氣滯血瘀型肝癌用藥規律分析及核心藥對作用機制的網絡藥理學研究*

梁子成，龍依萍，張曾宇，黃曉蒂，陳泓秀，文 璐，田雪飛，田 莎

（湖南中醫藥大學，湖南 長沙 410208）

肝癌是常見的惡性腫瘤之一，其發病率與死亡率居世界前列，且預后普遍較差[1]。目前肝癌的首選治療方法是化學療法與免疫治療，但仍存在不可忽視的缺陷[2]。因此，尋求安全有效的抗肝癌藥物極為迫切。肝癌在中醫學歸屬于“伏梁”“積聚”范疇，其可因外邪入侵、飲食內傷、情志因素所致，與氣血津液代謝密切相關[3]。中醫藥治療肝癌具有療效顯著、不良反應小等優勢[4]。中醫將肝癌分為5個證型，其中氣滯血瘀證是最主要的證型，通常貫穿肝癌全病程[5]。氣滯血瘀既是肝癌發生的危險因素，也是影響肝癌病程進展的病理因素。氣為血之帥，能生血、能行血，故氣滯可致使血瘀；且肝主疏泄，氣滯可致使肝郁，肝郁可加重肝病程度。血為氣之母，能載氣、養氣，故血瘀可致使氣機循環失暢；血可濡養臟器筋脈，血瘀可致使肝臟失濡養，故血瘀可加重肝病。中醫對于氣滯血瘀證與肝癌的關系尤為重視，因而治療氣滯血瘀型肝癌方藥及報道諸多，然對于治療氣滯血瘀型肝癌的用藥規律尚不統一。本研究采用數據挖掘的方法對收集到的治療氣滯血瘀型肝癌的用藥處方進行分析，探討中醫治療氣滯血瘀型肝癌的用藥規律，并運用網絡藥理學的方法探討關鍵藥物組合治療肝癌的潛在機制，以期為臨床治療和理論研究提供可靠參考。

1 資料與方法

1.1 中藥處方來源中藥處方通過在中國知網、維普、萬方數據庫輸入“肝癌氣滯血瘀”“氣滯血瘀證”“肝癌”“中藥”“中藥治療”“中醫治療”等關鍵詞聯合檢索獲得。通過題名和摘要瀏覽進行初篩，全文瀏覽進一步精篩獲得初步數據，后根據資料納入與剔除標準獲得符合要求方劑95首。

1.2 資料篩選

1.2.1 納入標準（1）公開發表的包含中藥治療氣滯血瘀型肝癌的文獻報道；（2）報道處方完整，有明確中藥組成，確切劑量，處方藥物組成符合氣滯血瘀型肝癌證候治療需求；（3）報道療效確切。

1.2.2 剔除標準（1）排除綜述、動物實驗、理論探討所得方劑；（2）排除采用單味藥方劑、單用或合并中成藥治療報道，如斑蝥膠囊等；（3）排除聯合中醫其他治法的報道，如艾灸、針刺等；（4）排除服藥方式非內服報道，如敷貼等；（5）重復發表取其一，同藥物組成且同劑量而異名的處方取其一。

1.3 處方藥物名稱規范為排除因藥物別名、炮制方法、藥物劑型等對后續分析產生干擾，根據《中華人民共和國藥典》[6]（2015版）、《中藥學》[7]對處方藥物的名稱進行規范化處理，如洋火葉、仙靈脾、淫羊藿統一為淫羊藿，姜半夏、法半夏、半夏統一為半夏，附片、附子統一為附子。

1.4 資料錄入核對與分析將“1.2”及“1.3”處理后的方劑錄入中醫傳承輔助平臺（V2.5），為確保信息準確完整錄入，由兩人對輸入前文件進行反復檢查，輸入過程中交替進行并兩人監督。錄入完成后請第三人對錄入結果進行檢查。數據錄入完成后，運用“數據分析”“統計報表”系統進行數據分析。

1.5 關鍵藥物組合治療肝癌的機制分析從TCMSP數據庫、TCMID數據庫以OB≥30%、DL≥0.18獲取藥物成分，聯合Pubchem數據庫和SwissTargetprediction數據庫獲得新處方作用靶點（https://tcmspw.com/tcmsp.php、http://www.megabionet.org/tcmid/、https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/、http://www.swisstarget prediction.ch/）。關鍵藥物組合作用靶點與GEO數據庫GSSE121248芯片的差異基因取交集獲得治療肝癌的潛在靶點。利用STRING平臺（https://string-db.org/）進行蛋白互作分析，借助DAVID 6.8數據庫進行GO功能與KEGG通路富集分析，使用Cytoscape 3.8.0軟件進行調控網絡構建。

2 結 果

2.1 用藥頻數≥15的中藥對過濾后的95首方劑進行頻數統計分析，獲得頻數≥15的中藥29味。（見表1）四氣以寒[37.79%（506/1 339）]、溫[34.21%（458/1 339）]、平[24.50%（328/1 339）]為主，五味以苦[35.61%（745/2 092）]、甘[30.98%（648/2 092）]、辛[24.33%（509/2 092）]為主，歸經以肝[20.26%（743/3 668）]、脾[19.22%（705/3 668）]、胃[13.55%（497/3 668）]為主。（見圖1）

表1 用藥頻數≥15的中藥

圖1 藥物的性味歸經分析結果

2.2 處方規律分析應用平臺進行處方規律分析，獲得用藥頻數≥18的藥物組合23個（見表2），提取置信度≥0.6的組合關聯規則信息（見表3），并將關聯規則網絡可視化（見圖2）。結合表2～3分析結果可發現，“紅花-桃仁”組合頻數居前列且置信度最高，故將“紅花-桃仁”組合定義為關鍵藥物組合。

表2 用藥頻數≥18的藥物組合

表3 處方中藥物組合的關聯規則（置信度≥0.6）

圖2 關聯規則網絡可視化

2.3 基于復雜熵聚類的核心組合分析復雜系統熵聚類[8]（相關系數=5，懲罰系數=2）分析獲得，核心組合共計13個。（見表4）

表4 核心組合的復雜熵聚類分析結果

2.4 新處方的無監督的熵層次聚類分析提取“2.3”結果，通過無監督的熵層次聚類分析獲得新方相關核心組合8個，新處方4個。（見表5～6）

表5 新處方聚類核心組合

表6 治療氣滯血瘀型肝癌的新處方

2.5 “紅花-桃仁”治療肝癌的機制分析

2.5.1 肝癌的差異基因表達及“紅花-桃仁”治療肝癌的潛在靶點蛋白互作分析 從GEO數據庫下載GSE121248芯片分析獲得差異基因（見圖3A），與“紅花-桃仁”作用靶點取交集獲得“紅花-桃仁”組合治療肝癌的潛在靶點（見圖3B）。經STRING平臺蛋白互作分析后利用Cytoscape 3.8.0軟件CytoNCA插件進行分析。結果顯示靶點CDK1、CCNA2、AURKA、TOP2A、AURKB、KIF11、CDC25C、CHEK1、TTK、WEE1居前十位。（見圖3C）

圖3 “紅花-桃仁”治療肝癌的潛在靶點獲取及蛋白互作分析

2.5.2 潛在靶點的富集分析結果 利用DAVID 6.8對治療潛在靶點進行GO功能與KEGG通路富集分析。（見圖4）GO靶點功能分析包括生物過程（BP）、細胞定位（CC）與分子功能（MF）。GO功能分析結果顯示潛在靶點的生物過程富集結果主要在類固醇代謝過程（steroid metabolic process）、氧化還原過程（oxidation-reduction process）、對藥反應（response to drug）等；細胞定位富集結果主要在胞質溶膠（cytosol）、核質（nucleoplasm）、細胞器膜（organelle membrane）等；分子功能富集結果主要與藥物結合（drug binding）、類固醇激素受體活性（steroid hormone receptor activity）、蛋白激酶活性（protein kinase activity）等相關。KEGG通路富集結果顯示潛在靶點主要參與HIF-1信號通路、p53信號通路、PPAR信號通路、TNF信號通路等。

圖4 潛在靶點的富集結果

2.5.3 “紅花-桃仁”治療肝癌的“藥物-成分-靶點-通路”調控網絡構建 利用Cytoscape軟件構建“紅花-桃仁”治療肝癌的前20條通路的多層次調控網絡。網絡包含130個節點與499條邊，其中成分33個，前20條通路相關潛在靶點75個。（見圖5）

圖5 藥物-成分-靶點-通路調控網絡

3 討 論

肝癌是指發生在肝細胞或肝內膽管細胞的惡性腫瘤，其發生多伴隨有結節、腫塊等病理產物，與中醫“癌腫”“癥瘕”相合[9-10]。氣滯血瘀證是肝癌的常見證型，在肝癌發生的全過程都可出現[5]。氣滯血瘀的發生可導致一系列臨床癥狀的出現，氣滯可阻滯血絡，則瘀血內生，又可逆阻痰氣，致使痰瘀互結，聚于脅下，日久呈積；肝主疏泄，氣機阻滯，肝氣不疏，木橫侮土，脾失健運，痰濕內生。瘀血可因氣滯而成，又可加重氣滯，瘀血內阻可化熱內灼，耗氣傷陰，敗血痰濕煎灼可生內毒，熱毒熏灼膽汁可致發黃；瘀血堵絡，津液代謝失運，瘀血水濕互結可致鼓脹[11-12]。由此可見，氣滯血瘀可致氣血水濕互結，毒熱內灼，加重患者病情，故對肝癌的氣滯血瘀證的合理施治尤為重要。

本研究篩選獲得治療氣滯血瘀型肝癌的方劑95首，共227味中藥，其中使用頻數≥15的中藥29味，即補氣藥：白術、甘草、黃芪、黨參；理氣藥：枳殼、香附、陳皮、枳實；活血藥：桃仁、丹參、莪術、郁金、紅花、川芎、穿山甲、延胡索、三棱；補血藥：當歸、白芍；清熱藥：白花蛇舌草、赤芍、牡丹皮、半枝蓮；補陰藥：鱉甲；消食藥：雞內金；利水滲濕藥：茯苓、茵陳、薏苡仁；解表藥：柴胡。以上藥物分類體現了氣滯血瘀型肝癌用藥的重點在于調理氣血，其治法在于“理氣活血以化瘀、補益氣血以生新”。95首方劑中227味中藥的性味歸經分析結果顯示，藥物以寒性、溫性、平性藥物為主，苦味、甘味、辛味藥物居多，入肝經、脾經、胃經藥物占比較大。苦寒、甘溫可清熱、除熱，氣滯血瘀型肝癌瘀血內阻，熱毒內盛，清熱除熱可減少氣陰耗損、內息毒熱；熱毒損耗氣陰，而甘寒可養陰，使氣血化生有源；辛味可助發散、行氣、行血，利于氣滯血瘀證的治療，由此可見性味分析用藥結果的合理性。中藥多入肝經、脾經、胃經，病在肝體，久病必然折損肝體，入肝經之藥既可補益肝體，又可助肝之疏泄等功能恢復。入脾胃經利于健脾益氣、運化痰濕，可針對性地治療氣血水互結病機。因而高頻組合與核心組合多以苦寒、入肝經藥物組成，其亦是中醫治療氣滯血瘀型肝癌的清熱化瘀、補肝體治法思想體現。新處方（4）尤為體現這一思想，其主要藥物與《醫林改錯》的血府逐瘀湯極為相似。以生地黃清熱涼血，牛膝引瘀血下行，桔梗行氣載藥，桃仁、紅花活血祛瘀，白術益氣化痰飲水濕，然牛膝又可補肝腎，生地黃可滋陰養血[13]。這與古代中醫名家治療思想相合，故所得新處方可對當代臨床用藥提供較良好參考。

針對“紅花-桃仁”組合治療肝癌的機制探索發現位居前十的潛在靶點分別為CDK1、CCNA2、AURKA、TOP2A、AURKB、KIF11、CDC25C、CHEK1、TTK、WEE1。LIU H M等[14]通過運用miR-1271-5p靶向CDK1可抑制細胞增殖、改變細胞周期分布并增強肝癌細胞系的放射敏感性。JIN X H等[15]研究發現抑制AURKA-mTOR-eIF4E軸、降低AURKA表達可在肝癌細胞中發揮抗腫瘤作用。CAI H等[16]通過分析腫瘤組織與癌旁組織發現TOP2A在腫瘤組織中的表達明顯高于癌旁組織，提示TOP2A的表達水平與肝癌病程進展與不良預后相關。其余部分靶點亦存在與肝癌相關的報道。潛在靶點的通路富集主要與HIF-1信號通路、p53信號通路、PPAR信號通路、TNF信號通路等相關。現有的研究表明HIF-1信號通路、p53信號通路、PPAR信號通路、TNF信號通路與肝癌細胞凋亡、腫瘤代謝、腫瘤炎癥免疫及疾病預后密切相關，針對性地干預相關通路可有效阻斷疾病進程[17-21]。

綜上所述，本課題組通過檢索各大數據庫現有的臨床研究報道，建立了中醫藥治療氣滯血瘀型肝癌的處方數據庫，借助中醫傳承輔助平臺進行分析總結其用藥規律，利用網絡藥理學的方法探索關鍵藥物組合治療肝癌的潛在機制。