酸駱駝奶中酵母菌的分離與鑒定

摘 要：酸駱駝奶是一種營養價值很高的具有濃厚民族特色的保健飲品。本文以酸駱駝奶中酵母菌為研究對象，通過對其中的酵母菌擴大培養并且分離出較純的菌株進行鑒定。

關鍵詞：酸駱駝奶；酵母菌；分離鑒定

1 引言

作為一種高品質的乳飲料，酸駱駝奶有著悠久的歷史，我國的哈薩克族和蒙古族等民族在遠古時代就有制作和飲用駱駝奶的習慣。酸駱駝奶中營養豐富，更加適合于人體代謝。傳統的酸駱駝奶的制作方法，使其中的微生物得到了很好的保存，尤其是酵母菌的自然特性，使得酵母菌在乳制品中發揮著極其重要的作用。自然發酵駱駝奶中含有大量的酵母菌，它與駱駝奶的生物活性和醫療保健作用密切相關，不僅能抵抗發酵過程中有害菌的污染，而且在代謝過程中能夠產生抗菌物質并促進微生物B1、B2、B12等的合成。

2 試驗材料

2.1 試驗原料

酸駱駝奶10ml、酵母粉、蛋白胨、葡萄糖、瓊脂粉、牛肉膏、氯化鈉、玉米粉、干麥芽酚、干酵母粉。

2.2 培養基

YEPD培養基、硝酸鹽還原試驗培養基、Gorodkowa瓊脂培養基、醋酸鹽瓊脂培養基、玉米粉瓊脂培養基

2.3 試驗儀器

生化恒溫培養箱、超凈工作臺、滅菌鍋、冰箱、電子分析天平、熱空氣消毒箱、雙頻數控超聲波清洗器。

3 試驗方法

菌種活化→擴大培養→初次擴培→二次擴培→收獲→收集菌體→形態學鑒定→繁殖方式的觀察→生化鑒定→收集數據

3.1 擴大培養

所使用的培養基為YEPD液體培養基，酵母粉5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，蒸餾水500mL，調至Ph 6.0（NaoH）。取在零攝氏度冰箱中保存的菌液2ml加入到500mlYEPD液體培養基中活化12h，將2ml活化的菌液再加入到100ml YEPD液體培養基中培養24h，最后將20ml菌液加入到500ml YEPD培養基中進行擴大培養。

3.2 收集菌體

配置YEPD固體培養基，即酵母粉5g，蛋白胨10g，葡萄糖10g，蒸餾水500mL，瓊脂粉10g調至Ph6.0（NaoH），并且在高壓蒸汽滅菌鍋121攝氏度下滅菌20min，然后將培養基傾倒到10支試管中并形成斜面。將擴大培養的菌液在無菌實驗室中接種到試管斜面上，放在29.5攝氏度的恒溫箱中培養24h。將樣品用平板稀釋法在沙堡弱氏培養基上于25℃培養1～3d。挑取疑似酵母菌的單菌落，美藍染色后做顯微鏡檢查，確認為酵母菌的接種到沙堡弱氏斜面培養基上，純化2～3次，置于4℃冰箱中保存。

3.3 實驗方案

3.3.1 形態學鑒定（菌落形態、細胞形態、菌絲生成）

將被檢菌用平板稀釋法在沙堡弱氏培養基上20～25℃培養1～3d，選擇單個菌落觀察其顏色、形狀、透明、光滑、濕潤和邊緣整齊等特征。而后將被檢菌接種到沙堡弱氏斜面培養基上，25℃培養24h。美藍染色后進行顯微鏡檢查，觀察被檢菌的繁殖方式是出芽生殖或者分裂生殖。

3.3.2 酵母菌的生化鑒定

（1）不同生長條件對菌株的影響

過程：把菌種接種在相同的YEPD液體培養基上，并分裝成不同的試管當中，放在不同溫度的培養箱中進行培養，1號恒溫箱溫度為4℃，2號恒溫箱溫度為29℃，3號恒溫箱溫度為39℃，培養1～2d，取出并且觀察酵母菌在試管中的生長情況；把菌種接種在不同PH和酒精度的液體培養基上，并分裝成不同的試管當中，將幾支試管同時置于29℃恒溫箱中培養1～2d，取出并且觀察酵母菌在試管中的生長情況。

（2）硝酸鹽的還原實驗

過程：將被檢菌的生長旺盛的酵母菌接種在硝酸鹽培養基中，25℃下培養1～7d，滴加甲、乙混合液（1：1），每5mL培養液加混合液0.1mL后，觀察結果，呈現紅色為陽性，若無紅色出現，應進一步檢查，向上述試驗管中加少許鋅粉，若出現紅色，表示硝酸鹽仍存在，為陰性反應（硝酸鹽在醋酸的存在下，鋅粉將其還原成亞硝酸鹽，進一步形成芳基肼紫紅色化合物）；若不產生紅色，表示硝酸鹽已被還原為氨和氮，仍為陽性反應。（注：甲液：將對氨基苯磺酸0.8g溶解于2.5mol/L乙酸溶液100mL中。乙液：將甲萘胺0.5g溶解于2.5mol/L乙酸溶液100mL中。使用方法：接種后在36±1℃培養1～4d，加入甲液和乙液各一滴，觀察結果。硝酸鹽還原為亞硝酸鹽時于立刻或數分鐘內顯紅色。）

（3）類淀粉物質生成實驗

過程：將酵母菌接種到含有一種糖或一種多烴糖醇的液體培養集中，待生長以后，取一滴盧戈氏碘液滴入該試管中，然后把培養基和酵母菌一起搖動。如果呈現藍色，紫色或者是綠色表示該實驗結果是陽性的。盧戈氏碘液是5g碘、10g碘化鉀加水到100ml配制而成的，先用10ml水將碘和碘化鉀溶解，然后再將其余的水加入搖勻。應用時，該溶液還需再以1：5的比例稀釋。

（4）糖類發酵實驗

過程：本實驗需要使用杜氏管，即一支約150mm×12mm的大試管中間套有一支約50mm×6mm的小試管。在0.6%酵母浸汁中加入葡萄糖，使糖濃度達到2%，再將其分裝于含杜氏管的試管中（注意使杜氏管中沒有氣泡）。在115℃高壓滅菌15min后，將生長旺盛的菌種接入發酵管中，25℃培養，每天觀察結果。

（5）碳源同化實驗

過程：將液體培養基分裝在數支試管中，每支試管中的培養基是等量的。該培養基除了用不含碳源的作為陰性對照外，都含有一種試驗基質。為了接種，試驗用酵母菌適合生長的培養基上，如麥芽汁-酵母膏-葡萄糖-蛋白胨瓊脂，并把生長活潑的培養物懸浮在含氮源的培養基內。為保持培養結果穩定，通常做法就是使試管傾斜，通過暴露最大的表面來增加通氣量，而且每天用手振動它，也可以放到要床上進行振動。通常用肉眼來判別菌的生長，把陰性反應管和陽性反應管作為對照。

4 試驗結果

將純化出來的菌種進行活化培養，稀釋涂布，培養48h后，觀察其菌落形態，并挑取單菌落進行革蘭氏染色，觀察其菌體形態可以看出，此酵母菌為革蘭氏陽性菌，其形態特征表現為形狀輕微不規則，圓形末端的菌，通常單個，成對，小簇存在。菌落為不規則型，圓形凸起，光滑，邊緣整齊，菌落顏色為白色或乳白色。

菌細胞1-9號中：1、2號菌，橢圓形，有假菌絲形成，子囊內有圓形或橢圓形的子囊無擲孢子。葡萄糖發酵陽性，硝酸鹽還原反應陰性、類淀粉物質的生成試驗陰性或陽性。形態學、生化特性符合酵母屬特性，歸為酵母屬。7號菌細胞為芽殖，不形成菌絲，子囊內有1～4個孢子。葡萄糖發酵陽性，硝酸鹽還原、類淀粉物質的生成試驗陰性。形態學、生化特性符合有孢圓酵母屬特性，歸為有孢圓酵母屬。3、4、8、9號菌細胞均臘腸形。4株菌均無有性生殖，有菌絲形成，葡萄糖發酵陽性，硝酸鹽還原、類淀粉物質的生成試驗陰性。形態學、生化特性符合克勒克酵母屬特性，歸為克勒克酵母屬。

參考文獻

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[3]王庭柱，高學軍，叢玉婷，范曉男.發酵乳球菌菌株的分離鑒定[J].食品科學，2007，43（7）.

作者簡介：鄧時莉（1980，3-），女，漢族，石河子大學食品學院食品工程專業研究生，新疆石河子職業技術學院講師。

吳躍華，男，就讀于新疆石河子職業技術學院。