腫瘤靶向Pt-Cu基納米平臺用于近紅外二區光聲成像引導的光熱治療

鄭子良 曲波濤 楊曉榮 劉 玲 張瑞平

(山西醫科大學第三醫院，山西白求恩醫院，山西醫學科學院，太原 030032)

0 引言

惡性腫瘤的全球發病率和死亡率逐年攀升，在許多國家已成為民眾第一大致死原因，嚴重威脅著人類健康[1]。近年來，惡性腫瘤被認為是精準醫療(precision medicine)主要應用的重大疾病之一，利用分子影像技術(molecular imaging)可進行腫瘤的早期診斷與邊界精確化，構建個性化治療，實現對腫瘤的高效精準診療[2]。目前，臨床對于腫瘤治療的方法主要包括手術、化療、放射治療以及免疫治療等，但這些治療方式存在對正常組織器官的損傷、腫瘤治療效果有限、增加腫瘤復發與轉移幾率等諸多不足，嚴重影響腫瘤的診斷與治療效果[3]。

光熱治療(photothermal therapy，PTT)作為一種高效的腫瘤治療手段，由于其侵襲性小和時空選擇性高等優勢在近年來受到廣泛關注[4]。與傳統治療方式相比，PTT具有操作簡單、微創、安全、治療時間短等特點，通過光熱劑將照射激光的光能以非熱輻射形式轉化為熱能，從而實現對腫瘤細胞的有效殺傷[5]。目前已開發用于PTT的納米光熱劑包括有機材料和無機材料2大類[6]，如吲哚菁綠[7]、聚吡咯[8]、多巴胺[9]等有機材料具有良好的光熱性能，但光熱穩定性差，光漂白現象嚴重，限制了其在腫瘤PTT中的應用。因此，科學家將研究重心轉向更加穩定且結構易于控制的無機納米材料，這些材料主要包括金屬納米顆粒(金納米棒[10]、鈀納米片[11]、合金納米顆粒[12]等)、碳納米材料(碳量子點[13]、碳球[14])、半導體納米材料(硫化銅[15]、硫化銀[16])等。無機納米材料擁有生物毒性低、熱穩定性強、光熱靈敏度高、光轉換效率高等優勢，極具臨床應用前景。PTT實現精準治療離不開影像學技術的有效引導。光聲(photo?acoustic，PA)成像作為一種新型的光學成像技術，同樣是利用光熱效應，將光轉化為聲波實現成像[17]。光聲成像結合了光學成像和超聲成像，具有較深的組織穿透性，可以利用高的分辨率精準定位腫瘤、清晰勾勒腫瘤輪廓，從而有效引導光熱治療[18]。特別是第二近紅外區(the second near?infrared window，NIR?Ⅱ，1000～1700 nm)的PA成像，由于該區域人體各組織器官對光子的吸收、散射顯著降低，無背景信號干擾，與常規近紅外一區PA成像相比，有效改善了成像質量，實現了良好的空間分辨率、組織穿透力和高信噪比PA成像性能[19]。因此，利用具有NIR?Ⅱ光學吸收性能的納米藥物可有效結合PA成像與PTT治療性能，實現高效的腫瘤診療一體化作用效果。

理想的NIR?Ⅱ納米光熱劑不僅具備良好的診療性能，還要在腫瘤部位實現有效聚集才能達到最佳效果。眾所周知，由于納米藥物在腫瘤部位的吸收和代謝速率是動態平衡的，只有當沉積量達到一定數量時才能進行診斷和治療[20]。然而，僅利用高滲透長滯留(enhanced permeability and retention，EPR)效應促使納米藥物向腫瘤區域遞送，易出現積累與滯留不足，影響最終的診療效果[21]。因此，如何增強納米藥物在腫瘤部位的有效富集，是提升診療性能至關重要的一項挑戰。惡性腫瘤細胞不受周圍細胞因子影響與機體調控，從而導致形態、細胞代謝、分化能力及組織血供等方面的顯著差異，促使腫瘤區域呈現個性化微環境特性[22]。研究表明，帶正電荷的納米顆粒易于通過特殊的胞吞途徑穿透深層腫瘤，但帶正電的納米粒子在循環期間很容易被內皮網狀系統(reticuloendothelial system，RES)清除，通過表面修飾，可使得納米顆粒在腫瘤微環境作用下，實現電荷翻轉，正電荷特異性表達[23]。基于腫瘤區域諸多特點，研究者致力于開發電荷翻轉的刺激響應型納米平臺，實現腫瘤部位表面電荷和顆粒大小等物理化學性質的響應性改變，以提升納米藥物的靶向性和富集量，減少毒副作用[24]。因此，通過簡單高效的方式將正、負電性優勢結合，開發特異性腫瘤診療藥物極具臨床應用前景。

綜上所述，我們設計并構筑一種腫瘤微環境響應性翻轉表面電荷納米平臺Pt?Cu@PLL@HA(圖1，PLL=聚賴氨酸，HA=透明質酸)，通過腫瘤特異性靶向聚集，實現在NIR?ⅡPA成像引導下對腫瘤的精準NIR?ⅡPTT治療。選取具有良好NIR?Ⅱ光學吸收性能的Pt?Cu合金納米材料作為核相，通過層層(layer?by?layer，LBL)自組裝技術，在其表面依次均勻包覆帶正電荷的PLL和帶負電荷的HA。利用HA的負電性增加納米平臺體內循環過程，結合EPR效應與HA的主動靶向性在腫瘤部位高效富集。由于腫瘤組織中的透明質酸酶(HAase)可將Pt?Cu@PLL@HA外部HA層(-)快速降解，暴露出內部PLL層(+)，納米平臺發生響應性電荷翻轉。帶有正電荷的Pt?Cu@PLL在進入腫瘤細胞過程中，易呈現溶酶體逃逸現象，增加納米平臺的腫瘤細胞攝取量，從而大幅提升腫瘤診療效果，為構筑NIR?Ⅱ診療一體化納米平臺提供新思路。

圖1 Pt?Cu@PLL@HA納米平臺的構筑及其診療機制示意圖Fig.1 Schematic illustration for preparation and therapeutic mechanism of Pt?Cu@PLL@HA nanoplatform

1 實驗方法

1.1 藥品及試劑

聚乙烯吡咯烷酮(PVP，Mw=30 000)、硝酸銅(Cu(NO3)2·3H2O)、六 水 合 氯 鉑 酸 (H2PtCl6·6H2O，37.5%)、甘氨酸、PLL(Mw=150 000)、HA 均購于阿拉丁生化科技有限公司(中國上海)；臺盼藍購于Sigma?Aldrich公司；細胞增殖檢測試劑盒Cell Counting Kit?8(CCK?8)購于博斯特生物技術有限公司。所有試劑均未進行進一步純化。實驗用水為超純水(ρ>18 MΩ)。

1.2 Pt-Cu合金的制備

室溫條件下，將80 mg PVP加入2.5 mL超純水中，充分攪拌至完全溶解，加入預先配制的1 mL H2PtCl6(20 mmol·L-1)溶液和 1 mL Cu(NO3)2溶液(20 mmol·L-1)。隨后，將40.0 mg甘氨酸加入混合溶液中，25℃下高速攪拌30 min，形成均勻的黃綠色溶液。將反應混合物轉移到含有聚四氟乙烯內襯的15 mL高壓反應釜中，在200℃下反應6 h，冷卻至室溫。將混合溶液以4 500 r·min-1的轉速離心，用超純水洗滌3次，固體產物真空冷凍干燥得到Pt?Cu合金。

1.3 Pt-Cu@PLL@HA的制備

采用LBL自組裝技術制備樣品。將5 mL Pt?Cu合金水溶液(2 mg·mL-1)分散于10 mL超純水中，超聲 15 min，滴加 2 mL PLL(10 mg·mL-1)水溶液，在37℃下攪拌1 h，離心收集固體Pt?Cu@PLL。隨后，將得到的Pt?Cu@PLL分散在5 mL去離子水中，緩慢加入10 mL HA(2 mg·mL-1)水溶液。反應1 h后離心收集Pt?Cu@PLL@HA，用超純水洗滌數次，固體沉淀經真空冷凍干燥得到Pt?Cu@PLL@HA。

1.4 表征分析儀器

采用JEM 2100F(200 kV)型透射電子顯微鏡(TEM)對材料的形貌及結構進行分析。使用Rigaku D/max?2500 型衍射儀測定樣品在 5°～80°范圍內的X 射線衍射(XRD)圖，工作條件：CuKα輻射(λ=0.154 059 8 nm)、管電壓50 kV、管電流200 mA、掃描速度 5(°)·min-1。動態光散射(DLS)的尺寸分布和樣品的ζ電位在Malvern電位分析儀上測試。X射線光電子能譜(XPS)的測定使用Thermo?VG Scientific ESCALAB250光譜儀，以AlKα為射線源(150 W)。FT?IR光譜在Vertex PerkinElmer 580 BIR分光光度計(Bruker)上采集，使用KBr壓片進行制樣分析。樣品的UV?Vis光譜采用TU?1901雙光束紫外可見分光光度計(PerkinElmer)測定。熱重-差熱(TG?DTA)分析采用Rigaku的TG 8101D型儀器，在空氣氣氛中以10℃·min-1的加熱速率，從室溫升溫至800℃。

1.5 體外細胞毒性評價

以購自中國科學院(中國上海)的小鼠乳腺癌細胞(4T1)為細胞模型，以RPMI 1640為培養基，在培養基中加入體積分數10%的滅活胎牛血清(FBS)，加入1%雙抗(青霉素/鏈霉素)防止細菌污染。細胞置于細胞培養箱中，在37℃、CO2體積分數5%的氣氛條件下培養。采用標準CCK?8方法分別測定Pt?Cu和Pt?Cu@PLL@HA的體外細胞毒性以及激光照射后細胞殺傷性能。將4T1細胞懸液以每孔8 000個的密度均勻播種在96孔板中，每孔加入100 μL培養液，在37℃、CO2體積分數5%的條件下培養24 h，貼壁后，棄去培養液，向孔中加入100 μL含不同濃度Pt?Cu或Pt?Cu@PLL@HA(0、12.5、25、50、100、200和400 μg·mL-1)的新鮮培養基。孵育 24 h后，去除含有樣品的培養基，加入 10 μL CCK?8 溶液(5 mg·mL-1)與培養液混合，共孵育2 h，使用酶標儀(BioTek Epoch 2)在450 nm處測量吸光度。

對于體外細胞光熱性能分析，將1×105個4T1細胞置于直徑35 mm的培養皿中，培養24 h。經磷酸鹽緩沖鹽溶液(PBS，pH=7.4)沖洗后，用含不同濃度的Pt?Cu或Pt?Cu@PLL@HA(0、12.5、25、50、100、200和 400 μg·mL-1)溶液孵育 4 h。隨后用 PBS 沖洗細胞，并浸泡在300 μL的介質中，在強度為1.0 W·cm-2的1 064 nm激光下照射5 min，細胞在37℃下再培養30 min。加入CCK?8溶液共孵育2 h，通過酶標儀檢測細胞殺傷情況；同樣條件下，采用臺盼藍染色，在熒光顯微鏡下觀察細胞。

1.6 活體PA成像

雌性BALB/c裸鼠(6～8周齡，17～19 g)購自北京維通麗華實驗動物科技有限公司。動物實驗中，所有動物操作規程均符合《中國國家實驗動物管理和使用條例》的標準。動物協議經山西醫科大學機構動物使用與關愛委員會批準(批準號：2016LL141，中國太原)。將小鼠馴化至少7 d后，在小鼠左腿背皮下注射4T1細胞(3×106個)建立瘤模型。當腫瘤體積達到75 mm3以上時，在尾靜脈注射Pt?Cu@PLL@HA材料(15 mg·kg-1)，利用實時多光譜光聲層析成像系統(MSOT)，分別于注射前及注射后 1、4、8、12、24 h麻醉小鼠進行PA成像，研究材料在腫瘤部位的聚集特性。

1.7 活體光熱治療

將荷瘤小鼠隨機分為3組(每組4只)進行不同治 療 ：(1)PBS+laser、(2)Pt?Cu+laser、(3)Pt?Cu@PLL@HA+laser。在尾靜脈分別注射樣品(15 mg·kg-1)，用1 064 nm激光(1.0 W·cm-2)照射整個腫瘤區域5 min。采用紅外熱成像系統監測腫瘤區域平均溫度。用公式(ab)2/2計算腫瘤體積，其中a和b分別表示腫瘤長度和寬度。12 d后，處死所有小鼠，收集腫瘤進行蘇木精和伊紅(H&E)染色。

1.8 統計分析

所有結果均以均數±標準差(S.D.)的形式記錄。采用單因素方差分析進行統計學意義分析。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。

2 結果與討論

2.1 Pt-Cu@PLL@HA的形貌與理化特性

對Pt?Cu@PLL@HA的形貌、結構及物化性能進行分析，如圖2所示。利用水熱合成的Pt?Cu合金納米顆粒(圖2A)呈花簇狀結構，粒徑均一，平均粒度為56.2 nm。通過LBL自組裝過程，在Pt?Cu顆粒表面包覆 PLL 和 HA，從 TEM 圖 可以看出(圖 2B)，Pt?Cu@PLL@HA納米顆粒外部具有明顯的殼層結構包覆，殼層厚度約為10.9 nm，表明利用LBL技術在Pt?Cu顆粒表面成功構筑包覆殼層。Pt?Cu@PLL@HA的元素映射圖(圖2C)顯示所含Pt、Cu元素以及殼層C、N等元素在樣品顆粒中呈現均勻分布。通過XRD對樣品中Pt、Cu元素的存在形式進行分析，由圖2D可以看出，在41.1°、47.7°、69.3°處出現的特征衍射峰介于金屬Pt(PDF No.04?0802)與金屬Cu(PDF No.04?0836)的衍射峰之間，表明 Pt?Cu 是合金相。經PLL和HA修飾后，Pt?Cu晶體結構未發生改變，說明Pt?Cu合金具備良好的穩定性，有利于生物活體應用。進一步，利用XPS探究Pt?Cu@PLL@HA中Pt、Cu元素的價態。圖2E為樣品的Pt4f能級光譜，結合能為70.65和74.06 eV處的吸收峰分別對應Pt0的Pt4f7/2和Pt4f5/2軌道[25]。71.67和75.06 eV處出現的較弱吸收峰是表面Pt氧化導致。此外，由于樣品中含有Cu元素，出現在75.74 eV的吸收峰可歸屬于Cu3p峰。圖2F為Pt?Cu@PLL@HA的Cu2p譜圖，分析表明，在932.13和951.85 eV處的峰與Cu02p峰相吻合[26]。由此證明樣品中 Pt、Cu元素以 Pt?Cu合金形式存在。

圖2 (A)Pt?Cu與(B)Pt?Cu@PLL@HA的TEM圖;(C)Pt?Cu@PLL@HA的元素映射圖像;Pt?Cu@PLL@HA的(D)XRD圖、(E)Pt4f和(F)Cu2p的XPS譜圖Fig.2 TEM images of(A)Pt?Cu and(B)Pt?Cu@PLL@HA;(C)Corresponding elemental mappings of Pt?Cu@PLL@HA;(D)XRD patterns,high?resolution XPS spectra of(E)Pt4f and(F)Cu2p of Pt?Cu@PLL@HA

2.2 Pt-Cu@PLL@HA的構筑分析和響應性能

Pt?Cu@PLL@HA的合成是利用正負電荷間相互作用的LBL技術，由于Pt?Cu合金帶負電荷，通過靜電結合，將帶正電性的PLL和帶負電性的HA依次包覆在Pt?Cu納米顆粒上。在LBL包覆過程中對樣品進行ζ電位和粒徑分析。由圖3A可知，通過PLL的包覆，樣品的ζ電位從-5.5 mV翻轉為Pt?Cu@PLL的22.6 mV，隨后再次翻轉至Pt?Cu@PLL@HA的-37.9 mV。通過逐級包覆樣品的顆粒尺寸(流體力學直徑)逐漸增大，從Pt?Cu合金的粒徑64.6 nm增大至Pt?Cu@PLL@HA 的80.22 nm(圖3B)，充分證明PLL和HA依次成功包覆在Pt?Cu合金顆粒表面。此外，Pt?Cu@PLL@HA的顆粒尺寸使得樣品具有良好的EPR效果，有利于樣品在腫瘤部位的高效富集[27]。進一步對Pt?Cu@PLL@HA的穩定性進行分析(圖3C)，分別在水、PBS、生理鹽水和RPMI 1640培養基中孵育24 h后，Pt?Cu@PLL@HA保持膠體穩定性，粒徑與ζ電位未發生明顯變化，這表明Pt?Cu@PLL@HA具有良好的生理穩定性和長血液循環性能。當樣品進入腫瘤微環境，樣品外部的HA被腫瘤組織中的HAase快速降解，樣品內部的PLL暴露，發生電荷翻轉。Pt?Cu@PLL@HA在模擬腫瘤微環境HAase的作用下(圖3D)，樣品粒徑與電位發生明顯變化，隨著外表面HA的降解，樣品表面電位向正電荷方向變化，反應180 min后ζ電位增大為19.31 mV，粒徑減小至65.01 nm，表明在腫瘤部位樣品表面的HA可有效降解，釋放內部Pt?Cu@PLL納米顆粒。

圖3 Pt?Cu、Pt?Cu@PLL和Pt?Cu@PLL@HA的(A)ζ電位和(B)流體力學直徑;(C)Pt?Cu@PLL@HA在水、PBS、生理鹽水和RPMI 1640培養基中24 h后的流體力學直徑和ζ電位;(D)HAase作用下Pt?Cu@PLL@HA的流體力學直徑和電位變化Fig.3 (A)ζ potentials and(B)hydrodynamic diameters of Pt?Cu,Pt?Cu@PLL and Pt?Cu@PLL@HA;(C)Hydrodynamic diameters and ζ potentials of Pt?Cu@PLL@HA in water,PBS,saline and RPMI 1640 medium after 24 h;(D)Hydrodynamic diameter and ζ potential changes of Pt?Cu@PLL@HA

2.3 Pt-Cu@PLL@HA的光熱性能

圖4 A為Pt?Cu@PLL@HA的吸收光譜圖。Pt?Cu@PLL@HA在600～1 400 nm范圍存在廣譜光吸收能力，特別是在1 000 nm之后的NIR?Ⅱ依舊保持較高的光吸收強度，表明Pt?Cu@PLL@HA可作為光熱腫瘤治療潛在的候選材料。基于良好的吸光性能，將不同濃度的Pt?Cu@PLL@HA溶液(25、50、100、200 和 400 μg·mL-1)分別在 1 064 nm(1.0 W·cm-2)近紅外激光下照射5 min，分析材料的光熱性能。如圖4B所示，當Pt?Cu@PLL@HA溶液在激光照射下，即使在低濃度(25 μg·mL-1)時溫度也會迅速升高，而純水在照射后溫度變化可忽略不計。并且隨著Pt?Cu@PLL@HA濃度提高，其升溫速率不斷增加，表明Pt?Cu@PLL@HA的光熱效應具有濃度依賴性。此外，從紅外熱像圖(圖4C)也可直觀地看出Pt?Cu@PLL@HA在不同條件下的升溫差異。眾所周知，納米光熱劑的光熱穩定性是其未來應用的關鍵[28]。 將 Pt?Cu@PLL@HA 溶 液 (400 μg·mL-1)在1 064 nm激光開/關循環照射5次后，檢測其光熱穩定性(圖4D)。5次循環過程中升溫效果沒有明顯的偏差，光熱性能也沒有明顯的衰退，表明Pt?Cu@PLL@HA納米材料具有優異的光熱穩定性。綜上分析，Pt?Cu@PLL@HA在NIR?Ⅱ的1 064 nm激光照射下表現出良好的光熱特性，表明此材料適合作為NIR?Ⅱ納米光熱劑實現腫瘤高效光熱治療。

圖4 (A)Pt?Cu@PLL@HA的吸收光譜圖;不同濃度Pt?Cu@PLL@HA溶液(0、25、50、100、200和400 μg·mL-1)在1 064 nm(1 W·cm?2)激光照射300 s的(B)升溫曲線圖和(C)熱成像圖;(D)Pt?Cu@PLL@HA的光熱穩定性Fig.4 (A)Absorption spectra of Pt?Cu@PLL@HA;(B)Photothermal heating curves and(C)infrared thermal images of Pt?Cu@PLL@HA solution with different concentrations(0,25,50,100,200 and 400 μg·mL-1)under laser irradiation(1 064 nm,1 W·cm-2)as a function of time(0?300 s);(D)Photothermal stability of Pt?Cu@PLL@HA

2.4 Pt-Cu@PLL@HA的細胞毒性

采用CCK?8法檢測Pt?Cu@PLL@HA對人臍靜脈內皮細胞(HUVEC)和4T1細胞(小鼠乳腺癌細胞)的細胞活性影響。如圖5A所示，即使在高濃度Pt?Cu@PLL@HA(400 μg·mL-1)中孵育 24 h 后，細胞活力仍保持在95%以上，表明Pt?Cu@PLL@HA細胞毒性較低，具有良好的生物相容性?；谝陨霞毎拘?，利用1 064 nm激光輻照，分析Pt?Cu和Pt?Cu@PLL@HA對4T1細胞的殺傷性能。圖5B表明，Pt?Cu@PLL@HA孵育的4T1細胞存活率明顯低于Pt?Cu處理組，并且2組細胞存活率隨溶液濃度增加變化趨勢基本一致，這一現象說明聚合物包覆可有效提升細胞對材料的攝取量，并且包覆層對Pt?Cu光熱性能影響較小。利用臺盼藍細胞染色觀察Pt?Cu和Pt?Cu@PLL@HA在1 064 nm激光照射下的細胞活性(圖5C)。Pt?Cu@PLL@HA組細胞無明顯死亡，細胞存活率高，這與圖5A的CCK?8細胞活性相吻合，進一步證實該材料良好的細胞相容性。在1 064 nm激光照射下，Pt?Cu@PLL@HA+Laser組細胞的死亡率明顯高于Pt?Cu+Laser組，呈現出大量細胞死亡現象，表明Pt?Cu@PLL@HA是一種極具應用前景的NIR?Ⅱ光熱劑。

圖5 (A)不同濃度Pt?Cu@PLL@HA分別孵育HUVEC和4T1細胞的存活率;(B)經不同濃度的Pt?Cu和Pt?Cu@PLL@HA孵育4T1細胞后在1 064 nm(1 W·cm-2)激光照射5 min下的細胞活性;(C)不同樣品與4T1共孵育后分別進行1 064 nm(1 W·cm-2)的激光照射,通過臺盼藍染色死細胞;***P<0.001Fig.5 (A)HUVEC and 4T1 cell viabilities after incubation with Pt?Cu@PLL@HA with various concentrations;(B)Cell viability of 4T1 cells after incubation with Pt?Cu and Pt?Cu@PLL@HA under laser irradiation(1 064 nm,1 W·cm-2,5 min);(C)Micrographs of 4T1 cells incubated with the samples before or after irradiation with 1 064 nm laser(1 W·cm-2),where dead cells are stained with trypan blue;***P<0.001

2.5 Pt-Cu@PLL@HA的光聲成像

通過體外分析Pt?Cu@PLL@HA的PA信號評價其光聲特性。如圖6A所示，觀察到在1 064 nm處PA強度與Pt?Cu@PLL@HA濃度呈線性關系，隨著溶液濃度的提升，PA信號呈上升趨勢，表明對體內Pt?Cu@PLL@HA濃度定量分析的可行性。基于以上結果，對4T1荷瘤小鼠進行Pt?Cu@PLL@HA尾靜脈注射(15 mg·kg-1)，在注射前后不同時間點(0、1、4、8、12和24 h)監測Pt?Cu@PLL@HA活體PA成像性能。圖6C中腫瘤區域PA信號隨著時間的推移逐漸增強，在整個腫瘤內的對比度明顯高于周圍組織，并在給藥后12 h達到最佳聚集效果，給藥24 h腫瘤部位的光聲強度逐步減弱。此外，通過對PA信號的半定量分析(圖6B)，給藥后12 h腫瘤部位的PA強度約為給藥前的13.4倍，進一步證明Pt?Cu@PLL@HA可作為一種優異的PA成像劑，其能夠有效識別腫瘤區域，指導診斷和治療。

圖6 (A)不同濃度Pt?Cu@PLL@HA的PA強度;4T1荷瘤鼠靜脈注射Pt?Cu@PLL@HA后在1 064 nm激光照射下不同時間點的(B)PA強度變化和(C)活體PA成像Fig.6 (A)PA intensities of Pt?Cu@PLL@HA with different concentrations;(B)PA intensity changes and(C)PA imaging of 4T1 tumor?bearing mice after Pt?Cu@PLL@HA injection under 1 064 nm laser irradiation

2.6 Pt-Cu@PLL@HA活體光熱治療

為進一步闡明Pt?Cu@PLL@HA的活體PTT療效，分別對 4T1 荷瘤鼠進行 PBS、Pt?Cu 和 Pt?Cu@PLL@HA三種尾靜脈給藥，根據PA成像的最佳滯留時間，給藥12 h后對腫瘤部位進行1 064 nm(1 W·cm-2)激光照射5 min，用熱成像技術評價體內抑瘤效果。如圖7A和7B所示，PBS對照組的腫瘤部位僅觀察到微小的溫度變化；而Pt?Cu組和Pt?Cu@PLL@HA組在相同的激光照射下，最終溫度分別升高至47.68和51.89℃，Pt?Cu@PLL@HA在所有光熱輻照時間點上都表現出最高的溫度值，這表明樣品由于包覆層在腫瘤微環境的HA特異性降解與PLL的細胞高效攝取，有效提升了腫瘤區域的富集量，增強了光熱治療性能。持續監測PTT治療Pt?Cu和 Pt?Cu@PLL@HA 組小鼠(圖 7C)，Pt?Cu@PLL@HA組表現出良好的熱消融作用，光熱治療小鼠12 d后腫瘤成功消除；而Pt?Cu組小鼠出現明顯的腫瘤復發現象，光照治療區域出現火山形瘤體。經Pt?Cu@PLL@HA 光熱治療后(圖 7D)，荷瘤鼠腫瘤體積顯著減小，表現出優異的腫瘤抑制效果。此外，3組治療小鼠體重12 d內均無明顯下降趨勢(圖7E)，進一步證明Pt?Cu@PLL@HA良好的生物相容性和生物安全性。圖7F為3組治療小鼠腫瘤組織H&E分析，Pt?Cu@PLL@HA光熱治療后，腫瘤組織遭到破壞，呈現明顯的細胞凋亡，表明Pt?Cu@PLL@HA在NIR?Ⅱ光照條件下具備高效的PTT治療效果，有效消融癌細胞。此外，Pt?Cu@PLL@HA光熱治療后，小鼠的主要器官(包括心、肝、脾、肺和腎)未見明顯壞死或生理形態變化(圖7G)。綜上所述，Pt?Cu@PLL@HA具有較高的腫瘤富集與攝取能力，可實現高效的NIR?Ⅱ光熱治療性能。

圖7 4T1荷瘤鼠靜脈注射PBS、Pt?Cu或Pt?Cu@PLL@HA后對腫瘤區域激光輻照(1 064 nm,1 W·cm-2)的(A)紅外熱成像和(B)腫瘤溫度變化曲線;(C)光熱治療后不同治療組的小鼠照片;各治療組小鼠(D)腫瘤體積和(E)體重隨時間的變化圖;(F)治療結束后收集小鼠腫瘤組織的H&E染色;(G)Pt?Cu@PLL@HA治療組小鼠主要器官的H&E染色圖像;標尺:100 μm;***P<0.001Fig.7 (A)IRT images and(B)corresponding temperature curves of 4T1 tumor?bearing mice injected with PBS,Pt?Cu or Pt?Cu@PLL@HA under laser irradiation(1 064 nm,1 W·cm-2);(C)Representative photographs of mice of different groups after PTT;(D)Tumor volume and(E)body weight of mice from different groups after PTT;(F)H&E staining of the tumor tissues collected from mice at the end of treatment;(G)H&E?stained images of major organs collected from mices in Pt?Cu@PLL@HA group;Scale bar:100 μm;***P<0.001

3 結論

基于Pt?Cu納米合金良好的NIR?Ⅱ吸收性能，通過LBL技術構筑可在腫瘤部位高效富集的Pt?Cu@PLL@HA納米平臺，實現NIR?Ⅱ PA成像引導下的精準NIR?ⅡPTT腫瘤治療。通過表征手段對Pt?Cu@PLL@HA納米平臺的顆粒形貌、元素存在形式、體外響應效果以及NIR?Ⅱ光熱性能進行系統性分析，表明Pt?Cu@PLL@HA具有理想的光熱效應與生物相容性?；贖A層在腫瘤區域的降解特性，促使PLL層(+)暴露，發生電荷翻轉，增加腫瘤細胞攝取量。進一步通過一系列細胞、活體實驗證實，相比Pt?Cu納米顆粒，Pt?Cu@PLL@HA能夠有效進入腫瘤細胞，實現高效腫瘤熱消融效果。