不同施肥處理對植煙土壤細(xì)菌群落的影響①

王 玨，杜 琴，彭 雙,3，林先貴，王一明*，李軍營，戴 勛，謝新喬

不同施肥處理對植煙土壤細(xì)菌群落的影響①

王 玨1,2，杜 琴1，彭 雙1,3，林先貴1，王一明1,2*，李軍營4，戴 勛5，謝新喬5

(1 土壤與農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國科學(xué)院南京土壤研究所)，南京 210008；2 中國科學(xué)院大學(xué)，北京 100049；3 江蘇開放大學(xué)，南京 210036；4 云南省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，昆明 650021；5紅塔煙草(集團(tuán))有限責(zé)任公司，云南玉溪 653100)

應(yīng)用定量PCR技術(shù)和高通量測序技術(shù)研究施用有機(jī)肥(YJ)、有機(jī)無機(jī)肥(YW)和無機(jī)肥(WJ)3 a后土壤理化性質(zhì)和細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)、數(shù)量和功能的變化。結(jié)果顯示不同施肥處理下，土壤理化性質(zhì)發(fā)生改變，其中WJ和YJ處理降低了土壤pH，但YJ處理能顯著提升土壤有機(jī)質(zhì)含量，而YW處理在維持土壤pH的同時(shí)提高土壤速效養(yǎng)分和有機(jī)質(zhì)含量。土壤細(xì)菌數(shù)量、群落結(jié)構(gòu)和功能也相應(yīng)地發(fā)生變化，YJ和YW處理土壤中的細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)顯著高于WJ，YW處理的土壤細(xì)菌群落alpha多樣性最高。主坐標(biāo)分析和ANOSIM檢驗(yàn)進(jìn)一步表明，影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的最主要因素是土壤pH。此外，施肥3 a后土壤中部分益生菌相對豐度也發(fā)生明顯的變化，YW處理土壤中Gemmatimonadaceae、Micrococcaceae和Haliangiaceae等植物促生菌的豐度顯著較高，YJ處理土壤中Intrasporangiaceae、Xanthomonadaceae、Chitinophagaceae、Burkholderiaceae等具有固氮或生防功能的細(xì)菌豐度較高，YW和YJ處理均增加了固氮菌Rhizobiaceae的豐度。細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的改變進(jìn)一步影響了細(xì)菌群落的功能，YW處理顯著增加了土壤細(xì)菌群落的硝化功能。本研究結(jié)果可為煙葉生產(chǎn)中合理施肥提供科學(xué)依據(jù)。

施肥；植煙土壤；高通量測序；細(xì)菌群落

施肥是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)主要的措施之一，對土壤質(zhì)量和可持續(xù)利用具有深遠(yuǎn)影響，長期施肥可改變土壤理化性質(zhì)和生物活性，影響作物產(chǎn)量[1]。微生物是土壤生物中最重要的組成部分，對環(huán)境變化十分敏感，是土壤環(huán)境質(zhì)量的重要指標(biāo)[2]。近年來，國內(nèi)外展開了諸多卓有成效的研究，主要集中于不同肥料處理如有機(jī)肥、有機(jī)無機(jī)肥配合施用對土壤肥力以及土壤微生物區(qū)系等方面的影響。有研究表明施用化肥可以增加30% ～ 50% 的糧食作物產(chǎn)量[3]，但是長期大量和過量施用化肥會(huì)引起土壤酸化板結(jié)、供肥能力下降等問題[4-5]。與僅使用化肥相比，有機(jī)肥料、化肥和有機(jī)肥料配合施用有利于土壤團(tuán)粒結(jié)構(gòu)的形成，增加土壤透氣性，增強(qiáng)保水保肥能力，協(xié)調(diào)水、氣、熱交換，促進(jìn)土壤養(yǎng)分轉(zhuǎn)化，從而刺激微生物的生長[6-7]。有機(jī)肥施入土壤后，除了引起土壤微環(huán)境的變化外，同時(shí)又引入了一些外源微生物，打破了土著微生物動(dòng)態(tài)平衡，最終造成整個(gè)土壤微生物區(qū)系的變化[8]。因此，有機(jī)肥、有機(jī)肥與化肥的配合施用可以調(diào)控土壤微生物區(qū)系，是提升土壤質(zhì)量和微生物多樣性的重要途徑。

煙草是我國重要的經(jīng)濟(jì)作物，我國煙草種植面積和煙葉產(chǎn)量均居世界首位[9]。云南玉溪地處西南邊陲，長期種植煙草，大多數(shù)煙區(qū)植煙歷史超過百年，由于長期連作以及化學(xué)品(農(nóng)藥、除草劑)的大量投入，部分地區(qū)植煙土壤質(zhì)量下降明顯，已成為當(dāng)?shù)責(zé)熑~生產(chǎn)的主要障礙因子，制約煙葉產(chǎn)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。針對不同施肥措施對植煙土壤微生物的影響，有研究表明施用腐熟芝麻餅肥、腐殖酸或氨基酸可以明顯增加煙田土壤根際細(xì)菌和放線菌的數(shù)量，對土壤真菌的數(shù)量影響較小[10]。郭紅祥等[11]研究發(fā)現(xiàn)，施用菜籽餅和花生餅后煙田土壤中細(xì)菌、放線菌、好氣性纖維分解菌和亞硝化細(xì)菌數(shù)量上升。張曉海等[12]研究表明，施用菜籽餅不僅增加了烤煙根際土壤的細(xì)菌數(shù)量，而且顯著提高了煙草生育中后期根際解磷細(xì)菌和解鉀細(xì)菌的生物量。施用有機(jī)肥可以有效提高土壤中有益微生物的數(shù)量，降低或者控制土壤中病原微生物的數(shù)量，促進(jìn)土壤微生物區(qū)系逐步向健康的狀態(tài)轉(zhuǎn)變，例如李想等[13-14]研究發(fā)現(xiàn)施用L-25生物有機(jī)肥后，煙苗根際土壤中病原菌的數(shù)量從107cfu/g下降至106cfu/g，煙草根系表面形成“微生物生物防御層”，從而防止或減少病原菌的侵入。上述研究主要集中于施用有機(jī)肥對植煙土壤微生物數(shù)量的影響，對于土壤微生物多樣性及功能變化的研究相對較少；此外，無機(jī)肥、有機(jī)肥和有機(jī)無機(jī)肥配合施用對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)、多樣性及其功能的影響和差異也尚不明確。

目前，對植煙土壤響應(yīng)施肥處理的研究主要集中在微生物群落組成和多樣性，在功能層面上對微生物群落進(jìn)行描述可以更深入地探討施肥產(chǎn)生的影響。FAPROTAX 是一個(gè)進(jìn)行細(xì)菌功能比對的數(shù)據(jù)庫，不僅可對細(xì)菌進(jìn)行具體的功能預(yù)測，還能對執(zhí)行相關(guān)功能的菌群進(jìn)行鑒定分類。FAPROTAX 在細(xì)菌群落研究中得到了較為廣泛的應(yīng)用[15-16]。因此，本研究以云南玉溪種植煙草的土壤為研究對象，聯(lián)合使用定量PCR、高通量測序技術(shù)和FAPROTAX 軟件，分析不同肥料處理對盆栽植煙土壤理化性質(zhì)和微生物群落結(jié)構(gòu)、數(shù)量和功能的差異，探究各處理對土壤質(zhì)量的影響，以期為煙葉種植的合理施肥和煙草生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 溫室盆栽試驗(yàn)概況

供試土壤采自云南省玉溪市峨山縣岔河鄉(xiāng)河外村典型煙田，質(zhì)地為紫色土，土壤的基本理化性質(zhì)：pH 6.32，全氮1.87 g/kg，全磷1.22 g/kg，有效磷22.73 mg/kg，速效鉀117.96 mg/kg。耕層土壤經(jīng)風(fēng)干過 0.50 mm 篩后裝入試驗(yàn)盆缽內(nèi)，每盆裝25 kg 風(fēng)干土。

盆栽試驗(yàn)起始于2015 年，采用春季種煙-冬季休閑的種植模式。設(shè)3 種施肥處理，分別為：無機(jī)肥(WJ)、有機(jī)肥(YJ)和有機(jī)無機(jī)肥(YW)，每種處理3 次重復(fù)。其中WJ 處理，基肥為煙草專用復(fù)混肥，追肥為煙草專用氮鉀肥；YJ 處理中，基肥為有機(jī)肥，追肥為有機(jī)水溶肥；YW 處理中，基肥為煙草專用有機(jī)無機(jī)肥，追肥為有機(jī)無機(jī)氮鉀肥。分別在移栽后7 ～ 10、14 ～ 17、21 ～ 28 d 追肥，3 個(gè)時(shí)期追肥量的比例為1︰3︰4。肥料養(yǎng)分含量比例及施肥量見表1，其中有機(jī)肥和煙草專用有機(jī)無機(jī)肥是以發(fā)酵腐熟的油枯及生化黃腐酸鉀制備。

2017 年5 月11 日移栽煙苗，8 月下旬試驗(yàn)結(jié)束，溫室管理參照常規(guī)大田管理。

表1 試驗(yàn)用肥料養(yǎng)分含量及其施肥量

1.2 試驗(yàn)樣品采集

于2017年7月25日煙草成熟期采集土壤樣品。每盆多點(diǎn)取樣混合作為1個(gè)耕層土壤樣品，充分混勻。所有樣品去除植物根系后風(fēng)干過2 mm 篩混勻，一部分風(fēng)干后用于土壤理化性質(zhì)的測定，另一部分置于–80 ℃冰箱，用于土壤DNA提取。

1.3 測定項(xiàng)目與方法

1.3.1 土壤理化性質(zhì)測定 土壤pH按土水比1︰2.5(質(zhì)量體積比)充分混合后用pH計(jì)測定；土壤銨態(tài)氮(NH4+-N)采用納氏試劑比色法測定，硝態(tài)氮(NO– 3-N)采用紫外分光光度法測定；有效磷(AP)采用0.50 mol/L碳酸氫鈉浸提，鉬銻抗比色法測定；全鉀(TK)、速效鉀(AK)和緩效鉀(SLK)分別用NaOH熔融、1 mol/L乙酸銨浸提、1 mol/L熱硝酸浸提，原子吸收分光光度法測定；有機(jī)質(zhì)(OM)采用重鉻酸鉀容量法測定。具體方法參考魯如坤[17]。

1.3.2 土壤DNA 提取及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 稱取約0.5 g 新鮮土壤，土壤總DNA 使用Fast DNA Spin Kit for Soil(MP Biomedicals, Santa Ana, CA, USA)試劑盒提取，同時(shí)用核酸定量儀(NanoDrop ND-1000)檢測提取DNA的濃度和純度，提取完成后，于–20 ℃ 冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 法測定細(xì)菌16S rRNA 基因豐度，采用引物 338F(5’-ACTCCTA CGGGAGGCAGCAG-3’)和 806R(5’-GGACTACHV GGGTWTCTAAT-3’)擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA 基因。測定標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒(內(nèi)參)濃度并進(jìn)行梯度稀釋制備標(biāo)準(zhǔn)曲線，用Bio-Rad CFX96 熒光定量 PCR 儀(Bio-Rad，CA，USA)進(jìn)行測定，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線中的基因拷貝數(shù)和 Ct 值計(jì)算樣品中的基因拷貝數(shù)。反應(yīng)體系為：SYBR?Premix Ex Taq Ⅱ(ThiRNaseH Plus)10 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.20 μl，DNA 模板2.0 μl，ddH2O 7.6 μl。16S rRNA 反應(yīng)條件為：95 ℃ 3 min；95 ℃ 20 s，56 ℃ 45 s，72 ℃ 30 s，共34 個(gè)循環(huán)。退火延伸時(shí)檢測熒光信號(hào)。

1.3.3 高通量測序分析 高通量測序委托北京諾禾致源生物公司進(jìn)行，具體方法如下：①采用 CTAB 或 SDS 方法提取DNA，之后利用瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA 的純度和濃度，無菌水稀釋樣本至1 ng/μl；②以稀釋后的DNA 為模板，利用通用引物515F-806R對細(xì)菌16S rRNA基因的V4區(qū)進(jìn)行擴(kuò)增，在515F的前端插入barcode序列以區(qū)分各樣本。PCR反應(yīng)體系為30 μl，反應(yīng)條件為：98 ℃ 1 min，30次循環(huán)(98 ℃ 10 s，50 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)，72 ℃ 5 min。PCR 產(chǎn)物使用2% 濃度的瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測，據(jù)其濃度進(jìn)行等量混樣，充分混勻后使用GeneJET? PCR Purification kit試劑盒(Thermo Scientific，USA)對PCR產(chǎn)物進(jìn)行純化；③使用Ion Plus Fragment Library Kit 48 rxns試劑盒(Thermo Fisher，MA，USA)進(jìn)行文庫構(gòu)建，構(gòu)建好的文庫經(jīng)過Qubit定量和文庫檢測合格后，利用IonS5TMXL測序儀(Thermo Fisher，MA，USA)上機(jī)測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理與分析

土壤理化性質(zhì)、細(xì)菌16S rRNA基因拷貝數(shù)的多重比較、方差分析和相關(guān)性分析用 SPSS 24.0軟件完成，相關(guān)性分析采用Pearson 雙尾檢驗(yàn)，平均值多重比較采用Duncan檢驗(yàn)法進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)(統(tǒng)計(jì)水準(zhǔn)均為<0.05)，并采用 Origin 8.6和 Adobe Illustrator CC 2019軟件進(jìn)行繪圖。

使用QIIME 1.9.1按以下步驟進(jìn)行高通量測序數(shù)據(jù)處理分析：①切除引物和低質(zhì)量序列并根據(jù)barcode序列區(qū)分各樣本數(shù)據(jù)；②基于SILVA[18]數(shù)據(jù)庫去除嵌合體；③得到的高質(zhì)量序列以97% 相似度聚類成為OTUs(operational taxonomic units，操作分類單元)；④進(jìn)行物種注釋(設(shè)定閾值為0.8 ～ 1)，將未注釋到門水平及注釋為古菌的序列刪除后，所有樣品隨機(jī)抽取 52 000 條序列進(jìn)行后續(xù)分析。計(jì)算細(xì)菌Chao1、Shannon、Simpson、ACE指數(shù)，使用R3.6.1軟件agricolae 包的Tukey 檢驗(yàn)和wilcox 檢驗(yàn)進(jìn)行組間差異分析，基于 Bray-Curtis、Weighted UniFrac、Unweighted UniFrac 距離的主坐標(biāo)分析(PCoA)使用WGCNA、stats 和ggplot2 包，Mantel test、ANOSIM 分析和典范對應(yīng)分析均使用vegan 包進(jìn)行，Pearson 相關(guān)性分析采用psych 和pheatmap 包完成相關(guān)系數(shù)值的顯著性檢驗(yàn)及函數(shù)可視化，功能預(yù)測使用FAPROTAX 軟件進(jìn)行。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同施肥處理對植煙土壤化學(xué)性質(zhì)的影響

經(jīng)過連續(xù)3 a的施肥，與2015 年本底土和YW 處理相比，WJ 和 YJ 處理均明顯降低了土壤pH ，WJ 處理的土壤 pH 降低幅度最大，其次為 YJ 處理(表2)。與 WJ 處理相比，YJ 處理土壤中的銨態(tài)氮、速效鉀和緩效鉀含量顯著較低，有機(jī)質(zhì)含量顯著較高；而 YW 處理除銨態(tài)氮含量顯著較低外，其他養(yǎng)分含量與 WJ 處理無顯著差異。

表2 不同施肥處理下土壤主要化學(xué)性質(zhì)

注：同列數(shù)據(jù)小寫字母不同表示處理間差異達(dá)<0.05顯著水平，下表同。

YJ 處理有機(jī)質(zhì)含量的顯著增加，可能是因?yàn)楸驹囼?yàn)中的有機(jī)肥是以發(fā)酵腐熟后的油枯及黃腐酸鉀作為有機(jī)原料制備的，其中相當(dāng)部分的有機(jī)物質(zhì)分解緩慢，施用后導(dǎo)致土壤有機(jī)質(zhì)積累，庫存較高；此外，黃腐酸鉀和油枯中含有小分子有機(jī)酸，可能促進(jìn)煙株根系生長并影響微生物活動(dòng)：分泌更多根系分泌物提高外源有機(jī)碳輸入量[19-20]、微生物活動(dòng)的增強(qiáng)導(dǎo)致土壤微生物量碳增加，從而提升根圍土壤有機(jī)質(zhì)含量[21]。YJ 處理銨態(tài)氮、速效鉀、緩效鉀等養(yǎng)分均顯著低于YW 和 WJ 處理，這是因?yàn)闊o機(jī)肥料養(yǎng)分釋放快，短時(shí)間內(nèi)可迅速增加土壤速效養(yǎng)分含量，提高土壤供肥能力；而有機(jī)肥養(yǎng)分釋放慢，雖可改善土壤養(yǎng)分的庫容，提高土壤供肥容量，但速效養(yǎng)分較少；有機(jī)無機(jī)肥配施，速效和緩效養(yǎng)分互補(bǔ)，可提高作物對肥料養(yǎng)分的利用率。此外，YJ 和 YW 處理土壤中的硝態(tài)氮和銨態(tài)氮比值均高于 WJ 處理，更能滿足煙草喜硝的特點(diǎn)。

2.2 不同施肥處理對細(xì)菌群落數(shù)量的影響

3 種不同肥料施用 3 a后土壤中細(xì)菌16S rRNA 基因數(shù)量見圖1，與 WJ 處理相比，YW 和 YJ 處理均顯著增加了土壤中的細(xì)菌數(shù)量，分別增加了 58.20% 和64.63%。相關(guān)性分析(表3)表明，土壤細(xì)菌16S rRNA 基因拷貝數(shù)與土壤NH4+-N 呈顯著負(fù)相關(guān)，與土壤pH、有機(jī)質(zhì)含量顯著正相關(guān)，說明肥料施用后引起的NH4+-N、pH 和有機(jī)質(zhì)含量的變化，可能是導(dǎo)致施肥土壤中細(xì)菌數(shù)量差異的主要原因。多項(xiàng)研究證明，有機(jī)物的添加(農(nóng)作物殘?bào)w、綠肥)對微生物數(shù)量的影響較大[22]。土壤有機(jī)質(zhì)與農(nóng)業(yè)或自然生態(tài)系統(tǒng)中的土壤微生物生物量之間存在著顯著正相關(guān)關(guān)系[23]，有機(jī)肥料的添加，為細(xì)菌生長提供了充足的碳、氮源，促進(jìn)了細(xì)菌繁殖[24-25]。由于連續(xù)施用無機(jī)肥顯著降低了土壤 pH(表2)，而細(xì)菌數(shù)量與土壤酸堿度高度相關(guān)[26]，較低的pH 環(huán)境不利于細(xì)菌生長繁殖[27]，這可能是本研究 WJ 處理土壤中的細(xì)菌16S rRNA 拷貝數(shù)顯著較低的原因。

2.3 不同施肥處理對細(xì)菌群落多樣性的影響

土壤細(xì)菌對環(huán)境條件的變化十分敏感，長期施肥會(huì)顯著影響微生物群落的多樣性和結(jié)構(gòu)[28]。通過高通量測序結(jié)果進(jìn)行質(zhì)控、降噪，共獲得723 037條高質(zhì)量序列，平均每個(gè)樣本 80 337條。稀釋曲線分析表明，在52 000個(gè)隨機(jī)選擇的細(xì)菌序列中，曲線接近飽和穩(wěn)定，表明測序深度符合下游分析要求。不同處理土壤的細(xì)菌群落alpha多樣性指數(shù)見表4，3個(gè)處理中，YW 處理土壤中的細(xì)菌群落alpha多樣性指數(shù)顯著較高，而YJ 和 WJ 處理之間無顯著差異。說明 YW 處理能夠提高土壤中細(xì)菌的豐富度和多樣性。基于 Bray-Curtis dissimilarity、Weighted UniFrac distance和Unweighted UniFrac distance 3種距離矩陣進(jìn)行主坐標(biāo)分析，結(jié)果如圖2所示，不同施肥處理下細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)明顯分異(圖2A ～ 2C)。ANOSIM 檢驗(yàn)表明，3種距離矩陣下各處理的組內(nèi)差異均顯著低于組間差異(圖2 D ～ 2F)，表明不同施肥處理下的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著。

表3 16S rRNA基因拷貝數(shù)與土壤理化性質(zhì)的相關(guān)性

注：AP：有效磷；AK：速效鉀；SLK：緩效鉀；TK：全鉀；OM：有機(jī)質(zhì)；NH4+-N：銨態(tài)氮；NO– 3-N：硝態(tài)氮。*表示相關(guān)性達(dá)<0.05顯著水平。

表4 不同施肥處理土壤細(xì)菌群落的alpha多樣性指數(shù)

注：表中數(shù)據(jù)為3個(gè)樣點(diǎn)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

分別在OTU水平、門水平和科水平上，采用Mantel test 檢驗(yàn)土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)和土壤理化性質(zhì)之間的相關(guān)性(表5)，結(jié)果表明土壤pH在各分類水平上均與土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)高度相關(guān)(<0.001)，在OTU水平上NH4+-N含量與土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)顯著相關(guān)(= 0.391，= 0.005)。進(jìn)一步采用CCA分析土壤理化性質(zhì)對細(xì)菌群落組成的影響(圖3)。結(jié)果顯示，在OTU水平上，NH4+-N、AP和pH對第一軸貢獻(xiàn)率較高，而NO– 3-N、AK、SLK、TK和OM對第二軸貢獻(xiàn)率較高，且pH和NH4+-N對施肥土壤細(xì)菌群落影響顯著(圖3)。在門和科水平上，pH同樣是顯著影響土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的關(guān)鍵環(huán)境因子。有研究表明，不同的肥料類型會(huì)改變土壤的物理和化學(xué)性質(zhì)，如土壤通氣狀況、pH、水分和養(yǎng)分固持能力等，進(jìn)而影響微生物群落結(jié)構(gòu)[28-30]，本研究結(jié)果與上述研究結(jié)論一致。連續(xù)施用無機(jī)肥會(huì)導(dǎo)致土壤酸化，而土壤酸化會(huì)進(jìn)一步引發(fā)一系列生物化學(xué)反應(yīng)，尤其是強(qiáng)烈影響微生物活動(dòng)，最終導(dǎo)致微生物區(qū)系多樣性失衡[31]。與施用有機(jī)肥牛糞相比，施用無機(jī)肥可降低土壤微生物區(qū)系種群功能多樣性[32]。而有機(jī)物料能增進(jìn)土壤微生物多樣性，微生物多樣性的增加又可改進(jìn)對土壤的能源和營養(yǎng)物質(zhì)的利用，例如Peacock等[33]研究表明，長期施用牛糞會(huì)促進(jìn)作物根系分泌物和土壤中可溶性有機(jī)碳積累，導(dǎo)致微生物生物量的增加和群落結(jié)構(gòu)的變化。

表5 土壤細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)與理化性質(zhì)的Mantel檢驗(yàn)

注：**表示相關(guān)性達(dá)< 0.01顯著水平。

2.4 不同施肥處理對細(xì)菌群落物種組成的影響

將所獲的高質(zhì)量序列在97% 相似性水平上進(jìn)行聚類，共得到2 661 個(gè)OTUs，代表序列經(jīng)物種注釋后歸屬32 個(gè)門、50 個(gè)綱、112 個(gè)目、187 個(gè)科和360 個(gè)屬。在全部樣品中，Proteobacteria (平均相對豐度為39.9%)是最豐富的門，其次是Actino-bacteria (17.6%)、Acidobacteria(10.6%)、Gemmatimona-detes(7.19%)和Chloroflexi(8.57%)，這5 個(gè)優(yōu)勢菌門的累計(jì)相對豐度為83.8% (圖4A)，與植煙黃壤中的優(yōu)勢菌門類似[34]。上述優(yōu)勢菌門的相對豐度在不同處理土壤中存在顯著性差異，YJ 處理土壤中Proteo-bacteria 顯著較高，分別比YW 和WJ 處理高16.20% 和13.86%；可能是因?yàn)榇罅坑袡C(jī)質(zhì)的投入有利于富營養(yǎng)微生物群落的富集[35]。YW 處理的Acidobacteria 和Gemmatimonadetes 均顯著高于其他處理，而Actinobacteria、Chloroflexi 和Firmicutes 的相對豐度在WJ 處理中最高。上述結(jié)果表明，與 WJ 處理相比，YJ 處理顯著增加了土壤中的變形菌門相對豐度，而 YW 處理則顯著增加了Acidoba-cteria 和Gemmatimonadetes 相對豐度，YJ 和 YW 處理均顯著降低了Actinobacteria 、Chloroflexi 和Firmicutes 的相對豐度。

在科水平上(圖4B)，Rhodanobacteraceae、 Gemmatimonadaceae和Sphingomonadaceae是植煙土壤細(xì)菌群落中平均相對豐度最高的 3 個(gè)科，分別隸屬于γ-Proteobacteria、Gemmatimonadetes 和α- Proteobacteria。通過單因素方差分析，確定響應(yīng)不同肥料處理的 40 個(gè)組間差異物種，并對差異物種與土壤理化因子進(jìn)行相關(guān)性分析(圖5)，結(jié)果表明：連續(xù)3 a 施用YJ 肥料，顯著增加了土壤中Intrasporan-giaceae、Burkholderiaceae、Chitinophagaceae和Xanthomonadaceae的相對豐度，上述細(xì)菌均與土壤中的有機(jī)質(zhì)和硝態(tài)氮含量正相關(guān)。Intrasporangiaceae對重金屬有一定的耐受性[36]，Burkholderiaceae是固氮菌[37]，能夠與植物寄主共生固氮，而Xantho-monadaceae[38]和Chitinophagaceae[39]是植物病害生防細(xì)菌，可以產(chǎn)生許多具有重要生物活性的次生代謝產(chǎn)物從而抑制病原菌的生長。YW 處理顯著降低了Rhodanobacteraceae、Microbacteriaceae 的相對豐度，顯著增加了Gemmatimonadaceae、Micrococcaceae和Haliangiaceae的相對豐度，這 3 種相對豐度增加的細(xì)菌均與土壤 pH 呈正相關(guān)；Gemmatimona-daceae[40]Micrococcaceae[41]和Haliangiaceae[42-43]被證明是植物促生菌(PGPR)，能夠產(chǎn)生 GA 和 IAA 并誘導(dǎo)根系生長。此外，YJ 和 YW 處理均顯著增加了Rhizobia-ceae的相對豐度，且與土壤中的有機(jī)質(zhì)和硝態(tài)氮含量正相關(guān)。Rhizobiaceae是固氮菌[44]，能附著在根上并有效地定殖于根表，與植物寄主共生固氮，是促進(jìn)植物生長的益生菌。綜上，3 種施肥處理中，YJ 和 YW 處理能夠增加有益菌的相對豐度，更有利于煙草的生長。

2.5 不同施肥處理對細(xì)菌群落功能的影響

使用 FAPROTAX 對微生物細(xì)菌群落進(jìn)行功能預(yù)測，從 35 個(gè)功能中篩選出處理間有顯著差異的8 項(xiàng)功能進(jìn)行分析(表6)，結(jié)果表明：與YJ 和WJ 處理相比，YW 處理中需氧化能異養(yǎng)顯著降低。相關(guān)性分析表明，需氧化能異養(yǎng)功能與可進(jìn)行光合作用的自養(yǎng)營養(yǎng)微生物Gemmatimonadetes相對豐度呈負(fù)相關(guān)(=–0.817，=0.048)[45]。本研究中Gemmati-monadetes 在YW處理中顯著升高(圖4A)，暗示土壤中的化能自養(yǎng)微生物與異養(yǎng)微生物可能存在著生態(tài)位的競爭作用。

表6 不同處理微生物菌群功能預(yù)測

注：*，**分別表示相關(guān)性達(dá)<0.05和<0.01顯著水平。

本研究發(fā)現(xiàn)在3組施肥處理中，YW 處理細(xì)菌群落的硝化功能顯著高于 YJ 和 WJ 處理，可能是由于執(zhí)行該功能的關(guān)鍵物種Nitrospira 在 YW 處理中相對豐度顯著高于YJ和WJ處理(圖 6A)。相關(guān)性分析表明，土壤Nitrospira 的相對豐度與土壤pH 顯著正相關(guān)(圖6B)，因此，推測 YJ 和 WJ 處理導(dǎo)致土壤pH 明顯降低，進(jìn)而減少了該菌的相對豐度，影響了土壤微生物的硝化功能。長期連作土壤中，WJ 處理一方面降低了植煙土壤 Burkholderiaceae、Rhizobiaceae 等促進(jìn)固氮作用的細(xì)菌豐度(圖4、圖5)；另一方面會(huì)導(dǎo)致土壤嚴(yán)重酸化，減少硝化作用關(guān)鍵物種數(shù)量，抑制硝化細(xì)菌的活性，進(jìn)而引發(fā)土壤微生物硝化功能降低；而施用有機(jī)無機(jī)肥，土壤硝化功能保持較高的狀態(tài)，更能滿足煙草喜硝的特點(diǎn)。

3 結(jié)論

長期施用不同的煙草肥料會(huì)對土壤理化性質(zhì)和細(xì)菌群落造成明顯的影響。長期施用有機(jī)肥有助于提高土壤有機(jī)質(zhì)含量，增加細(xì)菌數(shù)量；有機(jī)無機(jī)肥配施有利于維持土壤pH的穩(wěn)定，還可提高土壤速效養(yǎng)分和有機(jī)質(zhì)含量，增加土壤中的細(xì)菌數(shù)量和細(xì)菌群落的多樣性。施用有機(jī)肥或有機(jī)無機(jī)肥配施均可以提高Gemmatimonadaceae、Rhizobiaceae和Micrococcaceae等植物促生菌的豐度；而連續(xù)施用無機(jī)肥則導(dǎo)致土壤酸化，降低土壤細(xì)菌數(shù)量和細(xì)菌群落的硝化功能。綜上，建議云南紫色土區(qū)域煙草施肥采用無機(jī)肥和有機(jī)肥配施，更有利于維持植煙土壤質(zhì)量的穩(wěn)定和微生物區(qū)系的健康。

[1] Zhong W H, Gu T, Wang W, et al.The effects of mineral fertilizer and organic manure on soil microbial community and diversity[J].Plant and Soil, 2010, 326(1/2): 511–522.

[2] Insam H, Hutchinson T C, Reber H H.Effects of heavy metal stress on the metabolic quotient of the soil micro-flora[J].Soil Biology and Biochemistry, 1996, 28(4/5): 691–694.

[3] Stewart W M, Dibb D W, Johnston A E, et al.The contribution of commercial fertilizer nutrients to food production[J].Agronomy Journal, 2005, 97(1): 1–6.

[4] 黃國勤, 王興祥, 錢海燕, 等.施用化肥對農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的負(fù)面影響及對策[J].生態(tài)環(huán)境, 2004, 13(4): 656–660.

[5] 張福鎖, 王激清, 張衛(wèi)峰, 等.中國主要糧食作物肥料利用率現(xiàn)狀與提高途徑[J].土壤學(xué)報(bào), 2008, 45(5): 915– 924.

[6] Miao Y X, Stewart B A, Zhang F S.Long-term experiments for sustainable nutrient management in China.A review[J].Agronomy for Sustainable Development, 2011, 31(2): 397–414.

[7] Zhang S T, Song X N, Li N, et al.Influence of high-carbon basal fertiliser on the structure and composition of a soil microbial community under tobacco cultivation[J].Research in Microbiology, 2018, 169(2): 115–126.

[8] Li W T, Wu M, Liu M, et al.Responses of soil enzyme activities and microbial community composition to moisture regimes in paddy soils under long-term fertilization practices[J].Pedosphere, 2018, 28(2): 323–331.

[9] 蘇賢坤, 張曉海, 廖德智.煙草綜合利用現(xiàn)狀及其前景[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué), 2006, 34(5): 120–123.

[10] 彭智良, 黃元炯, 劉國順, 等.不同有機(jī)肥對煙田土壤微生物以及煙葉品質(zhì)和產(chǎn)量的影響[J].中國煙草學(xué)報(bào), 2009, 15(2): 41–45.

[11] 郭紅祥, 劉衛(wèi)群, 姜占省.施用餅肥對烤煙根系土壤微生物的影響[J].河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2002, 36(4): 344– 347.

[12] 張曉海, 楊春江, 王紹坤, 等.烤煙施用菜籽餅后根際微生物數(shù)量變化研究[J].云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào), 2003, 18(1): 14–19.

[13] 李想, 劉艷霞, 陸寧, 等.綜合生物防控?zé)煵萸嗫莶〖捌鋵ν寥牢⑸锶郝浣Y(jié)構(gòu)的影響[J].土壤學(xué)報(bào), 2017, 54(1): 216–226.

[14] 滕桂香, 邱慧珍, 張春紅, 等.微生物有機(jī)肥對烤煙育苗、產(chǎn)量和品質(zhì)的影響[J].中國生態(tài)農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào), 2011, 19(6): 1255–1260.

[15] Ma J, Liu H, Zhang C, et al.Joint response of chemistry and functional microbial community to oxygenation of the reductive confined aquifer[J].Science of the Total Environment, 2020, 720: 137587.

[16] 趙文慧, 馬壘, 徐基勝, 等.秸稈與木本泥炭短期施用對潮土有機(jī)質(zhì)及微生物群落組成和功能的影響[J].土壤學(xué)報(bào), 2020, 57(1): 153–164.

[17] 魯如坤.土壤農(nóng)業(yè)化學(xué)分析方法[M].北京: 中國農(nóng)業(yè)科技出版社, 2000.

[18] Quast C, Pruesse E, Yilmaz P, et al.The SILVA ribosomal RNA gene database project: Improved data processing and web-based tools[J].Nucleic Acids Research, 2013, 41(D1): D590–D596.

[19] 張偉明, 孟軍, 王嘉宇, 等.生物炭對水稻根系形態(tài)與生理特性及產(chǎn)量的影響[J].作物學(xué)報(bào), 2013, 39(8): 1445–1451.

[20] 應(yīng)多, 趙熙君, 張旭輝, 等.添加玉米秸稈重金屬污染對水稻土有機(jī)碳礦化的影響[J].土壤, 2020, 52(2): 340– 347.

[21] 李典鵬, 王輝, 孫濤, 等.機(jī)械壓實(shí)對新疆綠洲農(nóng)田土壤微生物活性及碳排放的影響[J].農(nóng)業(yè)工程學(xué)報(bào), 2018, 34(20): 124–131.

[22] N’Dayegamiye A, Tran T S.Effects of green manures on soil organic matter and wheat yields and N nutrition[J].Canadian Journal of Soil Science, 2001, 81(4): 371–382.

[23] 第19屆國際土壤學(xué)大會(huì)重點(diǎn)論文摘要選譯[J].土壤, 2010, 42(5): 696–799.

[24] Demoling F, Figueroa D, B??th E.Comparison of factors limiting bacterial growth in different soils[J].Soil Biology and Biochemistry, 2007, 39(10): 2485–2495.

[25] Sradnick A, Murugan R, Oltmanns M, et al.Changes in functional diversity of the soil microbial community in a heterogeneous sandy soil after long-term fertilization with cattle manure and mineral fertilizer[J].Applied Soil Ecology, 2013, 63: 23–28.

[26] Feng Y Z, Grogan P, Caporaso J G, et al.pH is a good predictor of the distribution of anoxygenic purple phototrophic bacteria in Arctic soils[J].Soil Biology and Biochemistry, 2014, 74: 193–200.

[27] Bartram A K, Jiang X P, Lynch M D J, et al.Exploring links between pH and bacterial community composition in soils from the Craibstone Experimental Farm[J].FEMS Microbiology Ecology, 2014, 87(2): 403–415.

[28] Zimmerman A R.Abiotic and microbial oxidation of laboratory-produced black carbon (biochar)[J].Environmental Science & Technology, 2010, 44(4): 1295–1301.

[29] Jindo K, Hernández T, García C, et al.Influence of stability and origin of organic amendments on humification in semiarid soils[J].Soil Science Society of America Journal, 2011, 75(6): 2178–2187.

[30] Chintala R, Mollinedo J, Schumacher T E, et al.Effect of biochar on chemical properties of acidic soil[J].Archives of Agronomy and Soil Science, 2014, 60(3): 393–404.

[31] 徐仁扣.土壤酸化及其調(diào)控研究進(jìn)展[J].土壤, 2015, 47(2): 238–244.

[32] Ozlu E, Kumar S.Response of soil organic carbon, pH, electrical conductivity, and water stable aggregates to long-term annual manure and inorganic fertilizer[J].Soil Science Society of America Journal, 2018: 1243–1251.

[33] Peacock A D, Mullen M D, Ringelberg D B, et al.Soil microbial community responses to dairy manure or ammonium nitrate applications[J].Soil Biology and Biochemistry, 2001, 33(7/8): 1011–1019.

[34] 陳懿, 吳春, 李彩斌, 等.炭基肥對植煙黃壤細(xì)菌、真菌群落結(jié)構(gòu)和多樣性的影響[J].微生物學(xué)報(bào), 2020, 60(4): 653–666.

[35] Manzoni S, Porporato A.Soil carbon and nitrogen mineralization: Theory and models across scales[J].Soil Biology and Biochemistry, 2009, 41(7): 1355–1379.

[36] 丁蘇麗, 張祁炅, 董俊, 等.深港紅樹林沉積物微生物群落多樣性及其與重金屬的關(guān)系[J].生態(tài)學(xué)雜志, 2018, 37(10): 3018–3030.

[37] 成艷紅, 黃欠如, 武琳, 等.紅壤旱地一株自生固氮菌的篩選鑒定及其固氮能力評估[J].中國農(nóng)學(xué)通報(bào), 2020, 36(9): 100–106.

[38] Mhedbi-Hajri N, Jacques M A, Koebnik R.Adhesion mechanisms of plant-pathogenic xanthomonadaceae//Linke D, Goldman A.Bacterial adhesion: Chemistry, biology and physics[M].Berlin Heidelberg: Springer-Verlag.2011: 71–89.

[39] Choi J, Cha S, Chhetri G, et al.gen.nov., sp.nov., a new member of the family Chitinophagaceae isolated from wetland soil in South Korea[J].Antonie Van Leeuwenhoek, 2019, 112(5): 687–694.

[40] Jaiswal A K, Graber E R, Elad Y, et al.Biochar as a management tool for soilborne diseases affecting early stage nursery seedling production[J].Crop Protection, 2019, 120: 34–42.

[41] Hong S H, Ham S Y, Kim J S, et al.Application of sodium polyacrylate and plant growth-promoting bacterium, Micrococcaceae HW-2, on the growth of plants cultivated in the rooftop[J].International Biodeterioration & Biodegradation, 2016, 113: 297–303.

[42] Xiao M, Zhou X K, Chen X, et al.tabacisoli sp.nov., isolated from rhizosphere soil ofL[J].International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology, 2019, 69(7): 1875–1880.

[43] Hallmann J, Rodr??guez-Kábana R, Kloepper J W.Chitin-mediated changes in bacterial communities of the soil, rhizosphere and within roots of cotton in relation to nematode control[J].Soil Biology and Biochemistry, 1999, 31(4): 551–560.

[44] Spaink H P, Kondorosi A, Hooykaas P J J.The rhizobiaceae: Molecular biology of model plant-associated bacteria[M].Dordretch: Springer Netherlands, 1998: 155–172.

[45] Butterfield N J.Proterozoic photosynthesis - a critical review[J].Palaeontology, 2015, 58: 1–52.

Effects of Different Fertilization Treatments on Bacterial Community in Tobacco-planting Soil

WANG Jue1,2, DU Qin1, PENG Shuang1,3, LIN Xiangui1, WANG Yiming1,2*, LI Junying4, DAI Xun5, XIE Xinqiao5

(1 State Key Laboratory of Soil and Sustainable Agriculture, Institute of Soil Science, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China; 2 University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China; 3 Jiangsu Open University, Nanjing 210036, China; 4Yunnan Academy of Tobacco Agricultural Sciences, Kunming 650021, China; 5 Hongta Tobacco (Group)Co.Ltd, Yuxi, Yunnan 653100, China)

In this study, the changes in soil bacterial community structure, quantity and function were examined by a 3 a fertilization experiment using quantitative PCR and high-throughput sequencing techniques, which included three treatments: organic fertilizer (YJ), inorganic fertilizer (WJ), and the combined application of organic and inorganic fertilizer (YW).The results showed fertilization treatments caused the changes in soil physiochemical properties, specifically, WJ and YJ decreased soil pH, YJ significantly increased soil organic matter content, YW increased available nutrients and soil organic matter content while maintaining soil pH.Additionally, the quantity, community structure and function of soil bacteria also changed, the copy numbers of bacteria 16S rRNA gene in YJ and YW soils were significantly higher than in WJ soil, the alpha diversity of soil bacteria community in YW soil was the highest.Principal coordinate analysis and ANOSIM test further revealed soil pH had greatest influence on soil bacterial community structure.Moreover, some bacterial groups were obviously enriched, YW soil had significantly higher abundances of plant growth-promoting bacteria such as Gemmatimonadaceae, Micrococcaceae and Haliangiaceae.YJ soil had higher abundance of bacteria with nitrogen fixation or biocontrol functions such as Intrasporangiaceae, Xanthomonadaceae, Chitinophagaceae and Burkholderiaceae.Furthermore, YW and YJ increased the abundance of nitrogen-fixing bacteria Rhizobiaceae.Notably, the change in bacterial community structure may further influence bacterial community function, especially, YW can greatly enhance nitrification function of bacterial community.The above findings provide a scientific basis for rational fertilization in tobacco production.

Fertilization; Tobacco-growing soil; High-throughput sequencing; Bacterial community

S154.3

A

10.13758/j.cnki.tr.2021.05.015

王玨, 杜琴, 彭雙, 等.不同施肥處理對植煙土壤細(xì)菌群落的影響.土壤, 2021, 53(5): 998–1007.

云南省煙草公司科技計(jì)劃項(xiàng)目(2017YN06)和紅塔煙草(集團(tuán))有限責(zé)任公司科技項(xiàng)目(S-6016010，S-6019001)資助。

通訊作者(ymwang@issas.ac.cn)

王玨(1995—)，女，安徽馬鞍山人，碩士研究生，主要從事土壤微生物方面研究。E-mail: wangjue@issas.ac.cn