一株蚯蚓腸道固氮菌的分離及鑒定

梁 珍，李林輝

(西華師范大學生命科學學院，四川 南充 637002)

氮素是土壤中利于植物生長的營養元素之一，氮素缺乏將會導致植物葉綠素、蛋白質、酶等化合物合成減少，抑制光合作用并影響植物生長[1]。土壤中可利用的氮素十分有限，不能最大限度滿足作物的高產需求。施用化學氮肥是目前提高土壤含氮量最普遍的方法，但其過多的施用會導致地下及地表水污染，破壞河流生態環境，還會使得土壤酸化，導致土壤養分大量流失，除此之外還會通過反硝化作用增加N2O的量，加劇溫室效應[2]。與施用化學氮肥相比，生物固氮的安全性及有效性更高，有利于土壤的安全性及農業的可持續發展[3]。目前生物固氮微生物類群很多，除了根瘤菌依賴于豆科作物外[4]，其他固氮菌的固氮能力嚴重依賴于環境條件，環境不適宜時，很難有預期的效果。然而動物腸道內環境穩定，如果有固氮能力，效果是可預期的。蚯蚓作為“土壤生態系統工程師”，不僅對土壤生物修復及物質循環有重要作用，其腸道獨特的厭氧狀態和豐富的營養物質也為厭氧和兼性厭氧菌提供了有利的微環境。有研究報道蚯蚓腸道內含有固氮菌[5]，但對其種類、固氮效果等鮮有報道。因此研究蚯蚓腸道固氮菌，對蚯蚓腸道內固氮微生物的開發與利用具有重要意義。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 蚯蚓來源 采集自西華師范大學校園。

1.1.2 培養基Ashby無氮培養基參考《一株固氮菌的篩選、鑒定及混菌發酵制備復合型菌糠菌肥的研究》[6]。

1.2 方法

1.2.1 蚯蚓腸道固氮菌的分離 參考李森楠等人的操作方法[7]。略有改動，獲得蚯蚓腸道內容物后將其接種于Ashby無氮培養基，25℃恒溫培養，待長出菌落后，挑取生長最旺盛的單菌落繼續純化培養，共轉接四次，最終獲得一株純化菌株，將其命名為006。

1.2.2 固氮菌的鑒定 形態學鑒定：在培養基中觀察菌株菌落形態，并在顯微鏡下觀察菌株菌體形態。

生理生化鑒定：對分離出的菌株進行革蘭氏染色，運動性實驗，接觸酶實驗，甲基紅試驗，含碳化合物(甘露醇，鼠李糖，麥芽糖，半乳糖)的利用試驗，明膠液化實驗，淀粉水解實驗，葡萄糖發酵實驗，纖維素分解實驗[8]。

分子鑒定：提取分離菌株006全基因組DNA，以其為模板，用引物27F(5-’AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’)和1492R(5’-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3’)擴增16SrDNA，用引物P1(5’-GGCTGCGATCCVAAGGCCGAYTCVACCCG-3‘)和P2(5’-CTGVGCCTTGTTYTCGCGGATSGGCATGGC-3’)擴增固氮酶nifH基因[9]。擴增產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司進行測序。

固氮酶基因nifH檢測：將引物P1、P2擴增到的產物測序結果在NCBI網站上進行比對。

固氮菌16SrDNA 片段序列分子系統學分析：將引物27F、1492R擴增到的產物測序結果在NCBI網站上進行比對，并選取相似度高的菌株以及同一菌群內知名度高的菌株作為參考菌株，用 MEGA 7.0構建系統發育建樹，其分析方法采用鄰接法(NJ)。

2 結果與分析

2.1 固氮菌的經典鑒定

形態學特征：細菌006在Ashby無氮培養基上生長良好，菌落呈圓形、白色、半透明、光滑、濕潤、易挑取，光學顯微鏡下菌體呈短桿狀，單個排列。

生理生化特性分析：見表1。

表1 生理生化特征分析

根據以上實驗結果，結合《常見細菌系統鑒定手冊》[8]，初步鑒定該菌屬于克雷伯氏菌屬。

2.2 nifH基因檢測

以細菌006總DNA為模板，擴增nifh基因，擴增出大約300bp的片段，測序結果在NCBI網站上比對發現，該片段序列與Klebsiella sp. TD153S 固氮酶還原酶基因(nifH)相似性達100%，可以確定該菌含固氮酶nifH基因，該菌屬于固氮菌。

2.3 固氮菌16SrDNA 片段序列分子系統學分析

用引物擴增固氮菌006 16SrDNA序列，擴增出1300bp左右的片段，測序結果在NCBI網站上比對發現，其與Klebsiella variicola(NR_025635.1)親緣關系最近，其相似性為100%，結合形態學分析及生理生化特征分析， 將該固氮菌鑒定為變棲克雷伯氏菌(Klebsiella variicola)。用 MEGA 7.0 軟件構建系統發育樹如圖1所示。

圖1 固氮菌16SrDNA系統進化樹

3 討論

蚯蚓作為生態系統中的分解者及消費者，與土壤密切相關，土壤為蚯蚓提供棲息地，而蚯蚓的日常活動改善土壤的結構、滲透性、能量流動和養分轉化[10]。蚯蚓腸道菌在維持蚯蚓的新陳代謝、對環境中營養物質和污染物的轉化方面發揮著關鍵作用[5]。Biswas等人從蚯蚓腸道中分離出的巨大芽孢桿菌菌株、地衣芽孢桿菌菌株和溶血葡萄球菌菌株能通過使重金屬離子和磷酸鹽形成復合物來降低Cu2+和Zn2+的毒性[11]。Huerta等人則發現蚯蚓腸道內含有可分解微塑料的細菌，如厚壁菌門細菌、芽孢桿菌和放線菌，它們通過將微塑料當做碳源來代謝低密度聚乙烯、聚丙烯和聚氯乙烯[12]，從而對微塑料污染物進行降解。而本文從校園土壤蚯蚓腸道中獲得的固氮菌——變棲克雷伯氏菌，歸屬于變形菌門克雷伯氏菌屬，兼性厭氧，具有固氮作用。該類細菌屬于聯合固氮菌，不僅在固氮方面發揮重要作用，在溶磷、解鉀、生物防治、作為鐵載體及環境污染物降解等方面都有重要作用[13]，并被廣泛應用于甘蔗[14]、禾麥苗[15]的聯合固氮中。此前也有從環境中分離得到變棲克雷伯氏菌[16]的例子，但環境的不穩定會對細菌的活力和聯合固氮力有影響。本文的固氮菌是從蚯蚓腸道中分離得到的，我們驗證了它的固氮能力并確定了它的分類學地位，為以后將固氮菌回植到蚯蚓腸道中，使其發揮穩定的固氮能力打下了基礎。今后我們還需進一步探索變棲克雷伯氏菌的固氮能力以及將其回植到蚯蚓腸道內的可行性、最佳接種量、最佳接種條件等。