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：各供試品溶液色譜峰RRT 的RSD＜0.1%，PAR 的RSD＜1.2%，符合規(guī)定。

2.4.4 穩(wěn)定性考察 分別取同一供試品溶液，室溫下保存，分別于0、2、4、6、8、12、14、16 h 處測(cè)定，計(jì)算各共有峰的RRT 和PAR。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：各供試品溶液色譜峰RRT 的RSD＜0.2%，PAR 的RSD＜1.2%，符合規(guī)定。

2.5 30 批黃芩指紋圖譜的建立 按照“2.2”和“2.3”項(xiàng)下同法操作，將30 批黃芩樣品HPLC 數(shù)據(jù)以AIA 格式導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)軟件（2012 版）”，以編號(hào)S13 樣品作為參照?qǐng)D譜，采用中位數(shù)法，時(shí)間窗寬度為0.5，經(jīng)過(guò)多點(diǎn)校正-峰匹配，生成30 批黃芩樣品指紋圖譜疊加圖及對(duì)照指紋圖譜，見(jiàn)圖2。

圖2 30 批黃芩樣品指紋圖譜的疊加圖及對(duì)照指紋圖譜

2.6 相似度評(píng)價(jià) 分析評(píng)價(jià)30 批黃芩樣品指紋圖譜各批間以及各批與對(duì)照指紋圖譜的相似度。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：30 批黃芩樣品的相似度均大于0.990，符合指紋圖譜建立要求（0.900～1.000）。 主要共有峰面積比值范圍為1∶2∶3∶4∶5∶6∶7∶8∶9∶10∶11＝（0.005 8～0.029 8）∶（0.025 5～0.037 7）∶（0.018 1～0.034 1）∶（0.019 8～0.056 0）∶（1.000 0）∶（0.057 7～0.089 3）∶（0.058 4～0.096 7）∶（0.188 0～0.236 4）∶（0.029 4～0.247 7）∶（0.012 5～0.103 4）∶（0.003 1～0.038 5）。結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 30 批黃芩樣品相似度結(jié)果

2.7 共有峰的分析及歸屬 分析30 批黃芩樣品指紋圖譜，確定1～11 號(hào)為共有峰，共有峰保留時(shí)間（峰號(hào)）分別約為8.998 min（1）、13.736 min（2）、15.468 min（3）、18.146 min（4）、18.562 min（5）、19.584 min（6）、20.045 min（7）、20.418 min（8）、23.124 min（9）、28.395 min（10）、30.795 min（11）。其中，5 號(hào)峰為黃芩苷，9 號(hào)峰為黃芩素，10 號(hào)峰為漢黃芩素；相對(duì)保留時(shí)間（峰號(hào)）分別約為0.485（1）、0.740（2）、0.833（3）、0.977（4）、1.000（5）、1.055（6）、1.080（7）、1.100（8）、1.244（9）、1.527（10），1.656（11），其中5 號(hào)峰為參照峰S 峰。 以S 峰的保留時(shí)間和峰面積為基準(zhǔn)，計(jì)算各共有峰的RRT 和PAR。

比較參照物色譜圖、各批供試品色譜圖，確定黃芩供試品色譜圖的主要物質(zhì)群特征峰及其歸屬，指紋圖譜中5、9 和10 號(hào)峰為黃芩苷、黃芩素和漢黃芩素。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：共有峰總面積占總峰面積97.36%，非共有峰面積占總峰面積2.64%，均符合指紋圖譜規(guī)定。 結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 黃芩樣品指紋圖譜成分峰歸屬分析

2.8 聚類分析 運(yùn)用Minitab 20 軟件，以30 批黃芩樣品指紋圖譜中11 個(gè)共有峰的峰面積為變量，選擇最長(zhǎng)距離聯(lián)結(jié)法，距離度量為Euclidean，進(jìn)行觀測(cè)值聚類。30 批黃芩樣品被聚為4 類。 樣品編號(hào)S24 聚為一類，樣品編號(hào)S1、S4～S5、S8～S9、S14、S26 聚為一類，樣品編號(hào)S2、S12、S28～S30、S23 為一類，其余樣品編號(hào)聚為一類。 說(shuō)明不同產(chǎn)地的黃芩藥材存在一定的差異。

2.9 基于PCA 的差異模型建立 采用Minitab 20 軟件，以11 個(gè)共有峰峰面積為變量，對(duì)30 批黃芩樣品進(jìn)行PCA，選擇相關(guān)矩陣類型，計(jì)算主成分特征值及累計(jì)貢獻(xiàn)率。 結(jié)果表明特征值＞1 的主成分有3 個(gè)，且累計(jì)貢獻(xiàn)率為85.9%，建立的指紋圖譜基本能客觀反映30 批黃芩的樣本信息。

2.10 基于OPLS－DA 模型建立 以30 批黃芩樣品HPLC 指紋圖譜的11 個(gè)共有峰峰面積為變量，導(dǎo)入SIMCA-P 14.1 分析軟件，啟動(dòng)OPLS-DA 分析程序，VIP 值＞1 的化合物對(duì)模型的貢獻(xiàn)度較大。 經(jīng)分析篩選不同批次黃芩樣品質(zhì)量差異的5 個(gè)峰，其影響程度依次為10 號(hào)峰（漢黃芩素）＞9 號(hào)峰（黃芩素）＞2 號(hào)峰＞4 號(hào)峰＞11 號(hào)峰，上述5 個(gè)峰可能是導(dǎo)致不同批次樣品之間產(chǎn)生差異的主要原因。

3 討 論

3.1 前期供試品溶液制備過(guò)程中，比較《中華人民共和國(guó)藥典》（2020 年版）黃芩藥材含量測(cè)定項(xiàng)供試品溶液制備，發(fā)現(xiàn)兩種制備方法對(duì)化學(xué)成分的提取影響不大，考慮操作方便，故選擇70%乙醇超聲提取30 min制備供試品溶液。

3.2 實(shí)驗(yàn)分別比較了不同比例的流動(dòng)相，如甲醇-0.1%磷酸溶液、甲醇-0.2%冰醋酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液等，結(jié)果甲醇-0.2%磷酸溶液梯度洗脫各色譜峰達(dá)到完全分離、基線平穩(wěn)、峰形穩(wěn)定，故選擇甲醇-0.2%磷酸溶液梯度洗脫為流動(dòng)相。

3.3 通過(guò)相似度評(píng)價(jià)獲得30 批黃芩樣品指紋圖譜相似度均大于0.990，表明該30 批黃芩樣品具有相似的化學(xué)成分，存在較高一致性；通過(guò)聚類分析30 批黃芩樣品聚為4 類，表明不同產(chǎn)地黃芩藥材存在一定的差異；PCA 結(jié)果顯示特征值＞1 的3 個(gè)主成分能基本反映30 批樣品信息；OPLS-DA 結(jié)果顯示影響黃芩質(zhì)量的因素，主要為黃芩素、漢黃芩素、2 號(hào)峰、4 號(hào)峰和11 號(hào)峰，不包括《中華人民共和國(guó)藥典》規(guī)定含量測(cè)定成分黃芩苷，說(shuō)明不同批次、不同產(chǎn)地黃芩所含黃芩苷含量差異不大，提示采用單一成分定量無(wú)法真實(shí)評(píng)判黃芩質(zhì)量?jī)?yōu)劣。

3.4 本研究以30 批黃芩樣品作為研究對(duì)象，建立HPLC 指紋圖譜，精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性試驗(yàn)中RRT 和PAR 的RSD 小于3.0%，均符合要求。 同時(shí)結(jié)合相似度評(píng)價(jià)、PCA、聚類分析、OPLS-DA 綜合評(píng)價(jià)多批次黃芩樣品的整體質(zhì)量，為中醫(yī)臨床用藥選擇、黃芩質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高及黃芩相關(guān)制劑質(zhì)量研究提供依據(jù)。