基于血熱證探討銀屑病病證結合動物模型的構建*

楊大偉，賈 穎，張皎皎

（山西中醫藥大學，山西 晉中 030619）

銀屑病（psoriasis）是一種以紅斑、鱗屑損害為主的慢性炎癥性皮膚病。西醫對銀屑病的病因認識尚不明確，臨床治療有限，而中醫通過辨證論治，對證治療，使銀屑病逐漸成為中醫治療的優勢病種。臨床研究與科學研究是相輔相成的，已知的銀屑病動物模型，單純以模擬病理特征為目的，廣泛存在造模時間長、皮損不典型、持續時間短、技術要求高等問題[1]。病證結合動物模型的建立一定程度上改善了先前模型存在的問題。它將西醫疾病模型和中醫證候因素相結合，即西醫疾病+中醫病因，模型兼顧西醫的病理特征和中醫的證候表現，更加符合臨床實際情況[2]。現國內文獻報道銀屑病病證結合動物模型有血瘀證[3]、脾虛證[4]、濕熱證[5]，尚無血熱證相關研究。故本實驗立足于血熱證，以中醫病因學說為指導，采用復合多因素方法探討銀屑病血熱證大鼠模型的建立，并嘗試對模型進行評價。

1 材料與方法

1.1 實驗動物6～8周齡雄性SPF級SD大鼠30只，體質量230～250 g，由上海西普爾-必凱實驗動物有限公司提供，動物許可證號：SCXK（滬）2018-0006。用代謝籠單只適應性飼養1周，室溫（23±2）℃，濕度55%～65%，12 h光照/黑夜循環，自由飲水、飲食。醫學實驗動物處理遵循實驗動物管理和使用的規定。

1.2 藥物與試劑 鹽酸普萘洛爾（商品名：心得安，上海賢鼎生物科技有限公司，CAS號：318-98-9）；乳劑基質（廣州市歐妍化妝品有限公司）；干姜、炙甘草（山西維康堂中藥飲片有限公司）；大鼠血清T3試劑盒（上海泛柯實業有限公司，批號：F3512-A）；大鼠血清T4試劑盒（上海泛柯實業有限公司，批號：F3458-A）；大鼠腫瘤壞死因子-α（TNF-α）試劑盒（上海泛柯實業有限公司，批號：F3056-A）；大鼠白介素-17（IL-17）試劑盒（上海泛柯實業有限公司，批號：F2964-A）。干姜和炙甘草臨床每人每天用最大劑量為20 g/60 kg[6]，按人與動物體積表面積折算的等效劑量比值進行換算，配置成濃度1 g/mL煎煮液備用；將5 g的普萘洛爾加入95 g的乳劑基質，均勻攪拌，配成5%的心得安乳劑備用。

1.3 主要儀器JCS-11001C型天平（哈爾濱眾匯衡器有限公司）；體溫計（山西吉泰和寧科技有限公司）；紫外線光療儀（天津市合普科技有限公司）；H5501型光學顯微照相系統（日本尼康株式會社）；病理切片機（湖北省孝感市亞光醫用電子技術有限公司）；LeicaEG1150H型石蠟包埋機（德國Leica公司）；SM600型酶標儀（上海永創醫療器械有限公司）。

1.4 分組與造模 采用隨機數字表將30只SD大鼠分為空白組、銀屑病組、銀屑病血熱證組，每組10只。空白組大鼠正常進食、進水。銀屑病組大鼠用電子推在大鼠背部剪出2 cm×2 cm的無毛區，將5%心得安乳劑按照0.3 g/cm2均勻涂抹，厚度約為1.0 mm，3次/d，共21 d[7-8]。銀屑病血熱證組仿照銀屑病組，在大鼠無毛區涂抹5%心得安乳劑，同時自抹藥之日起，灌服干姜、甘草煎煮液，劑量為1 mL/100 g，1次/d，共21 d。另外將銀屑病血熱證組大鼠置于固定器中，放置紫外燈光療儀燈具下方，垂直距離30 cm，1次/d，1 h/次，共21 d[9]。

1.5 觀察指標

1.5.1 中醫血熱證癥狀的觀察 參照《中醫診斷學》[10]血熱證標準，大鼠出現急躁好斗、口干多飲、納呆食少、小便少而黃、大便少而硬等表現屬于血熱證的基本要求。具體指標有大鼠每日的進食量、飲水量、排便量和性狀、排尿量和性狀，以及造模前后的體質量和肛溫的變化。

1.5.2 背部皮膚皮損形態觀察 肉眼觀察大鼠背部皮膚有無紅斑、鱗屑多少、浸潤肥厚的情況。

1.5.3 背部皮膚組織病理學觀察 采用腹腔注射10%的水合氯醛（0.4 mL/100 g）進行麻醉，3 min后腹主動脈采血8～10 mL，離心后取上清備用。脊柱脫臼法處死大鼠，迅速剪取大鼠背部皮膚，置于4%多聚甲醛溶液固定，后進行石蠟包埋，切片，常規HE染色，光鏡下逐一觀察背部皮膚的病理變化。參照Baker法[11]進行組織病理評分。

1.5.4 大鼠T3、T4及炎癥細胞因子的檢測 采用ELISA法嚴格按照試劑盒操作檢測大鼠血清三碘甲狀腺氨酸（T3）、四碘甲狀腺氨酸（T4）及炎癥因子TNF-α、IL-17的表達水平。

1.6 統計學方法 所有數據均采用SPSS 25.0統計軟件進行分析。計量資料以（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，以P＜0.05為差異有統計意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠背部皮膚皮損形態觀察 空白組大鼠毛發正常有光澤，無異常活動表現；銀屑病組大鼠毛發雜亂晦暗，常回首搔抓皮損，表面覆蓋鱗屑，有少量的紅斑和丘疹；銀屑病血熱證組大鼠毛發雜亂，頻頻回首搔抓皮損，表面覆蓋大量鱗屑，鱗屑掉落有出血現象，有明顯的紅斑和丘疹，表皮肥厚。（見圖1）

圖1 各組大鼠背部皮膚形態觀察

2.2 各組大鼠背部皮膚組織病理學觀察 空白組大鼠皮膚結構完整，表皮與真皮界限清楚，角質層薄，顆粒層明顯，棘層肥厚；銀屑病組和銀屑病血熱證組大鼠表皮明顯增厚，可見不同程度的過度角化，角化中可見Munro微膿腫形成，棘層肥厚，顆粒層變薄，真皮淺層血管擴張充血水腫伴炎細胞浸潤。銀屑病血熱證組和銀屑病組大鼠Baker評分均高于空白組（P＜0.01）；銀屑病血熱證組大鼠Baker評分高于銀屑病組（P＜0.05）。（見圖2、表1）

表1 各組大鼠造模后Baker評分比較（±s，分）

表1 各組大鼠造模后Baker評分比較（±s，分）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與銀屑病組比較，bP＜0.05

組別 動物數（只） Baker評分空白組 10 1.23±0.45銀屑病組 10 5.36±0.67a銀屑病血熱證組 10 6.19±0.54a b

圖2 各組大鼠背部皮膚組織病理切片圖（HE，×40）

2.3 各組大鼠中醫血熱證癥狀觀察 銀屑病血熱證組大鼠造模后出現進食量減少，飲水量增多，排便量減少且顏色為亮黃色，排便量減少且干硬，體質量減輕、肛溫升高等明顯的血熱證表現，與空白組和銀屑病組比較，差異均有統計學意義（P＜0.01或P＜0.05）。與空白組比較，銀屑病組大鼠進食量減少，飲水量增多（P＜0.05），但排便量和排尿量與空白組比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。（見表2～4）

表2 各組大鼠造模前后體質量比較（±s，g）

表2 各組大鼠造模前后體質量比較（±s，g）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與銀屑病組比較，bP＜0.05

組別 動物數（只） 造模前 造模后 差值空白組 10 264.7±5.74 317.70±7.70 53.00±8.34銀屑病組 10 263.2±5.39 239.60±4.67-23.60±6.40a銀屑病血熱證組10 265.7±6.40 228.00±4.27-37.70±5.70a b

表3 各組大鼠造模前后肛溫比較（±s，℃）

表3 各組大鼠造模前后肛溫比較（±s，℃）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與銀屑病組比較，bP＜0.05

組別 動物數（只） 造模前 造模后 差值空白組 10 37.99±0.14 38.12±0.15 0.13±0.25銀屑病組 10 38.13±0.13 38.48±0.14 0.35±0.23a銀屑病血熱證組 10 38.05±0.14 39.19±0.15 1.14±0.24a b

表4 各組大鼠造模后進食量、飲水量、排便量、排尿量比較（±s）

表4 各組大鼠造模后進食量、飲水量、排便量、排尿量比較（±s）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與銀屑病組比較，bP＜0.05

糞便 尿液排便量(g) 性狀 排尿量(mL)性狀空白組 10 18.72±1.10 26.21±1.49 10.76±1.48濕潤11.83±0.90淡黃銀屑病組 10 16.80±0.65a 29.21±1.48a 9.44±0.49干小10.54±0.45米黃銀屑病血熱證組10 15.50±0.78ab 32.42±3.06ab 8.61±0.63ab干硬8.97±0.96ab亮黃組別 動物數(只)進食量(g) 飲水量(mL)

2.4 各組大鼠T3、T4及炎癥細胞因子水平測定 銀屑病血熱證組和銀屑病組大鼠T3、T4、TNF-α、IL-17水平均高于空白組（P＜0.01），銀屑病血熱證組大鼠T3、T4、TNF-α、IL-17水平高于銀屑病組（P＜0.05）。（見表5）

表5 各組大鼠血清T3、T4、TNF-α、IL-17水平比較（±s，pg/mL）

表5 各組大鼠血清T3、T4、TNF-α、IL-17水平比較（±s，pg/mL）

注：與空白組比較，aP＜0.01；與銀屑病組比較，bP＜0.05

組別 動物數（只） T3 T4 TNF-α IL-17空白組 10 0.96±0.17 36.82±6.76 1.34±0.18 0.97±0.18銀屑病組 10 1.68±0.43a 44.10±3.41a 1.85±0.64a 1.62±0.33a銀屑病血熱證組10 2.09±0.75ab 58.21±9.62ab 2.23±0.43ab 2.56±0.65ab

3 討 論

臨床研究發現，銀屑病與體質存在相關性，血熱證集中在陰虛體質[12]。基于此，我們參考并比較了其他實驗研究[13-14]，選擇體質偏于虛熱的雄性SD大鼠作為實驗動物。

銀屑病血熱證的形成無外乎“外因”和“內因”的影響，外受于風熱毒邪，內嗜食辛辣炙煿致使脾胃積熱，內外邪熱交爭，蘊結肌表傷津耗血。故本研究造模方式遵循并模擬銀屑病血熱證的發病規律，即外涂抹心得安乳劑和照射紫外線燈，內灌服干姜、甘草煎煮液。心得安乳劑屬于中醫“藥毒”范疇，中醫辨證多從風熱論治[15]。故本研究借鑒了黃畋等[7]的研究及GAYLARDE P M等[8]的研究中用普萘洛爾誘導豚鼠銀屑病的造模方法。其次，用紫外線燈照射肌表以模擬日光。日光屬于中醫的暑熱之邪，《素問·生氣通天論篇》指出，傷于暑熱則“汗出”，“體若燔炭”。《素問·至真要大論篇》言：“辛甘發散為陽”，干姜為大辛大熱之品，炙甘草為甘滋之物，持續灌服煎煮液使脾胃積熱耗氣傷陰，致使火熱內生，從而奠定內傷的基礎。

《素問·瘧論篇》言：“陽盛則外熱，陰虛則內熱”，外感風熱毒邪直接作用肌表，內受火熱耗損陰津，外感和內傷的雙重刺激，導致大鼠皮膚不僅顯現紅斑、丘疹、鱗屑等銀屑病樣皮損，還表現出口渴喜飲、溲黃便秘、進食減少、體質量減少、肛溫升高、局部皮膚溫度升高等與臨床血熱證相符的癥狀。其次，IL-17是炎癥細胞因子，具有極強的致炎性，是銀屑病特異性指標的微觀表達，與TNF-α存在相互作用，能夠擴大并維持炎癥反應。臨床研究發現IL-17和TNF-α在銀屑病皮損中的表達均高于正常組和對照組[16]。故本研究檢測大鼠血清IL-17和TNF-α的表達，得到了與臨床一致的結果，由此證明銀屑病大鼠模型的建立。魏歆然等[17]實驗研究結果表明寒證、熱證的主要生理病理基礎在于內分泌激素水平的高低，熱證模型組的T3、T4、TNF-α均高于正常組和寒證模型組。故本研究檢測大鼠血清中T3、T4和TNF-α的表達，結論與魏歆然的一致，由此證明銀屑病血熱證大鼠模型的建立。

證是中醫學特有的概念，證的存在或消除決定了疾病是痊愈還是轉變。因此，本研究有效地把病與證結合，成功地將血熱證形成因素運用到動物模型，構建的模型不僅穩定性高，符合銀屑病慢性炎癥的特點，而且貼近臨床，既具有西醫的病理改變又具有中醫的特定癥狀。但銀屑病發病涉及多種復雜因素，本研究僅僅是對銀屑病病證結合動物模型的初步摸索，如何精準選取造模因素和如何完善評價標準是我們下一步探索的方向。