冠突曲霉莽草酸形成相關基因表達量及酶活檢測

陳 霞，葛永怡，張小丹，陳 磊，劉緣園，吳 娟

(貴州大學生命科學學院，貴州 貴陽550025)

0 引言

冠突曲霉(Aspergilluscristatus)是茯磚茶“發花”過程的優勢菌種，它的產孢特性可通過滲透壓調節，在低滲條件下產生子囊孢子，被稱為有性型，高滲條件下產生分生孢子，被稱為無性型[1-2]。冠突曲霉能利用茶葉提供的養分產生豐富的天然活性物質，從而賦予茯磚茶獨特的風味及功效[3-5]。

莽草酸(Shikimic acid，SA)是高等植物及微生物次生代謝的起始物，為芳香族類化合物的前體，奎寧酸(Quinic acid QA)為其生物合成代謝通路中的中間產物，莽草酸和奎寧酸在醫藥、食品等行業均有著廣泛的應用[6]。目前，莽草酸獲取方法主要依靠化學合成及植物提取，這些方法的不足之處是成本高昂，前體化合物具有毒性[7-8]。因此，莽草酸的生物合成具有顯著的優勢，CHEN Xiaozhang等[7]的研究中，通過敲除大腸桿菌中莽草酸脫氫酶基因ydiB等多個基因定點突變aroG基因及優化發酵，將莽草酸的產量提高了6.9倍。相較于莽草酸途徑，奎寧酸途徑的研究僅在細菌中有相關報道[9]。在莽草酸途徑中，aroF基因表達3-脫氧-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶催化磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和赤蘚糖-4-磷酸(E4P)合成3-脫氧-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(DAHP)，quiB基因表達奎寧酸脫氫酶催化奎寧酸生成3-脫氫奎寧酸，而脫氫奎寧酸脫水酶(aroD)催化脫氫奎寧酸脫水形成3-脫氫莽草酸，它們是其他化合物進入莽草酸的關鍵酶。此后，莽草酸脫氫酶(aroE)、莽草酸激酶(aroK)、3-磷酸5-烯醇式丙酮酰莽草酸(aroA)、分支酸合酶(aroC)等基因編碼的多種酶類催化3-脫氫莽草酸經過莽草酸、磷酸莽草酸等形成分支酸并進入芳香族氨基酸形成途徑。

冠突曲霉的全基因組測序顯示該菌基因組中不僅存在莽草酸途徑相關基因，也同時存在奎寧酸途徑相關基因，這表明該菌具有執行莽草酸途徑和奎寧酸途徑并形成相關化合物的潛力。本研究將對冠突曲霉不同發育階段aroF、脫氫奎寧酸合成酶(quiB)和aroD的表達量及3個基因對應的蛋白質酶活開展檢測，獲得3個基因不同發育階段的表達量，獲得3個基因對應蛋白的酶活，獲得3個基因表達量與其對應蛋白酶活的相關性，從而幫助探索冠突曲霉中莽草酸途徑和奎寧酸途徑運行的初步狀況，為探索冠突曲霉的莽草酸途徑、奎寧酸途徑存在與運轉情況提供了證據，也為后續實驗中優化改造該菌生產莽草酸奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 菌株

供試菌株為冠突曲霉(Aspergilluscristatus)，分離于湖南益陽茯磚茶，現保存于中科院菌種保藏中心和貴州省農業生物技術重點實驗室，中科院菌株保藏號為CGMCC 7.193。

1.2 主要培養基

MYA培養基：麥芽提取物2 g，酵母提取物0.5 g，蔗糖3 g，瓊脂粉2.5 g，蒸餾水定容至100 mL。121 ℃滅菌15 min。

高滲MYA培養基：麥芽提取物2 g，酵母提取物0.5 g，蔗糖3 g，NaCl 17 g，瓊脂粉2.5 g，加蒸餾水定容至100 mL。121 ℃滅菌15 min。

1.3 菌絲體的培養與收集

MYA平板活化保藏于甘油管中的冠突曲霉，28 ℃恒溫培養5 d后，利用無菌水洗下分生孢子制備分生孢子懸液，調整孢子濃度為1.0×105CFU/mL，分別吸取20 μL接種到MYA和高滲MYA固體培養基中，涂布均勻。有性階段分別收集營養生長階段、閉囊殼形成階段、子囊和子囊孢子形成階段的菌體；無性階段收集分生孢子萌發階段及分生孢子大量形成階段的菌體，液氮速凍后于-70 ℃儲存備用。

1.4 酶活測定

1.4.1 制備粗酶液

取對應5個生長階段的菌體，液氮充分研磨成粉，準確稱取1 g菌粉加入5 mL pH值為7.5、濃度為0.05 mol/L的Tris-HCl緩沖液中，混勻后4 ℃下12 000 r/min離心20 min，取上清即為待測粗酶液。

1.4.2 aroF酶活測定

準確量取50 μL濃度為5 mmol/L的E4P，25 μL濃度為10 mmol/L的PEP，0.5 mL pH值為6.4、濃度為0.1 mol/L的Tris-HCL混勻于試管中，加入步驟1.4.1中制備的粗酶液100 μL，37 ℃水浴10 min，加入0.2 mL體積比為10%的三氯乙酸溶液終止反應，1 000 r/min離心5 min后取上清0.25 mL于1.5 mL離心管中，加入0.25 mL濃度為25 mmol/L的高碘酸溶液，室溫下放置45 min后加入0.5 mL體積比為2%的亞砷酸鈉溶液，室溫靜置2 min，加入2 mL體積比為0.3%的硫巴比妥溶液，沸水浴5 min后于549 nm處測定吸光度。

1.4.3 quiB酶活測定

在0.1 mol/L甘氨酸緩沖液(pH值=9.8)中進行，分別取100 μL濃度為20 mmol/L的NAD+溶液、14 mmol/L 2-巰基乙醇溶液、200 mmol/L莽草酸溶液于1.5 mL的EP管中，以pH值為9.8、濃度為0.1 mol/L的甘氨酸緩沖液補足至900 μL，加入100 μL酶粗提液，30 ℃反應10 min，沸水浴5 min，1 000 r/min離心2 min后于340 nm處測定吸光度。

1.4.4 aroD酶活測定

取不同生長階段菌體，按照1.4.1方法分別制取對應時期菌體的粗酶液，參照脫氫奎尼酸脫水酶酶聯免疫分析試劑盒說明書進行測定。

1.5 aroF、quiB、aroD基因表達量的檢測

1.5.1 不同生長階段總RNA的提取及反轉錄

分別取1 g步驟1.3中收集的各階段菌體，按照真菌總RNA提取試劑盒(生工生物，上海)說明書提取菌體總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取得總RNA濃度、純度及完整性。按照RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(Fermentas，美國)反轉錄，獲得菌體各時期的cDNA，-20 ℃保存備用。

1.5.2 待測基因的實時熒光引物設計與篩選

從基因組數據庫中獲取aroF、quiB、aroD基因序列，運用Primer 5.0設計aroF、quiB、aroD基因的特異性引物，并利用BioEdit軟件中的Local BLAST程序與已建立的基因組數據庫進行比對，確認已設計引物的特異性，共設計引物6對，根據各對引物的Tm值，對上述引物進行特異性篩選。

1.5.3 qRT-PCR檢測待測基因不同生長時期表達量

以不同生長階段菌體的cDNA為模板，引物序列如表1所示，優化獲得的反應體系為SYBR Green I 10 μL、Primer F 0.8 μL、Primer R 0.8 μL、cDNA 1 μL，ddH2O補足至20 μL，優化獲得的PCR反應條件為95 ℃預變性1 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火15 s，72 ℃延伸30 s，40個循環。

表1 篩選獲得的特異引物信息Tab.1 Screening results of specific primers

1.6 數據分析

qRT-PCR采用相對定量2-ΔΔCt法，以GAPDH為內參基因，計算每個基因在冠突曲霉不同生長階段的相對表達量；運用SPSS 22、Microsoft Excel 2016進行統計分析與作圖，采用單因素方差分析(one-wayANOVA)和最小顯著差異法(LSD)進行方差分析與多重比較(α=0.05)，采用Pearson法進行相關性分析，所有結果均為3次重復的平均值±標準差。

2 結果與分析

2.1 aroF、aroE、quiB、aroD蛋白的酶活測定

冠突曲霉在其5個生長階段，即營養階段(S-1)、閉囊殼形成階段(S-2)、子囊和子囊孢子階段(S-3)、分生孢子萌發階段(S-4)、分生孢子大量形成階段(S-5)所呈現的菌落形態均有顯著差異(圖1)。莽草酸途徑中關鍵酶在不同階段的活性不同(圖2)，結果表明，在菌株生長的所有階段aroF的酶活顯著高于quiB與aroD(P<0.05)，aroF在S-5階段酶活最低，為(60.65±0.33)U/L，但仍高于其他酶的最高酶活。在冠突曲霉的有性生長階段，隨著菌體閉囊殼的形成，aroF、quiB、aroD的酶活均出現升高的趨勢，分別由(62.08±0.43)U/L升至(68.60±0.19)U/L，(5.37±0.58)U/L升至(19.56±0.67)U/L，(33.76±0.03)U/L升至(34.30±0.10)U/L；在該菌子囊和子囊孢子形成階段，aroF和aroD的酶活呈現下降的趨勢，quiB的酶活呈現上升的趨勢。無性生長階段，隨著菌體的生長，aroF、quiB、aroD的酶活均顯著(P

注：同種酶不同字母代表差異顯著(P<0.05)，下同。圖2 酶活測定Fig.2 Enzyme activity determination

圖1 不同生長時期冠突曲霉的菌落形態Fig.1 Colony morphology of Aspergillus cristatus in different growth stages

<0.05)下降，分別由(64.37±0.53)U/L降至(60.65±0.33)U/L，(36.74±1.42)U/L降至(18.87±0.75)U/L，(31.42±0.70)U/L降至(26.59±3.13)U/L，這表明冠突曲霉aroF、quiB、aroD蛋白可能與有性發育過程中閉囊殼的形成相關，與無性發育過程中分生孢子形成相關性差，quiB蛋白可能與有性發育的子囊孢子形成最相關，與無性發育過程中分生孢子形成相關性差。

2.2 實時熒光定量PCR引物篩選及擴增效率結果

選取冠突曲霉的cDNA作為模板，設計并篩選出用于實時熒光定量PCR的引物，結果如表1所示，后用優化后的反應體系和條件分別對GAPDH(甘油醛-3-磷酸脫氫酶基因)、aroF、quiB、aroD基因進行實時熒光PCR擴增，各基因擴增效率標準曲線如圖3所示。試驗結果表明：標準曲線線性良好，誤差較小，說明試驗得到的Ct值可以準確確定起始cDNA拷貝數，試驗誤差較小，可信度較高。

圖3 待測基因的擴增效率檢測Fig.3 Detection of amplification efficiency of gene to be tested

2.3 不同生長階段基因表達量

以GAPDH基因為內參，分別測定aroF、quiB、aroD基因在冠突曲霉中5個階段表達量的變化(圖4)。有性發育階段，隨著有性發育的不斷進行，aroF和quiB基因的表達量不斷升高，S-1與S-3階段相比相對表達量分別升高了114.53和95.48倍，但aroD的表達量出現了降低的趨勢，S-1與S-3階段相比相對表達量降低了99.34%，表明aroF、quiB基因的表達與子囊孢子的形成有關，aroD基因與菌體早期生長發育有關。無性發育階段，隨著無性發育的進行，aroF、quiB、aroD基因的表達量均出現降低的趨勢，S-4與S-5階段相比分別下降了55.46%、52.38%和98.03%，表明3種基因的表達均與無性生長早期菌體的生長發育有關，與分生孢子的形成過程相關性差。

圖4 aroF、quiB、aroD在不同階段的相對表達指數Fig.4 Relative expression difference of aroF，quiB，aroD in different stages

2.4 基因表達量和對應蛋白質酶活的相關性

為了深入探索莽草酸、奎寧酸途徑在冠突曲霉中的運行情況，本研究后續考察3個關鍵酶的酶活與對應基因表達量，以及aroF分別與quiB和aroD的酶活及對應基因相對表達量的相關性(圖5)。由圖5可知，aroF與aroD的酶活與其對應基因的表達量分別表現出較弱的正相關和較弱的負相關，相關性方程分別為y=25.581x-1 535.1(R2=0.431)和y=-14.685x+573.84(R2=0.057)；quiB的酶活與其對應基因的表達量表現出了較強的正相關(y=8.512 2x-47.151，R2=0.910)。另外，aroF與quiB酶活的相關性較弱(y=2.631x-150.77，R2=0.489)，但對應基因之間的相關性較強(y=0.832 1x+18.651，R2=0.932 6)；aroF與aroD酶活的相關性較強(y=0.491 6x+0.301 1，R2=0.860)，但對應基因之間的相關性較弱(y=-0.330 2x+142.03，R2=0.156)。結果表明僅有quiB的相對表達量和酶活具有顯著的一致性；aroF與aroD在冠突曲霉不同時期的酶活變化表現出較強的協同性，但在對應基因表達量的變化上aroF與quiB表現出較強的協同性。

圖5 關鍵酶酶活與基因相對表達量相關性分析Fig.5 Correlation analysis of key enzyme activity and relative expression

3 討論與結論

莽草酸途徑現認為是僅存于細菌、真菌及植物中的重要代謝途徑，其連接了生物的初生代謝與次生代謝，開始于糖酵解途徑產生的磷酸烯醇式丙酮酸(hosphoenolpyruvic acid，PEP)和磷酸戊糖途徑產生的赤蘚糖-4-磷酸(rythrose 4-phosphate，E4P)，在aroF基因表達的3-脫氧-阿拉伯庚酮糖酸-7-磷酸合成酶的催化下生成3-脫氧-阿拉伯庚酮糖-7-磷酸(Sedoheptulose 7-phosphate，DAHP)進入莽草酸途徑，后經多步催化反應生成莽草酸[10]。如圖6所示，在冠突曲霉中除了莽草酸途徑還有奎寧酸途徑；以上兩種途徑均是合成芳香類化合物的必經途徑，這些物質對于茯磚茶的發酵及產香起重要的作用[11]。

圖6 莽草酸、奎寧酸途徑在冠突曲霉中的分布情況Fig.6 Distribution of shikimic acid and quinic acid pathways in Aspergillus cristatus

莽草酸是一種羥基化不飽和酸衍生物，是芳香族類氨基酸代謝途徑中的關鍵中間體，能夠抑制凝血系統，并具有抗炎、鎮痛等多種藥用作用，其在1997年發現，并在2005年證實禽流感疫情爆發期間顯現出了良好的治療效果，被認為是抑制H7N9等型流感病毒的特效藥[12-13]。奎寧酸是一種羥基苯甲酸衍生物，是莽草酸途徑中中間代謝產物3-脫氫奎寧酸經奎寧酸脫氫酶催化生成，其是一種具有較高價值的醫藥合成中間體，具有抗炎、抗氧化等作用，并具有生物引誘的作用[14-15]。目前，以上兩種化合物的生產大多數通過植物提取實現，野生八角中的莽草酸含量較高，是較好的植物來源，但依舊存在諸多問題，需開發成本更低、操作更加簡便的生產方法[16]。CHEN Xianzhong等[7]通過分子生物學手段及發酵工藝優化將一株野生型的大腸桿菌莽草酸產量提高了6.9倍(14.6 g/L)。HAWKINS RA等[17]首次報道了存在于真菌(構巢曲霉)中的奎寧酸途徑基因簇。劉禮兵等[9]通過分子手段構建奎寧酸合成工程菌16.4 g/L。

冠突曲霉俗稱金花菌，是茯磚茶發酵過程中的特征菌群，茶葉生產過程中“金花”的多少是判斷茯磚茶品質的重要指標，而金花指的是冠突曲霉生長過程中無性階段產生的閉囊殼與子囊孢子[18-19]。在該菌的生長過程中，可消耗毛茶中的游離氨基酸，從而降低茯磚茶的苦澀使茶湯風味變得柔和，其產生的次級代謝產物可將兒茶素分解為茶紅素、茶褐素等從而賦予了茯磚茶獨特的色澤，但為了更好地了解并開發該菌，需從代謝物及分子水平進行深入研究[20-21]。本研究通過檢測冠突曲霉不同時期參與莽草酸形成相關酶的酶活及其對應基因的表達量，結果顯示在冠突曲霉的有性生長階段，隨著菌體閉囊殼的形成，aroF、quiB的酶活及其對應基因的表達量均出現升高的趨勢，表明aroF代表的莽草酸途徑與quiB代表的奎寧酸途徑隨著菌體閉囊殼的形成逐漸活躍，在閉囊殼形成階段最為活躍；在無性生長階段，隨著菌體的生長及分生孢子的形成，aroF、quiB、aroD的酶活均顯著下降，且其對應的aroF、quiB、aroD基因的表達量均也呈下降(P<0.05)趨勢，表明莽草酸途徑與奎寧酸途徑在冠突曲霉無性階段逐漸不活躍，說明隨著無性發育的不斷進行，莽草酸及奎寧酸途徑逐漸被抑制。

相關性分析表明，aroF(R2=0.431)和aroD(R2=0.057)的基因表達量與對應酶酶活的變化在整個生長過程中相關性較弱，而quiB(R2=0.910)基因表達量與對應的酶活性變化相關性較強。值得注意的是，aroD酶在有性階段的酶活與其對應基因的表達量之間并不呈現一致的趨勢，可能原因是由于酶的活性僅代表當前酶促反應的快慢強弱，而相對表達量代表了該基因的轉錄活性，酶活的大小并不能代表基因表達量的高低。aroF和aroD基因表達量與其對應酶的酶活變化相關性較弱，但quiB基因表達量與其對應酶的酶活變化相關性較強，說明quiB基因相比于aroF和aroD基因轉錄后所受到的調控及其他影響較小，酶活與對應基因相對表達量的變化較一致。有意思的是：aroF與aroD酶活的相關性(R2=0.859)較強，而aroF與quiB的酶活的相關性(R2=0.489)較弱，但aroF與aroD基因表達量之間的相關性較弱(R2=0.156)，aroF與quiB基因表達量之間的相關性較強(R2=0.933)，而具體原因需進一步探討。本研究揭示了冠突曲霉中不同生長階段莽草酸、奎寧酸途徑的運行情況變化，以期為下一步對該菌株在分子水平上的開發與利用提供理論基礎。