蛋雞J亞型禽白血病病毒與大腸桿菌共感染的診斷

張世成，嚴天行，袁世玉，成子強

（山東農業大學動物醫學院，山東 泰安 271018）

禽白血病（Avianleukosis, AL）是由禽白血病病（Avian Leukosis Virus, ALV）引起的禽多種腫瘤性疾病的統稱[1]。根據囊膜糖蛋白的不同，ALV可以分為A-K等11個亞群，其中A、B、J亞群是最常分離到的病毒[2]。AL可以通過水平和垂直方式傳播，可以誘導雞的淋巴細胞瘤、髓樣細胞瘤、血管內皮細胞瘤以及其他形式的腫瘤[3]。盡管許多種禽公司實施了多年的檢疫和凈化，但ALV仍在商品代雞呈亞臨床感染狀態存在，不僅影響雞群的生產性能，而且導致免疫抑制，易繼發其他致病原的共感染。J亞群禽白血病病毒（Subgroup J Avian Leukosis Virus, ALV-J）是20世紀80年代從肉用型雞中分離鑒定的新亞群，主要引起肉用型雞的髓細胞瘤[2]。20世紀90年代，ALV-J在全球范圍內廣泛傳播，并對全球家禽業造成巨大的損失[3]。杜巖[4]等首次從我國大型肉用型種雞場分離鑒定出ALV-J，2004年中國首次報道蛋雞自然感染ALV-J[5]。近年來，禽病的發生和流行特點往往表現為多病原性，常見表 現為病毒病和細菌病的共感染[6]。大腸桿菌病是部分或全部由禽致病性大腸桿菌（Avian Pathogenic E. Coli,APEC）所引起的局部或全身性感染的疾病，給養禽業造成了嚴重的經濟損失[7]。

內蒙古某養殖合作社送檢一批海蘭褐蛋雞，該養殖合作社為全自動現代化籠養，養殖規模30萬只。發病雞產蛋高峰期產蛋率下降至20 %，死亡率30 %，出現精神沉郁，虛弱，縮頸嗜睡，消瘦，排白色稀狀糞便，雞冠發白。為了明確病因，本研究對該批病雞采用大體剖檢、血象學、細菌學、病理組織學、分子生物學及病原學方法對該場發病雞進行系統檢測與分析，確診為J亞型禽白血病病毒與大腸桿菌共感染，為揭示兩者之間致病的關聯性和兩者共感染導致的ALV-J致病特征提供了依據和參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病料來源與樣品采集 內蒙古某父母代種 雞場送檢的海蘭褐蛋雞，分別無菌采取心臟、肝臟、肺臟、腎臟、脾臟、小腸等器官置于1.5 ml離心管中，用手術剪將病變明顯的組織固定于10%福爾馬林溶液中。

1.1.2 主要試劑與實驗器材 2×Accurate Taq預混液購自寶生物（大連）生物科技有限公司；組織DNA提取試劑盒（購于天根生物科技有限公司）；組織RNA提取試劑盒（購于天根生物科技有限公司）；血瓊脂平板購自于江門市凱林貿易有限公司；光學顯微鏡和數碼成像系統購自奧林巴斯公司；石蠟切片機購于德國徠卡公司；電熱恒溫干燥箱購自江蘇吳淞五金廠；PCR儀購自賽默飛世爾公司；電子天平購自上海精天電子儀器有限公司；生物安全柜購自上海博訊醫療器械公司；電泳儀購自上海市六一儀器廠。

1.2 方法

1.2.1 臨床觀察 將病雞自然平放在地上，安靜自然地觀察其精神狀態、飲食飲水、運動情況及糞便形態等。

1.2.2 血象學觀察 將病雞固定好，用1 ml注射器從翅下采血，滴一滴于載玻片上，用輕柔的力量迅速均勻推出，形成一薄層，自然晾干，瑞氏姬姆薩染色，顯微鏡觀察。

1.2.3 ELISA-P27病原學檢測 采集病雞泄殖腔棉拭子，按照IDEXX ALV-P27抗原檢測試劑盒步驟進行ELISA抗原檢測。

1.2.4 大體剖檢與病理組織學觀察 無菌采取心臟、肝臟、腎臟、胸腺、法氏囊、脾臟和小腸等，并將病健交界處的組織固定于10%福爾馬林溶液中，然后經二甲苯透明后進行浸蠟、包埋、冷卻、切片，最后將切片進行烘干和HE染色，將染色好的組織切片置于顯微鏡下進行組織學觀察。

1.2.5 細菌分離與鑒定 將接種環置于火焰外焰灼燒，將組織用烙鐵燙一區域，切開一小口，無菌取病料劃線接種于血瓊脂平板培養基上，于37 ℃ 培養箱培養24 h，挑取單個菌落接種到營養肉湯培養基上，搖菌至菌液渾濁，提取菌液DNA，16S rRNA 鑒定引物進行PCR擴增。反應體系25 μl：2×Accurate Taq Mix 12.5 μl，上游引物0.5 μl，下游引物0.5 μl，樣品1 μl，ddH2O 10.5 μl。PCR反應條件為：95 ℃ 預變性5 min；95 ℃ 變性30 s，55 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸120 s，共35個循環；72 ℃ 延伸10 min。將PCR擴增后陽性樣品送至華大生物工程有限公司測序，將測序回來的序列結果與NCBI GenBank的參考序列進行BLAST分析驗證。

1.2.6 常見病毒的分子生物學檢測 采集黃豆狀大小的肝臟、脾臟、腎臟等，研磨成細胞懸液后，分別進行DNA和RNA提取，并把RNA逆轉錄為cDNA，使用HEV、REV、MDV、IBDV、AIV（H9N2）、ALV-A、ALV-B和ALV-J引物進行PCR擴增，以合成的cDNA和DNA為模板進行PCR擴增（引物如表1所示）。PCR反應體系及反應條件同上，PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測分析。

2 結果與分析

2.1 臨床觀察與大體剖檢結果

臨床觀察病雞精神沉郁，縮頸嗜睡，消瘦，排白色稀狀糞便，無法站立，雞冠發白。剖檢觀察主要表現為：雞肝臟腫大破裂；腎臟淡灰色腫脹；輸卵管充血，內有大量干酪樣滲出物填充整個輸卵管；脾臟和卵巢萎縮（圖1）。

圖1 臨床和大體剖檢觀察結果 A.輸卵管充血腫脹；B.腎臟呈淡灰色腫脹；C.肝臟腫脹破裂；D.脾臟萎縮； E.輸卵管填充的黃色干酪狀物質；F.病雞精神沉郁、縮頸嗜睡

2.2 血象學檢查結果

血象學檢查可見血液中幼稚紅細胞、單核細胞、淋巴細胞、異嗜性粒細胞、粒性髓細胞和成紅細胞增多（圖2）。

圖2 血象學檢查結果 A.單核細胞和淋巴細胞增多；B.淋巴細胞增多；C.成紅細胞和粒性髓細胞增多；D為異嗜性粒細胞減少； E.淋巴細胞、骨髓成紅細胞和異嗜性粒細胞增多；F.成紅細胞和成髓細胞增多

2.3 病原學檢測

P27 ELISA病原學檢測結果顯示1-3號病雞檢測為肛拭子ALVp27抗原陽性，4號病雞檢測為肛拭子ALVp27抗原陰性，5號病雞判定為可疑（表2）。

表2 ELISA病原學檢測

2.4 病理組織學觀察結果

病理組織學觀察病雞肝細胞顆粒變性、壞死，淋巴細胞和異嗜性粒細胞浸潤，血管內和血管外集聚有大量的成髓細胞，腸絨毛上皮細胞脫落以及脾臟淋巴細胞和網狀細胞發生流失、透明變性和壞死（圖3）。

圖3 病理組織學觀察結果 A.雞肝細胞顆粒變性、壞死，肝細胞腫脹，肝竇間隙充盈大量紅細胞；B.雞肝臟淋巴細胞浸潤變性壞死區； C.雞脾臟淋巴細胞和網狀細胞脾臟大量流失，發生透明變性和壞死；D.雞小腸腸絨毛上皮細胞脫落明顯；E.雞肝臟局部肝竇空隙充滿大量紅細胞，肝細胞變性壞死區明顯；F.雞脾臟淋巴細胞和網狀細胞透明變性、壞死

2.5 細菌分離鑒定結果

2.5.1 細菌培養結果 細菌分離培養觀察到主要為灰白色、圓形、透明、表面光滑、邊緣整齊、露珠狀的菌落，經鑒定菌株為大腸桿菌（圖4）。

圖4 細菌培養結果

2.5.1 細菌序列比對結果 將菌液DNA經細菌16S rRNA 通用引物進行PCR擴增后，將擴增后的產物送華大生物工程公司進行測序，序列回來的結果與NCBI GenBank已發布的參考序列進行BLAST分析，結果顯示分離的菌株與大腸桿菌ST95-32株和OW1E2株同源性為100 %，結合臨床觀察、大體剖檢、血象學和病理組織學結果確定大腸桿菌是引起發病的致病菌。

2.6 PCR鑒定結果

根據大體剖檢、血象學和病理組織學結果，懷疑是戊肝病毒或禽流感病毒或免疫抑制病毒與細菌病混合感染，因此將HEV、REV、MDV、IBDV、AIV（H9N2）、ALV-A、ALV-B、ALVJ、ALV-E和ALV-K進行PCR或RT-PCR擴增，結果顯示病雞HEV、REV、MDV、IBDV、AIV（H9N2）、ALV-A、ALV-B、ALV-E和ALV-K為陰性，ALV-J呈陽性。將凝膠切下送華大生物工程有限公司進行測序，用DNA Star軟件進行序列比對分析，結合病理組織學結果、大體剖檢結果、血象結果分析及測序比對結果確診病雞為ALV-J感染（圖5）。

圖5 常見病原的PCR檢測結果

2.7 ALV-J env發育進化樹分析

將 ALV-Jenv擴增序列在 NCBI進行BLAST，應用DNAStar基因分析軟件，對測序結果進行核苷酸序列剪切、拼接。應用MEGA分析軟件，將擴增拼接后的ALV env保守序列與GenBank中已公開的ALVenv保守序列進行系統發育分析，用Neighbor-joining生成系統發育樹，用Bootstrap值來評估進化樹的可靠性。結果顯示均有5株ALV env保守序列同源性較低，其中兩株ALVenv保守序列同源性較高，可能同一毒株在不同個體產生了變異（圖6）。

圖6 ALV-Jenv系統發育進化樹分析

3 討論

禽白血病是由禽白血病病毒（ALV）引起的一種腫瘤性免疫抑制病，J亞群ALV（ALV-J）不僅可以引起雞的髓樣細胞瘤等原發感染，也可以引起免疫抑制，繼發其他病原的共感染。本研究對內蒙古某海蘭褐父母代發病蛋雞進行了系統檢測、分析，最終確診為ALV-J與大腸桿菌的共感染，這為揭示兩者之間致病的關聯性和兩者共感染導致的ALV-J致病特征提供了依據和參考。

本研究從臨床發病的蛋雞分離到5株ALVJ。對發病雞場調查發現，5株ALV-J來自三個不同雞舍，同源性較高的毒株來自同一雞舍，同源性相近的ALV-J株可能是同一毒株在不同個體適應性不同而發生了變異。經調查該發病雞場養殖模式為全封閉全自動籠養，因此推測病雞很可能是引種時沒有注重檢測，使得雛雞帶毒，且在生長過程中處于亞臨床感染狀態，環境或其他因素使得機體抵抗力降低，從而造成了ALV-J的增殖和廣泛傳播。

臨床和大體剖檢結果發現，肝臟和腎臟腫大破裂，輸卵管填充大量黃色干酪狀物質；血象學觀察發現，成紅細胞、粒性髓細胞、淋巴細胞和異嗜性粒細胞增多；病理組織學觀察發現，肝臟和腎臟有粒性髓細胞的增生，脾臟淋巴細胞發生流失和壞死，表明病雞存在免疫抑制病毒與細菌的共感染。進一步分析發現，粒性髓細胞的大量增生引起肝臟和腎臟的腫大破裂，ALV-J引起的免疫抑制導致大腸桿菌的致病性增強，而大腸桿菌的原發感染使得機體處于免疫功能低下的狀態，從而導致ALV-J由亞臨床感染到大量暴發的過程，進一步降低了機體的免疫功能，從而增強了兩者的致病性，說明兩者之間存在相互增強的關聯。驗證試驗發現，通過將分離到的大腸桿菌液腹腔接種3只1日齡SPF雞，發現雛雞精神狀態良好，采食飲水正常，僅1只雛雞排白色稀狀糞便，這表明ALV-J與大腸桿菌的共感染增強了大腸桿菌的致病性。

近年來禽病的發生和流行特點往往表現為多種病原混合感染的現象[8-13]。臨床生產中需要重視和加強免疫抑制病毒和細菌病的防控。目前未有有效的疫苗預防ALV-J的發生，防控該病的關鍵是加強對免疫抑制性病毒的檢測，不斷剔除雞群中陽性雞，從而實現種群凈化[14]。除了加強對免疫抑制性病毒的檢測外，還應加強飼養管理，做好預防雛雞的早期感染，嚴格執行消毒制度，避免雞群發生繼發感染，提高雞群的抵抗力等措施[14-17]。

4 結論

本研究分別從臨床觀察、大體剖檢、血象學、病理組織學、病原學、細菌學和分子生物學等角度對病雞進行了系統的檢測分析，確診該病雞群為ALV-J與大腸桿菌混合感染，對于禽大腸桿菌和ALV-J之間是否存在一定的規律和相互增強致病的關聯性還需后續進一步研究。