加減益經(jīng)湯對卵巢功能減退大鼠性激素與卵巢組織形態(tài)學(xué)的影響*

李麗美，和秀魁，蔡仁燕，黃雪萍，夏建紅

（廣東省婦幼保健院，廣東 廣州 510095）

卵巢功能減退（diminished ovarian reserve，DOR），又稱卵巢儲備功能下降，指卵巢產(chǎn)生卵子的能力減弱，卵泡的質(zhì)量下降[1]。DOR臨床表現(xiàn)嚴(yán)重程度不一，或無癥狀，或僅表現(xiàn)為生育力的下降，或有月經(jīng)不調(diào)、不孕，進(jìn)一步發(fā)展為卵巢功能不全（premature ovarian insufficiency，POI）、卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）。DOR的治療是臨床的難點(diǎn)與熱點(diǎn)。西醫(yī)尚無確切有效的方法提高卵巢儲備功能，中醫(yī)改善卵巢功能的療效與機(jī)制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)加減益經(jīng)湯可明顯改善卵巢儲備功能，提高妊娠率[1-3]，但機(jī)制尚不明確。臨床上環(huán)磷酰胺（cytoxan，CTX）化療是引起DOR、POI、POF的主要原因。前期研究采用75 mg/kg CTX單次腹腔注射成功復(fù)制DOR大鼠模型[1,4-6]。本實(shí)驗(yàn)以戊酸雌二醇片（商品名：補(bǔ)佳樂）為陽性對照，探討加減益經(jīng)湯對CTX建立的DOR大鼠性激素與卵巢組織形態(tài)學(xué)的影響。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物12周齡健康SPF級SD成年雌性大鼠60只，體質(zhì)量（230±10）g，購自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心。均經(jīng)陰道脫落細(xì)胞涂片篩查動情周期正常。全價顆粒飼料喂養(yǎng)，自由攝食，標(biāo)準(zhǔn)光照，室溫20～25℃，相對濕度45%～55%。動物合格證號：NO.44007200002182，實(shí)驗(yàn)設(shè)施合格證號：SCXK（粵）2013-0002。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動物管理委員會批準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑 加減益經(jīng)湯由熟地黃20 g，黨參20 g，菟絲子20 g，丹參15 g，白芍10 g，當(dāng)歸10 g，柴胡6 g等中藥組成[1,6-7]。將上述藥物煎制后濃縮為每毫升含生藥2.358、1.179、0.589 5 g的藥液，裝瓶低溫冷藏備用（廣東省中醫(yī)研究所制備），應(yīng)用時以蒸餾水調(diào)配[1]。戊酸雌二醇片（商品名：補(bǔ)佳樂，法國DELPHARM Lille S.A.S公司，1 mg/片，批號：251A2）；CTX（山西普德藥業(yè)有限公司，0.2 g/支，批號：04130301）；E2ELISA試劑盒（批號：1306246）、FSH ELISA試劑盒（批號：1306251）、LH ELISA試劑盒（批號：1304252）（上海西唐生物科技有限公司）。

1.3 主要儀器Bio-RAD 680酶標(biāo)儀（美國伯樂公司）；Olympus DP2-BSW型病理圖像采集系統(tǒng)（日本奧林巴斯公司）。

1.4 造模與分組 將60只SD雌鼠按隨機(jī)數(shù)字表選出10只為空白對照組，予1 mL生理鹽水腹腔注射。其余50只雌鼠予CTX 75 mg/kg（加生理鹽水配成1 mL藥液）單次腹腔注射造模[1,4-5]。CTX造模后大鼠出現(xiàn)蜷臥少動，精神不振，易激惹等表現(xiàn)，提示造模成功，將造模成功大鼠隨機(jī)分為模型對照組、補(bǔ)佳樂組和加減益經(jīng)湯高、中、低劑量組，每組10只。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 加減益經(jīng)湯高、中、低劑量組大鼠參考《中藥藥理研究方法學(xué)》[8]，分別灌胃高、中、低劑量加減益經(jīng)湯，生藥劑量分別為23.58、11.79、5.895 g/kg。補(bǔ)佳樂臨床常規(guī)日用量1 mg，參考《中藥藥理研究方法學(xué)》[8]，補(bǔ)佳樂組大鼠灌胃補(bǔ)佳樂混懸液，0.09 mg/kg。模型對照組與空白對照組大鼠灌胃蒸餾水，10 mL/kg。造模后2 h開始灌胃給藥，1次/d，連續(xù)28 d。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 大鼠動情周期 每天08:30:00行陰道脫落細(xì)胞檢查[9]。模型對照組大鼠在造模后2周，其余各組在結(jié)束給藥后，篩查出處于動情間期的大鼠，斷頸處死。

1.6.2 血清性激素水平 腹主動脈取血，室溫下靜置30 min，3 000 r/min，離心10 min，分離血清置于-80℃冰箱保存待測[1,4,6]。以雙抗體夾心ELISA法測定大鼠血清中FSH、LH、E2水平。

1.6.3 卵巢指數(shù) 完整取出大鼠雙側(cè)卵巢，去掉筋膜及脂肪組織，稱重后計(jì)算卵巢指數(shù)[卵巢指數(shù)=卵巢濕質(zhì)量（mg）/體質(zhì)量（g）×100%][10-11]。

1.6.4 卵巢組織形態(tài)學(xué)觀察及卵泡計(jì)數(shù) 左側(cè)卵巢置福爾馬林固定，經(jīng)脫水、包埋、切片、HE染色、封片，光鏡下觀察組織形態(tài)學(xué)變化。病理切片為連續(xù)5 μm切片，每間隔9張取1張切片（即第10張），隨機(jī)取5張，累積計(jì)數(shù)原始卵泡、初級卵泡、次級卵泡、成熟卵泡和閉鎖卵泡數(shù)目[1,5-6]。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0 For Windows統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行處理，計(jì)量資料以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（±s）表示，多組比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠一般情況 各組大鼠全部存活。空白對照組大鼠均表現(xiàn)正常；模型對照組大鼠造模后開始出現(xiàn)被毛疏松易脫落，蜷臥少動，精神不振，易激惹等情況；各治療組造模后出現(xiàn)模型對照組的表現(xiàn)，但藥物干預(yù)后逐漸恢復(fù)正常，且恢復(fù)較模型對照組快。

2.2 各組大鼠動情周期比較 空白對照組大鼠動情周期4～5 d，中位數(shù)4.5 d，動情間期1.5～2.5 d，中位數(shù)2 d；模型對照組大鼠造模后規(guī)則的動情周期變化消失，延長至7 d以上，動情間期時間5～7 d，中位數(shù)6 d；藥物干預(yù)后，加減益經(jīng)湯高、中劑量組和補(bǔ)佳樂組大鼠逐漸恢復(fù)正常的動情周期，而加減益經(jīng)湯低劑量組大鼠觀察期內(nèi)未恢復(fù)正常的動情周期。

2.3 各組大鼠卵巢指數(shù)比較 與空白對照組比較，補(bǔ)佳樂組與模型對照組大鼠卵巢指數(shù)明顯降低（P＜0.01）；與模型對照組比較，加減益經(jīng)湯高、中劑量組大鼠卵巢指數(shù)明顯升高（P＜0.01）；與補(bǔ)佳樂組比較，加減益經(jīng)湯高劑量組大鼠卵巢指數(shù)明顯升高（P＜0.05）。（見圖1）

圖1 各組大鼠卵巢指數(shù)比較（±s，n=10）

2.4 各組大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué) 空白對照組大鼠卵巢皮髓質(zhì)結(jié)構(gòu)清晰，各級卵泡及黃體形態(tài)結(jié)構(gòu)完整，血管豐富，髓質(zhì)充盈，含有豐富的神經(jīng)、淋巴管；模型對照組大鼠卵巢髓質(zhì)部分萎縮，皮質(zhì)明顯增生且纖維化，間質(zhì)有炎癥變化及纖維化改變，顆粒細(xì)胞排列疏松，層數(shù)減少，原始、成熟卵泡減少，初級、次級、閉鎖卵泡增多；各治療組卵巢髓質(zhì)未見明顯萎縮，皮質(zhì)增生不明顯，間質(zhì)纖維化程度輕，閉鎖卵泡減少，成熟卵泡、黃體增多。（見圖2）

圖2 各組大鼠卵巢組織形態(tài)學(xué)比較（HE，×40）

2.5 各組大鼠卵巢各級卵泡數(shù)目比較 與空白對照組比較，模型對照組大鼠原始、成熟卵泡數(shù)明顯減少（P＜0.01），初級、次級、閉鎖卵泡數(shù)明顯增加（P＜0.01）；補(bǔ)佳樂組、加減益經(jīng)湯低劑量組大鼠成熟卵泡數(shù)明顯減少（P＜0.01或P＜0.05），初級、次級、閉鎖卵泡數(shù)明顯增加（P＜0.01或P＜0.05）；加減益經(jīng)湯高、中劑量組次級卵泡數(shù)明顯增加（P＜0.01）。與模型對照組比較，各治療組大鼠原始卵泡數(shù)明顯增加（P＜0.01），初級、次級、閉鎖卵泡數(shù)明顯減少（P＜0.01）；加減益經(jīng)湯高、中劑量組成熟卵數(shù)泡明顯增加（P＜0.01或P＜0.05）。與加減益經(jīng)湯高、中劑量組比較，加減益經(jīng)湯低劑量組次級卵泡數(shù)明顯增加（P＜0.01）。（見圖3）

圖3 各組大鼠卵巢各級卵泡數(shù)目比較（±s，n=10）

2.6 各組大鼠血清FSH、LH、E2水平比較 與空白對照組比較，模型對照組大鼠血清FSH、LH水平明顯升高（P＜0.01），E2水平明顯降低（P＜0.01）；與模型對照組比較，各治療組大鼠血清FSH、LH水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），E2水平明顯升高（P＜0.01）。（見表1）

表1 各組大鼠血清FSH、LH、E2水平比較（±s，pg/mL）

表1 各組大鼠血清FSH、LH、E2水平比較（±s，pg/mL）

注：與空白對照組比較，aP<0.01；與模型對照組比較，bP<0.01，cP<0.05

組別 動物數(shù)（只）給藥劑量（g/kg）FSH LH E2空白對照組 10 - 2對照組 10 - 5.08±0.76 4.55±1.88 60.38±7.84模型.86±1.50a 7.83±0.71a 31.20±7.22a補(bǔ)佳樂組 10 9.00×10-5 2.64±0.74b 4.84±2.24b 57.64±8.13b加減益經(jīng)湯高劑量組 10 23.58 2.47±1.19b 4.77±1.23b 52.94±10.03b加減益經(jīng)湯中劑量組 10 11.79 2.59±0.72b 4.72±1.07b 52.64±10.93b加減益經(jīng)湯低劑量組 10 5.895 3.03±0.82b 5.42±1.66c 49.87±8.60b

3 討 論

卵巢功能由卵巢內(nèi)的卵泡數(shù)目與質(zhì)量決定，反映女性的生育力[12]。卵巢功能減退時血清E2降低，或卵泡對FSH、LH的敏感性降低，垂體代償性分泌更多FSH、LH，其中以FSH上升更明顯。因此，始基卵泡數(shù)是卵巢儲備功能的直接反映指標(biāo)，F(xiàn)SH、LH與E2是評估卵巢功能最常用的指標(biāo)。

DOR是一種病因復(fù)雜且進(jìn)行性發(fā)展的疾病。CTX是對卵巢功能損害最大的藥物。CTX主要影響增殖活躍的細(xì)胞，使DNA斷裂而引起細(xì)胞凋亡[13]。研究發(fā)現(xiàn)CTX對始基卵泡的損傷最大，通過激活始基卵泡，加速卵泡的耗竭[14]，大劑量使用時，卵巢損傷不可逆轉(zhuǎn)[15]。前期研究證實(shí)，75 mg/kg CTX單次腹腔注射可成功復(fù)制DOR大鼠模型[1,4-6]。本次實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯φ战M大鼠經(jīng)CTX75 mg/kg單次腹腔注射造模后，出現(xiàn)蜷臥少動，精神不振，動情周期延長，卵巢顆粒細(xì)胞減少，間質(zhì)炎性改變，原始、成熟卵泡減少，初級、次級、閉鎖卵泡增多，血清FSH、LH升高，E2降低，符合DOR的病理改變，證明造模成功。

目前尚無確切有效的方法恢復(fù)卵巢功能，若早期診斷DOR并予中醫(yī)藥干預(yù)，或許可延緩卵巢衰老的速度，提高卵子的質(zhì)量。不少研究證實(shí)中醫(yī)藥可改善DOR的卵巢功能，但療效報(bào)道不一，且機(jī)制不明確。DOR歸屬于中醫(yī)的不孕癥、月經(jīng)病等范疇，與《內(nèi)經(jīng)》記載的“七七”變化和《傅青主女科》中記載的“年未老而經(jīng)水?dāng)唷鳖愃啤！陡登嘀髋啤分赋觯骸叭粍t經(jīng)水早斷，似乎腎水衰涸。吾以為心肝脾氣之郁者……方用益經(jīng)湯”。益經(jīng)湯原方共10味藥，以熟地黃、白術(shù)為君藥，山藥、當(dāng)歸為臣藥，佐以白芍、北沙參、酸棗仁、牡丹皮，杜仲、柴胡為使藥。

陶莉莉認(rèn)為腎虛是引起DOR的根本病因，與傅青主的“腎水衰涸”一致，治療上要兼顧腎精虧虛、腎氣虛、腎陰虛與腎陽虛[1-3]。此外，當(dāng)今女性，工作生活壓力大，情志因素是誘發(fā)DOR的重要病因，與王吉菊等[16]認(rèn)識一致，認(rèn)為腎虛肝郁證是DOR患者臨床最常見地證型，因此制定了加減益經(jīng)湯。加減益經(jīng)湯是在益經(jīng)湯的基礎(chǔ)上加減而成。以熟地黃、菟絲子、黨參為君藥，杜仲、丹參、北沙參為臣藥，當(dāng)歸、白芍為佐藥，柴胡為使藥，全方配伍合理、簡潔，腎、脾、肝、心、肺五臟同調(diào)，具有補(bǔ)腎健脾、疏肝活血之功。研究發(fā)現(xiàn)[1-3]，加減益經(jīng)湯能提高腎虛肝郁證DOR患者的臨床妊娠率，降低FSH、LH，升高E2。本次實(shí)驗(yàn)中，加減益經(jīng)湯可恢復(fù)CTX所致DOR大鼠的整體狀態(tài)與動情周期[1]，升高卵巢指數(shù)，改善卵巢的病理形態(tài)，增加原始、成熟卵泡數(shù)，降低初級、次級、閉鎖卵泡數(shù)，降低FSH、LH，升高E2。這與其他研究相似，如徐慧軍等[17]研究表明調(diào)更益經(jīng)湯可改善免疫性POF小鼠卵巢的生殖內(nèi)分泌功能。潘英等[18]研究表明益經(jīng)湯聯(lián)合西藥治療POF的療效顯著，能降低FSH、LH水平，提高E2水平，增大卵巢體積，改善卵巢形態(tài)。

本次實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)加減益經(jīng)湯高、中劑量組與補(bǔ)佳樂組在改善卵巢功能方面療效相當(dāng)，三者無明顯差異，加減益經(jīng)湯低劑量組療效略差。加減益經(jīng)湯呈現(xiàn)一定的劑量依賴關(guān)系。加減益經(jīng)湯中劑量，即臨床等效劑量，是最適宜的使用劑量，適合臨床推廣使用。研究發(fā)現(xiàn)加減益經(jīng)湯可改善因CTX導(dǎo)致的DOR大鼠的性激素與卵巢組織形態(tài)學(xué)，但其作用機(jī)制尚不明確，需進(jìn)一步深入研究。