牛蒡根提取物抗肺癌活性部位篩選

苗 航，張瑜倪，劉冬雪，郭素華，林珠燦

（福建中醫藥大學藥學院，福建 福州 350122）

牛蒡根為菊科牛蒡屬植物牛蒡（Arctium lappa L）的根，又名東洋參，為藥食兩用性植物，其味辛、苦，性寒，歸肺、胃經，具有清熱解毒、疏散風熱、宣肺祛痰、利咽透疹之功，主治外感風熱、咳嗽氣喘、咽喉腫痛等癥［1］。 該植物在山東、江蘇、河南、福建、臺灣等地均有分布，尤其在福建省有豐富的生藥資源及良好的用藥基礎。 據記載，牛蒡根中主要含有氨基酸類、糖類、多酚類（咖啡酸、綠原酸等）、黃酮類、炔類和揮發油類等活性成分［2］。 現代藥理研究顯示：牛蒡根具有抗菌、抗突變、抗腫瘤、抗氧化、抗疲勞、降血糖、降血脂和免疫調節等活性［3］。 但是目前關于牛蒡根提取物抗腫瘤活性部位的研究尚未見報道，這極大地限制了牛蒡根藥用價值的深入開發與臨床應用。 故本實驗以IC50值為評價指標，篩選牛蒡根抗腫瘤活性部位，并以肺癌A549 細胞構建皮下移植瘤裸鼠模型，通過測定腫瘤體積、瘤體質量等進一步觀察牛蒡根活性部位抗肺癌的作用，以期為牛蒡根防治腫瘤的臨床應用及產品研發提供實驗數據支撐。

1 實驗材料

1.1 實驗細胞 肺癌A549 細胞均購自漢普諾賽生命科技有限公司。

1.2 實驗動物 30 只清潔級雄性昆明小鼠，體質量（20±2）g，35 只雄性BALB／c 裸鼠，體質量（20±2）g，均購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：SCXK（滬）2017-0005，在福建中醫藥大學醫學實驗動物中心SPF 級實驗室飼養1 周后開始試驗，合格證號：SYXK（閩）2019-0007。

1.3 實驗藥材 牛蒡根產自臺灣省臺南縣永康市（福建康力得力食品有限公司，批號：20190718），經福建中醫藥大學藥學院中藥資源與開發教研室車蘇容老師鑒定為菊科植物牛蒡根制成的干燥茶絲。

1.4 實驗試劑 RPMI 1640 培養基（美國HyClone公司）；噻唑藍（MTT，美國Amresco 公司，批號：0793）；順鉑（ 上海源葉生物技術有限公司， 批號：B1210L79601）；石油醚（批號：F20150712）、正丁醇（批號：20150706）、三氯甲烷（批號：20170904）均購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.5 實驗儀器 恒溫CO2培養箱（瑞軒電子科技上海有限公司，型號：Galaxy 170R）；多功能酶標儀（奧地利Tecan 公司，型號：Infinite200 PRO）；－80 ℃超低溫冰箱（美國Thermo Fisher 公司，型號：HFU586）；高壓蒸汽滅菌鍋（上海博訊實業醫療設備有限公司，型號：YXQ-LS-75SIII）。

2 實驗方法

2.1 實驗藥物 制備稱取牛蒡根茶絲250 g，按照料液比1∶6，加入1 500 mL 石油醚（沸點為30～60 ℃），浸泡過夜，60 ℃水浴加熱回流提取2 次，每次2 h；合并提取液，過濾，低溫減壓回收溶劑至干，得石油醚部位。 提取后所剩藥渣再加入乙酸乙酯溶液，制備方法同石油醚部位，得乙酸乙酯部位。 收集經石油醚及乙酸乙酯提取后的藥渣，加入8 倍量的水，100 ℃煎煮提取2 次，每次90 min；合并煎煮液，減壓過濾后濃縮至原提取液體積的1／5，用玻璃棒邊攪拌邊緩慢加入95%乙醇，用酒精計測定含醇量達70%后保鮮膜封口，將其置于4 ℃冰箱靜置12 h；取出后以4 000 r／min 離心10 min，棄上清，將沉淀物放置60 ℃烘箱中干燥，即得含有多糖成分的粗提物；將所得粗提物加蒸餾水溶解制成濃度為50 mg／mL 粗提液，加入粗提液總量1／3 體積的sevage 溶液（三氯甲烷∶正丁醇＝4∶1）充分震蕩后用分液漏斗分離，共萃取8 次，上清液凍干后即為多糖。

2.2 肺癌A549 細胞體外增殖檢測 取對數生長期的肺癌A549 細胞，用完全培養基將細胞配成適宜濃度的單細胞懸液，調整細胞數1×105個／mL 反復吹打均勻后，以100 μL／孔的體積沿96 孔板孔壁加入，將孔板置于37 ℃、5% CO2條件下的培養箱中進行培養。 待各孔中細胞完全貼壁后給藥，設置對照組、順鉑組、石油醚部位組、乙酸乙酯部位組、多糖組。 順鉑組濃度為1、5、10、20、40 μg／mL，石油醚部位組、乙酸乙酯部位組、多糖組濃度為50、200、400、600、800 μg／mL，每個濃度設5 個復孔，每孔150 μL，繼續在37 ℃、5% CO2條件下分別培養24、48、72 h 后，吸棄培養基，每孔加入5 mg／mL MTT溶液10 μL，置于培養箱內再孵育4 h，終止培養，加入100 μL／孔DMSO 溶液以溶解結晶紫晶體，在490 nm 處用酶標儀測定每孔的OD 值。重復試驗3 次，取其均值計算細胞抑制率，并使用SPSS 25.0軟件計算半數抑制濃度IC50值。

2.2.1 牛蒡根各提取部位對肺癌A549 細胞增殖抑制的作用 MTT 法檢測不同濃度的牛蒡根提取物在24、48、72 h 的作用時間下對肺癌A549 細胞增殖抑制作用的影響。 由圖1 可知：石油醚部位對A549細胞表現出明顯的增殖抑制作用。 石油醚部位濃度在0～600 μg／mL 時，對肺癌A549 細胞的增殖抑制作用隨著時間和濃度的增加而逐步增強，具有時間和劑量依賴性；當石油醚部位濃度大于600 μg／mL時，其抑制率趨于平緩甚至下降。 此外，當石油醚部位濃度為600～800 μg／mL 時，其24、48、72 h 抑制率均大于80%。

圖1 不同濃度及牛蒡根提取部位對A549 細胞的抑制率比較

2.2.2 各組對肺癌A549 細胞不同作用時間點的IC50值比較 通過SPSS 25.0 軟件計算IC50值可知：牛蒡根各提取部位中僅石油醚部位對肺癌A549 細胞表現出明顯的抗腫瘤活性，陽性藥順鉑各時間點的IC50值均顯著低于石油醚部位。 結果見表1。

表1 4 組對肺癌A549 細胞不同作用時間點IC50 值比較 μg／mL

2.3 石油醚部位的初步毒性考察 將30 只昆明小鼠隨機分為6 組，每組5 只，分別標記為A、B、C、D、E、F 組，A 組為陰性對照組，每天灌胃蒸餾水；B、C、D、E、F 組分別以石油醚部位200、400、800、1 600、3 200 mg／kg 灌胃，每日1 次，連續給藥7 d。給藥結束后觀察小鼠的狀況與體質量變化并記錄。

2.4 A549 肺癌移植瘤裸鼠模型建立及給藥 收集狀態良好處于對數生長期的肺癌A549 細胞，用胰蛋白酶消化后制成細胞母液，然后用PBS 稀釋成濃度為1.5×107個／mL 單細胞懸液，立刻置于冰上，備用。 用酒精棉球擦拭注射部位，吸取0.2 mL 密度均勻的A549 單細胞懸液緩慢接種在每只裸鼠的右腋皮下，每只裸鼠接種3×106個細胞。 將35 只裸鼠隨機分為空白組、模型組、陽性藥組、低劑量組和高劑量組，每組7 只，接種第2 天開始給藥。 陽性藥組每只以0.2 mL 腹腔注射3 mg／kg 順鉑；空白組、模型組以蒸餾水灌胃；低劑量組、高劑量組分別以牛蒡根石油醚部位400、1 600 mg／kg 灌胃，每日1 次，連續給藥15 d。

2.5 檢測指標

2.5.1 記錄鼠體質量和腫瘤體積 從給藥當天算起，定期（隔天）稱量裸鼠體質量并計算鼠體質量變化。 在所有裸鼠腫瘤長出后用游標卡尺測量腫瘤的長徑（A）和短徑（B），做好記錄并計算瘤體積。

2.5.2 記錄腫瘤質量和臟器指數 給藥結束后，完整剝離腋窩皮下實體瘤，稱取腫瘤質量，根據各組平均瘤質量（M）計算抑瘤率。 同時摘取脾臟、肝臟、腎臟和肺臟并稱重，計算臟器指數。

3 實驗結果

3.1 石油醚部位初步毒性考察 由表2 和表3 中結果可知：當給藥量為1 600 mg／kg 時，小鼠出現干嘔、撓鼻等反應，但很快恢復；當給藥量增至3 200 mg／kg時，小鼠出現炸毛、雙腳無力、流淚等不良反應，且恢復時間增至5 h，期間無小鼠死亡。石油醚部位各濃度組和蒸餾水組體質量均呈現逐漸增長趨勢，其體質量變化與蒸餾水組比較無統計學意義（P＞0.05），說明石油醚部位對小鼠無明顯毒性。 考慮到牛蒡根為藥食同源性植物，為確保其藥效，我們選擇小鼠反應不太明顯且很快恢復狀態的劑量1 600 mg／kg作為后續實驗的高濃度給藥劑量，400 mg／kg 作為低濃度給藥劑量。

表2 給藥后小鼠一般狀況比較

表3 不同給藥劑量小鼠體質量變化比較（±s）g

表3 不同給藥劑量小鼠體質量變化比較（±s）g

組別A 組B 組C 組D 組E 組F 組n555555給藥劑量／（mg／kg）0 200 400 800 1 600 3 200初始體質量25.0±1.58 25.8±0.84 26.6±0.89 27.0±1.00 26.2±1.10 26.2±1.30 7 d 后體質量27.0±1.87 28.0±1.41 28.4±1.14 28.0±2.92 27.8±2.28 27.4±2.70體質量變化2.0±0.71 2.2±1.30 1.8±1.30 1.0±2.00 1.6±1.34 1.2±2.28

3.2 石油醚部位對移植瘤裸鼠體質量及臟器指數的影響 裸鼠在給藥7 d 后均長出瘤體，實驗期間移植瘤裸鼠未發現死亡。 由表4 可知：正常組、模型組、低劑量和高劑量組裸鼠體質量均出現不同程度的增長；與正常組和模型組比較，陽性藥組裸鼠體質量變化和脾臟指數明顯降低（P＜0.01），而其余實驗組差異不明顯（P 均＞0.05），這可能與陽性藥對小鼠有較強毒副作用有關。

表4 各組裸鼠體質量變化及脾臟指數比較（±s）mg／g

表4 各組裸鼠體質量變化及脾臟指數比較（±s）mg／g

注：與正常組比較，1） P＜0.01；與模型組比較，2） P＜0.01。

組別正 常 組模 型 組低劑量組高劑量組陽性藥組n77777體質量變化／g 1.29±1.89 2.14±1.07 1.86±0.69 1.57±0.98-2.43±1.131）2）脾臟指數4.29±1.20 4.92±1.13 4.33±1.12 4.04±0.74 2.84±0.311）2）肝臟指數43.89±7.35 43.58±3.20 44.52±4.38 40.45±4.49 45.20±3.96腎臟指數12.16±1.05 11.52±0.61 10.90±0.54 11.04±0.57 11.70±2.26肺臟指數6.64±0.36 6.67±0.47 6.52±0.99 6.35±0.43 6.05±0.84

3.3 石油醚部位對裸鼠移植瘤生長的影響 由表5 可知：模型組瘤體積生長迅速，在后面幾天出現膨脹性增長；陽性藥組、低劑量和高劑量組移植瘤體積增長速度與模型組比較明顯減緩，其中陽性藥組增長速度最慢，差異具有統計學意義（P＜0.01）。 由

表5 各組裸鼠瘤體積比較（±s）mm3

表5 各組裸鼠瘤體積比較（±s）mm3

注：與模型組比較，1） P＜0.05，2） P＜0.01。

組別模 型 組低劑量組高劑量組陽性藥組n7777第7 天108.29±43.12 86.43±22.96 71.71±31.271）62.29±17.722）第9 天234.55±47.96 170.71±21.642）105.29±39.172）77.43±26.722）第11 天361.86±101.35 264.57±19.59 197.29±31.551）118.71±23.632）第13 天507.00±48.01 338.57±70.84 269.14±38.141）151.57±36.552）第15 天782.86±112.14 553.43±92.642）375.86±45.382）231.14±59.182）

圖2 各組對移植瘤生長影響比較

表6 各組瘤重及抑瘤率比較（±s）

表6 各組瘤重及抑瘤率比較（±s）

組別模 型 組低劑量組高劑量組陽性藥組n7777瘤重／g 1.42±0.31 1.10±0.13 0.74±1.20 0.42±0.19抑瘤率／%—22.65 48.03 70.43

4 討 論

腫瘤的基本特征是細胞的無限增殖，而許多中藥可通過抑制腫瘤細胞的增殖來發揮抗腫瘤作用［4］。肺癌是臨床上常見的呼吸道惡性腫瘤，其發病率隨著現代環境和生活方式的變化而增加，是腫瘤相關死亡的主要原因，其五年生存率低至18%［5-6］。 MTT法是分析細胞活性和檢驗細胞增殖的常用方法［7-8］。目前已有牛蒡根提取物對人白血病、腎癌、乳腺癌、胃癌細胞及小鼠肝癌、S180 腹水瘤細胞的體外增殖抑制作用研究，但未見其對人結腸癌、肺癌細胞的體外增殖抑制作用以及牛蒡根成分活性研究。 同時，牛蒡根歸肺、胃經，因此，挑選肺癌A549 細胞進行體外活性篩選，以期得到抗腫瘤活性部位。 MTT體外結果顯示：石油醚部位對肺癌A549 細胞的增殖有較明顯的抑制作用，而乙酸乙酯和多糖部位則無明顯影響，說明牛蒡根抗腫瘤的活性部位可能是其石油醚部位。 體內A549 肺癌小鼠移植瘤結果顯示：石油醚給藥組裸鼠體質量及各臟器指數無顯著變化，但能明顯抑制瘤體體積的增長和瘤體質量，且其抑制作用隨著濃度的增大而增強，而順鉑組裸鼠體質量和脾臟指數則出現明顯下降。 這說明石油醚部位能抑制A549 移植瘤的生長，具有濃度依賴性，且毒副作用較小。

石油醚部位主要含揮發油等揮發性成分及一些小分子成分［9］。 研究發現中藥揮發油能顯著地抑制肺癌、結腸癌、肝癌及胃癌細胞的增殖生長［10］，由此可見，牛蒡根發揮抗腫瘤作用可能與其所含的揮發油成分有關。