雷公藤甲素對GSDME依賴性肝癌細胞焦亡的影響*

程 希，周淑萍，何 杰

（1.中國科學技術大學附屬第一醫院，安徽 合肥 230001；2.安徽理工大學基礎醫學院，安徽 合肥 232001；3.東南大學附屬中大醫院，江蘇 南京 210009）

肝癌是一種肝臟惡性腫瘤，是目前臨床最為常見的腫瘤之一，可分為原發性和繼發性兩大類。研究發現，每年新發肝癌患者在腫瘤發病中高居第5位[1]。不幸的是，大多數肝癌患者均在晚期被確診，缺乏早期有效治療。目前臨床上抗肝癌藥物主要是以化療藥物為主，可能產生不良反應和毒副作用，嚴重影響患者的生活質量[2]。因此，尋找低細胞毒性且有效的抗肝癌藥物尤為重要。

雷公藤是衛矛科雷公藤屬植物，藥理學作用主要包括抗炎、抗腫瘤及免疫抑制等[3-4]。既往研究發現，雷公藤可以通過調控細胞生長周期、血管內皮生長因子受體、血管生成、腫瘤細胞增殖和凋亡等機制發揮抗腫瘤作用[5-6]。其中雷公藤有效活性成分雷公藤甲素（triptolide，TP）在抗腫瘤中被廣泛研究。研究表明，TP能夠通過抑制核轉錄因子活性，激活Caspases通路，活化分裂原活化蛋白激酶，以及干預腫瘤細胞周期，抑制腫瘤血管形成等途徑發揮抗腫瘤作用[7-8]。但目前有關TP抗肝癌的分子作用機制尚不完全清晰。細胞焦亡是一種新的細胞死亡方式，廣泛參與了心血管疾病的發生發展及腫瘤的進程。因此，本研究擬通過細胞實驗探究TP對肝癌細胞焦亡的影響及其分子作用機制，進而為肝癌的防治提供新的方向。

1 材 料

1.1 細胞 人肝癌細胞株Bel-7402（中科院上海細胞庫，批號：BEL7402-mCherry-luc）。

1.2 試劑 雷公藤甲素（大連美侖生物技術有限公司，批號：T3652-1MG）；RPMI1640培養基（gibco公司，批號：14040-133）；胎牛血清（gibco公司，批號：12657-029）；CCK-8試劑盒（江蘇碧云天公司，批號：C0037）；PI染色試劑盒（江蘇碧云天公司，批號：ST511）；Caspase-3一抗（Cell Signaling Technology公司，批號：9662）；IL-1β一抗（Cell Signaling Technology公司，批號：3498）；IL-18一抗（Cell Signaling Technology公司，批號：3504）；GSDME一抗（Cell Signaling Technology公司，批號：5321）；β-actin一抗（江蘇碧云天公司，批號：AF5009）；一抗稀釋液和二抗稀釋液（江蘇碧云天公司，批號：P0256-100ml）；HRP標記的兔二抗和鼠二抗（武漢博士德公司，批號：A0409）；IL-1β（江蘇碧云天公司，批號：PI305）；IL-18試劑盒（江蘇碧云天公司，批號：PI553）；GSDME siRNA和轉染試劑盒（廣州銳博公司，批號：C10511-05）。

1.3 主要儀器LWD300-38LFT型倒置相差顯微鏡（日本Olympus公司）；3111型CO2培養箱（美國Thermo Scientific公司）；DW-40W255型低溫冰箱（中國海爾公司）；YXJ-2型高速離心機（湖南湘儀實驗室儀器有限公司）；H22822脫色搖床（湖南湘儀實驗室儀器有限公司）；XN55DZG303A型純水儀（美國Millipore公司）；JD801D型凝膠電泳成像系統（美國Bio-Rad公司）。

2 方 法

2.1 細胞培養 采用10%的胎牛血清完全培養基培養人肝癌細胞株Bel-7402，培養基內加入適量的HEPES抗生素，并將培養細胞放置于37℃含5%的CO2培養箱內培養。上述細胞按照每2 d換液1次，3～4 d傳代處理。傳代比例1∶3。

2.2 CCK-8檢測細胞活力 將Bel-7402細胞按照密度為1×104/孔種于96孔板內，待細胞貼壁生長12 h，傾去原培養基，加入終濃度為2.5、5、10 μg/mL的雷公藤甲素，同時設置加入等量培養基的空白對照組，每組均設置6個復孔，分別培養24 h；在避光條件下，每孔加入10 μL的CCK-8溶液，混合均勻，并于37℃、5% CO2培養箱內孵育1 h；采用單功能酶標儀設置檢測波長為450 nm測定各孔吸光度值；依據各孔吸光度值進行OD值處理，細胞活力（OD）=實驗組細胞OD值-空白對照組細胞OD值。

2.3 GSDME siRNA轉染 在培養的細胞Bel-7402密度約占培養板的50%時，無血清同步化處理24 h后，按照轉染試劑盒操作說明書進行GSDME siRNA轉染，將轉染后的細胞培養板放置于培養箱內繼續培養24 h。

2.4 碘化丙啶（propidium iodide，PI）染色檢測細胞焦亡 選取對數生長期細胞，按照1×105/孔細胞接種于96孔板內，待細胞生長密度達到50%～60%時，加入實驗藥物雷公藤甲素與細胞共培養24 h，之后進行PI和細胞核DAPI染色并于光學顯微鏡下拍照。

2.5 ELISA檢測IL-1β和IL-18的含量 收集各組細胞上清液，按照IL-1β和IL-18試劑盒說明書進行各自濃度測定。

2.6 Western blotting檢測腫瘤細胞GSDME、Caspase-3、IL-1β和IL-18表達 將處理完畢的腫瘤細胞清洗后放置于研磨管內，按照合適的比例加入細胞裂解液放置于冰上裂解40min，每間隔5 min進行細胞渦旋振蕩保證裂解完全，將裂解后的離心管放置于離心機內，4℃，12 000 r/min離心10 min，得到細胞上清液。BCA法測定蛋白質濃度，按照35 μg/孔上樣，電泳，轉膜，孵育GSDME一抗（1∶1 000），Caspase-3一抗（1∶1 000）、IL-1β一抗（1∶1 000）和IL-18一抗（1∶1 000）于4℃過夜，洗膜，孵育對應的二抗室溫孵育60 min，TBST洗膜5 min×3次，加入顯影液，顯影并拍照，最后采用Image J軟件分析相關蛋白灰度值。

2.7 統計學方法 采用SPSS 20.0統計學軟件分析，計量資料采用“均數±標準差”（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，多組間比較采用ANOVA，以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結 果

3.1 TP對腫瘤細胞活力的影響 與空白對照組比較，伴隨TP處理濃度的增加，肝癌細胞株Bel-7402的細胞活力均明顯降低（P＜0.01）。其中在TP處理濃度為10.0 μg/mL時腫瘤細胞活力降低最為顯著。（見圖1）

圖1 各組Bel-7402細胞活力比較（±s，n=6）

3.2 TP對腫瘤細胞焦亡的影響PI染色結果顯示，與空白對照組比較，10.0 μg/mL的TP處理細胞能夠明顯增加PI陽性細胞數目（P＜0.01），誘導細胞焦亡；Western blotting結果顯示，與空白對照組比較，TP組能夠明顯促進Caspase-3、GSDME-N、IL-1β和IL-18表達（P＜0.01）。（見圖2～3）

圖2 兩組細胞焦亡水平及比較（±s，n=6）

圖3 兩組細胞Caspase-3、GSDME、GSDME-N、IL-1β和IL-18蛋白表達及比較（±s，n=6）

3.3 TP對腫瘤細胞IL-1β和IL-18的影響 與空白對照組比較，TP組腫瘤細胞上清液中IL-1β和IL-18含量均明顯升高（P<0.01）。（見圖4）

圖4 兩組細胞IL-1β和IL-18的含量比較（±s，n=6）

3.4 siGSDME對肝癌細胞焦亡的影響 與TP組比較，轉染GSDME siRNA組PI陽性細胞數目明顯降低（P<0.01），轉染GSDME無關片段組對焦亡影響不明顯。（見圖5）

圖5 各組細胞焦亡的情況及比較（±s，n=6）

4 討 論

肝癌作為我國最為常見的惡性腫瘤之一，嚴重威脅了患者的生命。早期診斷和早期治療是改善肝癌患者生存預后的有效方式[9]。近年來，有關肝癌的治療取得了一定程度的發展，其中臨床治療上主要是以手術、介入、放療及抗腫瘤藥物治療等方式進行干預[10]。越來越多的研究者把目光投向了中醫藥療法。

雷公藤是一種有效的抗腫瘤中藥，研究發現TP作為雷公藤有效活性成分能夠通過抑制細胞增殖、促進凋亡及抑制血管生成等方式抑制腫瘤細胞生長[11-12]。研究表明，TP具有明顯的抗腫瘤活性。在非小細胞肺癌中，TP能夠抑制MAPK信號通路，抑制血管生成，改善非小細胞肺癌患者臨床癥狀[13]。在乳腺癌細胞系中，給予TP能夠有效抑制乳腺癌細胞增殖，促進凋亡相關蛋白Caspase-3和Bax表達[14]。上述研究均表明雷公藤甲素在促進腫瘤細胞凋亡中發揮重要作用。新近研究發現，活化Caspase-3不僅能夠誘導細胞凋亡也能夠誘導GSDME依賴性細胞焦亡[15]。當細胞高表達GSDME時活化Caspase-3能夠誘導GSDME依賴性細胞焦亡，而當細胞低表達GSDME時激活Caspase-3會誘導細胞凋亡[15-17]。但是有關Caspase-3介導的GSDME型細胞焦亡在肝癌中的作用尚不清楚。細胞焦亡是一種新的細胞死亡方式。既往研究發現，細胞焦亡是由Caspases介導的細胞炎癥性死亡。細胞焦亡主要可分為Caspase-1/4/5/11介導的GSDMD依賴性細胞焦亡和Caspase-3介導的GSDME依賴性細胞焦亡兩大類[15,18]。GSDME作為Gasdermins家族蛋白成員之一，由具有細胞毒性的GSDME-N和GSDME-C組成。當細胞受到外界致病因子或是死亡信號刺激后會通過活化Caspase-3，進而促使GSDME剪切形成GSDME-N片段，隨后其與細胞膜上的磷脂分子結合形成GSDME細胞孔洞，導致細胞內容如IL-1β、IL-18等無釋放直至細胞腫脹破裂[19]。近年來，有關Caspase-3介導的GSDME依賴性細胞焦亡在腫瘤進展中廣泛研究[15]。因此，通過誘導細胞焦亡可能成為抑制腫瘤發生發展的重要手段。為此，我們通過體外細胞實驗探究TP對細胞Bel-7402焦亡的影響及其分子作用機制。通過體外培養人肝癌細胞株Bel-7402。結果發現，與空白對照組比較，隨著TP濃度的增加細胞活力明顯降低。采用10.0 μg/mL TP處理Bel-7402，細胞焦亡數量明顯增加。以上結果表明，TP能夠有效促進腫瘤細胞焦亡發生過程。為進一步闡明TP對細胞焦亡的分子作用機制，實驗通過Western blotting檢測焦亡相關蛋白Caspase-3、GSDME、IL-1β以及IL-18表達，結果發現，與空白對照組比較，TP組細胞Caspase-3、GSDME-N、IL-1β及IL-18表達明顯升高，同時細胞上清液中炎癥因子IL-1β、IL-18釋放明顯增加。上述研究結果表明，TP能夠通過促進肝癌細胞焦亡過程，抑制肝癌的發生發展。本實驗通過轉染GSDME siRNA 24 h后TP處理細胞Bel-7402，結果發現，與TP組細胞比較，GSDME siRNA能夠顯著抑制細胞焦亡。

綜上所述，TP能夠通過促進Caspase-3介導的GSDME依賴性細胞焦亡過程，抑制肝癌細胞增殖，改善肝癌進程。上述研究結果為TP用于治療肝癌提供了新的理論基礎。