HPLC法同時測定復方川芎片中6種化學成分的含量

雷秀星，劉利利，倪丹鳳

（1.六安市中醫院，安徽 六安 237006；2.中國醫科大學附屬盛京醫院，遼寧 沈陽 110032；3.六安市人民醫院，安徽 六安 237005）

復方川芎片是由川芎和當歸2種中藥經過一系列現代提取工藝加工制備而成的中成藥。該復方制劑具有活血化瘀、通脈止痛的功效，現代臨床上主要用于冠心病穩定型心絞痛屬心血瘀阻證者。復方中的川芎為川產道地藥材之一，其性味溫、辛，主入肝、膽、心包經，具有活血行氣、祛風止痛的功效，《神農本草經》將其列為上品之一，入藥歷史悠久[1-4]；當歸是中藥組方中使用頻率最高的一味中藥，歷來素有“十方九歸”的說法，其性味溫甘辛，具有活血止血、調經止痛、潤腸通便的作用，在《神農本草經》中被稱為“血家之圣藥”[5-8]，二者在復方中協同發揮功效。現代化學和藥理研究表明，川芎含有多種化學成分，不同化學成分產生不同的藥理作用，對心腦血管系統、呼吸系統、肝腎功能等方面均有一定的保護作用，可有效改善冠狀動脈血流量、抗血小板聚集和血栓形成、抗氧自由基、降血壓，如苯酞類化合物（藁本內酯）、有機酸類化合物（阿魏酸、咖啡酸）、生物堿類化合物（川芎嗪）等，是川芎中主要的活性成分，也是川芎藥材常用的定性定量指標性成分；當歸藥材中主要有揮發油、多糖、氨基酸、有機酸和黃酮等有機成分；阿魏酸、綠原酸、金絲桃苷等，其中綠原酸和金絲桃苷是重要的抗凝血及抗菌活性成分[9-14]。兩味藥材中均含有阿魏酸，且《中華人民共和國藥典》2015年版一部中阿魏酸均為兩味藥材的定量指標性成分，復方中二者協同作用，共同發揮治療效果。筆者查閱相關文獻知，目前對該復方制劑中指標性成分的含量進行測定的報道鮮見，因此本次實驗研究旨在對該復方中6種指標性成分進行定量分析。

據文獻報道[15]，對復方制劑中單一指標性成分的含量進行測定難以確保其有效性與質量穩定性的統一。因此，目前亟需在以臨床用藥安全和有效的前提下，建立復方川芎片中多指標成分的含量測定方法。本研究則采用HPLC-DAD法建立了同時檢測該制劑中阿魏酸、咖啡酸、藁本內酯、川芎嗪、綠原酸和金絲桃苷6種指標性成分含量的方法，為該復方的質量控制與評價提供科學依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Agilent 1200高效液相色譜儀（美國Agilent公司，包括DAD二極管陣列檢測器，四元梯度泵，Empower Pro色譜工作站）；KQ5200 DE型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；XS205DU型電子分析天平（瑞士-梅勒特有限公司）；Milli Pore Advantage A10自動純水機（美國）。

1.2 試藥 對照品：阿魏酸（批號：110773-201012）、咖啡酸（批號：110885-200102）、藁本內酯（批號：111737-201305）和金絲桃苷（批號：111521-200303）純度均≥98.0%；川芎嗪（批號：110817-200305，純度≥99.9%）；綠原酸（批號：110753-201415，純度≥96.2%），6種對照品均購于中國食品藥品檢定研究院。5批復方川芎片（批號：20180712，20180810，20180909，20181212，20181227，均為市售品，每素片重0.4g）均為各大藥店購買；屈臣氏蒸餾水；乙腈（色譜級，Merk公司）；其他試劑（分析純，天津化學試劑廠）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Thermo BDS C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B）；洗脫程序為：0～12 min，10% A，12～30 min，10%→20% A，30～50 min，20%→40% A；體積流量：1.0 mL/min；柱溫：30℃；進樣量：10 μL；檢測波長：320 nm。

2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱取對照品阿魏酸2.42 mg、咖啡酸3.62 mg、藁本內酯2.82 mg、川芎嗪3.12 mg、綠原酸2.65 mg和金絲桃苷2.29 mg，置于25 mL的棕色容量瓶中，緩慢滴加甲醇至刻度線，超聲使溶解充分，分別制成質量濃度為94.86、141.9、110.5、124.7、102.0、89.78 μg/mL的混合對照品溶液。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取復方川芎片粉末0.2 g，置于50 mL的錐形瓶中，加25 mL甲醇溶液，稱質量，超聲提取30 min，取出，冷卻，稱質量，加甲醇溶液補足失質量，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得。

2.4 系統適用性試驗 將已制備好的混合對照品溶液和供試品溶液按照既定的HPLC-DAD條件進樣測定，記錄50 min的色譜圖（見圖1）。結果顯示，阿魏酸、咖啡酸、藁本內酯、川芎嗪、綠原酸和金絲桃苷6個色譜峰的分離度均大于1.5，表明所建立的HPLC-DAD方法滿足本次實驗要求。

圖1 混合對照品與供試品HPLC圖

2.5 線性關系考察 分別精密吸取0.25、0.5、1.25、2.5、5 mL的阿魏酸（濃度為94.86 μg/mL）、咖啡酸（濃度為141.9 μg/mL）、川芎嗪（濃度為124.7 μg/mL）、藁本內酯（濃度為110.5 μg/mL）、綠原酸（濃度為102.0 μg/mL）、金絲桃苷（濃度為89.78 μg/mL）混合對照品溶液，置于5 mL的棕色容量瓶中，緩慢滴加甲醇溶液至刻度線，即可得到一系列質量濃度的阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本內酯、綠原酸和金絲桃苷對照品溶液，按照已定的HPLC-DAD色譜條件分別依次進樣測定，計算含量。即分別以阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本內酯、綠原酸和金絲桃苷對照品溶液的質量（X，μg）為橫坐標，其各自的峰面積（Y）為縱坐標，分別得出標準曲線回歸方程及相關系數。結果顯示，在一定的線性范圍內，6種指標性成分的線性關系良好。儀器的檢測限以3倍的信噪比（S/N=3），定量限以10倍的信噪比（S/N=3）計算。（見表1）

表1 6種指標性成分線性關系

2.6 精密度試驗 取同一批次的樣品（批號：20180712），按照既定樣品制備方法制備和HPLC-DAD色譜方法測試，同一樣品溶液連續重復進樣6次，計算各指標性成分的含量。結果顯示阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本內酯、綠原酸和金絲桃苷的含有量RSD分別為1.31%、1.25%、1.02%、1.55%、0.95%、1.43%，表明本方法精密度良好。

2.7 穩定性試驗 取精密度測試的樣品溶液，分別在第0、2、4、6、8、12 h時進樣測試。結果顯示阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本內酯、綠原酸和金絲桃苷各成分的峰面積RSD分別為1.03%、1.20%、1.33%、0.34%、0.93%、1.22%，表明在12 h內供試品溶液中的6種指標性成分具有良好的穩定性。

2.8 重復性試驗 取同一批次的樣品（批號：20180712），共制備6份樣品溶液，按照既定樣品制備方法和HPLC-DAD色譜方法進行測試。結果顯示阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本內酯、綠原酸和金絲桃苷的含有量RSD分別為1.15%、1.21%、1.03%、0.85%、0.99%、1.02%，表明本次試驗方法重復性良好。

2.9 加樣回收率試驗 取同一批次的樣品（批號：20180712）0.1 g，平行精密稱取9份，置于50 mL錐形瓶中，每組分別加入阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本內酯、綠原酸和金絲桃苷對照品溶液，按照樣品含有量的50%、100%和150%加入，按照既定樣品制備方法制備和HPLC-DAD色譜方法測試，計算各自的回收率值，結果顯示6種指標性成分的平均回收率為阿魏酸99.82%（RSD=1.10%）；咖啡酸100.79%（RSD=1.20%）；川芎嗪100.07%（RSD=0.43%）；藁本內酯98.98%（RSD=1.51%）；綠原酸101.22%（RSD=1.23%）；金絲桃苷100.99%（RSD=1.31%），結果顯示6種指標性成分的加樣回收率良好，基本符合試驗方法學要求。

2.10 含量測定 取5批復方川芎片，按照既定樣品制備方法制備和HPLC-DAD色譜方法測試，分別進樣檢測分析，記錄各成分的峰面積，計算阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本內酯、綠原酸和金絲桃苷各自含量。（見表2）

表2 5批樣品中6種化學成分含量測定結果（mg/g，n=5）

3 討 論

復方川芎片是經過一系列現代提取工藝加工制備而成的中成藥，該方中川芎和當歸協同發揮治療疾病的作用。筆者在前人研究的基礎上，結合該復方的藥理實驗結果，綜合選擇可能發揮療效的阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本內酯、綠原酸和金絲桃苷6種指標性成分為該制劑的定量指標，并采用HPLC-DAD法對該6種指標性成分的含量進行了同時測定。結果顯示，6種指標性成分在既定樣品制備方法和HPLCDAD色譜方法下分離度均良好。故本實驗選擇同時定量分析阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本內酯、綠原酸和金絲桃苷6種指標性成分，能保證該復方制劑臨床的有效性與質量的穩定性。

筆者經文獻研究可知，阿魏酸、咖啡酸、藁本內酯分別在波長320 nm處有吸收，川芎嗪、綠原酸和金絲桃苷分別在波長280 nm或254 nm處有吸收，筆者通過全波長掃描發現，川芎嗪、綠原酸和金絲桃苷在波長320 nm處也有明顯的吸收，故實驗選擇320 nm為阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本內酯、綠原酸和金絲桃苷6種化學成分的檢測波長。研究還分別考察了不同的流動相體系（乙腈-水、乙腈-0.05%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水），結果顯示，以乙腈-0.1%磷酸水溶液為流動相時，阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本內酯、綠原酸和金絲桃苷6種指標性成分均能達到良好的效果。考察了不同溫度（25℃、30℃、35℃）和不同體積流量（0.8、1.0 mL/min）對各色譜峰分離效果的影響，結果顯示，30℃的柱溫、1.0 mL/min的體積流量，色譜基線平穩、分離度和峰形均有較好的改善。考察了不同廠家和品牌的色譜柱[Agilent EC-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；Thermo BDS-C18（4.6mm×250mm，5 μm）；Waters XBridgeTM C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）]對色譜峰的影響，結果顯示，阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本內酯、綠原酸和金絲桃苷的色譜峰在Thermo BDS-C18柱上具有良好的分離度。實驗采用單因素考察的方法對樣品提取溶劑（無水乙醇、80%乙醇和60%乙醇，甲醇，80%甲醇，60%甲醇，正丁醇）、提取方法（加熱回流、浸提和超聲提取）、提取時間（10、20、30、45、60 min）等影響因素進行了考察，結果顯示，采用甲醇超聲提取30 min可使樣品中阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本內酯、綠原酸和金絲桃苷提取完全。

本研究建立了HPLC-DAD法同時測定復方川芎片中阿魏酸、咖啡酸、川芎嗪、藁本內酯、綠原酸和金絲桃苷含量的方法。通過對高效液相色譜分離參數的考察，最終選擇最理想的HPLC-DAD檢測條件，該方法能較快速、準確地對不同指標性成分的含量進行有效測定，可作為有效評價復方川芎片內在質量的方法之一，保證了臨床用藥的安全性和有效性。精確對制劑中藥有效成分含量的測定，不僅為其他中藥復方制劑的質量控制與評價起到借鑒作用，而且也為中藥現代化的實現和國際標準的建立奠定了實驗基礎。