不同乳酸菌發酵的黃秋葵汁液在模擬體外消化過程中總多酚及抗氧化活性的變化

汪瑞敏，楊娜，李博巖，張清海，3，劉丹丹，孫大利*

（1.貴州醫科大學公共衛生學院，貴州貴陽550025；2.環境污染與疾病監控省部共建教育部重點實驗室（貴州醫科大學），貴州貴陽550025；3.貴州醫科大學貴州省食品質量與安全科技服務平臺，貴州貴陽550025）

黃秋葵[Abelmoschus esculentus（Linn.）Moench]又名糊麻、秋葵、羊角豆、補腎菜，是一年生藥食兩用的蔬菜。原產于非洲，現已在世界不同國家/地區種植，主要分布在熱帶、亞熱帶等地區[1]。近年來，黃秋葵在中國很多省份也得到廣泛的種植，如江蘇、湖南、江西、廣東、貴州等。秋葵嫩果富含多糖、多酚、黃酮等生物活性物質，具有廣泛的生理功能，如抗氧化、降血脂和降血糖等[2-3]。

黃秋葵既可以作為日常蔬菜直接食用，又可以作為新型食品和藥品開發的新資源。目前黃秋葵的產品形式有秋葵飲料、秋葵泡菜、秋葵茶、秋葵脆等。未來黃秋葵的發展方向是通過合適的加工方式提高黃秋葵活性成分的利用率。乳酸菌本身不僅具有清除自由基的能力，并且可以通過發酵提高發酵液的抗氧化能力。有研究報道，經乳酸菌發酵的藍莓[4]、卷心菜[5]等發酵液中總多酚含量和抗氧化活性顯著提高；同時，不同乳酸菌發酵桂圓肉，桂圓肉中酚類物質的釋放和清除自由基的能力也隨發酵劑的不同發生顯著變化[6]。因此，本研究利用不同乳酸菌發酵黃秋葵汁液，以求篩選合適的發酵劑，增加黃秋葵發酵汁液中活性成分的含量。但是，即使一種食物中含有豐富活性成分也不能反映其在體內生物利用度。通過人體實驗或動物實驗研究活性成分在機體消化和吸收過程中的變化存在一定困難，體外模擬消化具有操作簡單、試驗條件易于控制、試驗周期較短等優點，是研究食物在人體消化過程中變化的重要途徑。目前，體外模擬消化已廣泛應用于食品營養素消化率、生物利用度、結構變化以及對某些植物化學物質和抗氧化活性的影響[7]。

目前不同發酵劑發酵對黃秋葵活性成分的釋放和利用率變化的影響研究基本空白，本研究以新鮮黃秋葵為原料，以植物乳桿菌、干酪乳酸桿菌、鼠李糖乳桿菌、長雙歧桿菌為發酵劑，對不同乳酸菌發酵的黃秋葵進行體外消化，并對含量變化及抗氧化活性進行了評價。為豐富黃秋葵的加工形式、提高黃秋葵活性成分的利用、明確消化過程中乳酸菌發酵對酚類物質和抗氧化穩定性的影響、篩選更為合適的發酵劑提供基礎理論數據和思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

黃秋葵：市售。碳酸鈉、苯酚、濃硫酸、葡萄糖、乙醇、氯化鉀、磷酸二氫鉀、硫氰化鉀、硫酸鈉、氯化鈉、碳酸氫鈉、尿素、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（1，1-dipheny1-2-picryl-hydrazyl，DPPH）（98%）、2，2'-聯氨-雙（3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸）[2，2'-azinobis（3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid） diammonium salt，ABTS]：梯希愛（上海）化成工業發展有限公司；沒食子酸、福林酚、α-淀粉酶（380 U/mg）、胰酶（250 U/mg）、胃蛋白酶（3 000 U/mg）、膽汁鹽：北京索萊寶科技有限公司。以上試劑均為分析純。菌種（植物乳桿菌、干酪乳酸桿菌、鼠李糖乳桿菌、長雙歧桿菌）：山東中科嘉億生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

T6型新世紀紫外可見分光光度計：北京普析通用儀器有限公司；恒溫振蕩培養箱（ZQWY-218N型）：上海知楚儀器有限公司；FE20實驗室pH計：上海儀電科學儀器股份有限公司；PL3002電子天平：梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；JYL-Y912破壁機：杭州九陽生活電器有限公司；ST16R冷凍離心機：美國Thermo Fisher Scientific公司。

1.3 方法

1.3.1 黃秋葵發酵液制備

將新鮮的黃秋葵去蒂洗凈，沸水中熱燙5 min，滅酶，切塊打漿后得到黃秋葵汁液，于90℃熱殺菌10min，然后水浴冷卻。將不同的乳酸菌按黃秋葵汁液質量的5%進行接種，置于37℃條件下培養24 h，得到黃秋葵發酵液，于-80℃冰箱下保存待測。

1.3.2 體外模擬消化試驗

參考Wang等[8]、KOH等[9]的研究方法，略作修改。

口腔消化過程：用0.1mol/L的HCl將人造唾液培養基（290 mg α-淀粉酶，89.6 g/L KCl，175.3 g/L NaCl，88.8 g/L NaH2PO4，20.0 g/L KSCN，57.0 g/LNa2SO4，84.7 g/L NaHCO3，2.0 g/L尿素）的pH值調至6.8，備用。然后將20 mL發酵液樣品與6 mL人造唾液培養基混合均勻后放入含有40 mL蒸餾水的燒瓶中，并在恒溫振蕩培養箱中37℃培養5 min。然后將10 mL唾液培養基轉移到新的試管中并在沸水中保持5 min以停止反應。冷卻后，將試管中培養基的pH值調節至中性，然后在10 000×g、4℃下離心10 min。得到的上清液為口腔消化組樣品，之后進行成分測定及活性檢測，所有試驗平行測定3次。

模擬胃消化過程：用HCl（6 mol/L）將剩余培養基的pH值調節至2.0，并加入溶解在0.1 mol/L HCl中的胃蛋白酶（15 mg）開始胃消化。然后將混合物在37℃下孵育2h。胃消化過程中，每隔30min取出10mL胃培養基，用NaOH（0.1 mol/L）將pH值調節至7.0以停止反應。將取出的消化液在10 000×g、4℃下離心10 min，得到的上清液為胃消化樣品，之后進行成分測定及活性檢測，所有試驗平行測定3次。

模擬腸道消化過程：用NaHCO3（0.5 mol/L）將剩余胃培養基的pH值調節至6.5，并向溶液中加入5 mL胰酶（8 mg/mL）和膽汁鹽（50 mg/mL）的混合物。并在37℃下再孵育4h。腸道消化過程每隔60min取出10mL腸內培養基。然后將取出的消化液在4℃、10 000×g條件下離心10 min，得到的上清液為腸道消化樣品，之后進行成分測定及活性檢測，所有試驗平行測定3次。

1.3.3 總多酚含量測定

參照Meda等[10]的方法并稍作修改。將1 mL樣品與5 mL 10%的福林酚試劑混合均勻，反應6 min后，用4 mL 7.5%的碳酸鈉溶液中和。將上述混合物在室溫（25℃）、黑暗環境放置30 min，在765 nm處測定吸光度。對照組用蒸餾水代替樣品溶液和福林酚試劑，以沒食子酸作為標準品計算總多酚含量，線性回歸方程y=0.010 3x+0.003 7，R2=0.998 1。多酚含量以mg沒食子酸當量（gallic acid equivalents，GAE）/100 g鮮重（fresh weight，FW），即 mg GAE/100 g FW 表示。

1.3.4 抗氧化能力測定

1.3.4.1 DPPH自由基清除能力測定

取1 mL樣品加入4 mL DPPH-乙醇（0.1 mmol/L）溶液，混合均勻并在室溫（25℃）下靜置20 min。以蒸餾水代替樣品作對照，并用蒸餾水作為空白調零[11]。在517 nm處測定吸光度，計算公式如下。

式中：A0為對照品吸光度；A1為樣品吸光度。

1.3.4.2 ABTS+自由基清除能力測定

參照Gowd等[12]方法，略作修改。將7.0 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L過硫酸鉀溶液（1∶1，體積比）混合，并在室溫（25℃）下避光保存12 h～16 h以形成ABTS工作液。將新鮮制備的ABTS溶液在734 nm處的吸光度調為0.7±0.02。將1.3.2中制備的3種消化液、樣品和空白（甲醇）各0.5 mL加入ABTS工作液4.5 mL，并使用渦旋混合器充分混合，在黑暗中于25℃的水浴中孵育10 min。在734 nm波長處測定吸光度。ABTS+自由基清除率計算公式如下。

式中：A0為對照品吸光度；A1為樣品吸光度。

1.3.5 統計分析

所有試驗均重復3次，使用Origin pro 2018C軟件繪圖，采用SPSS 22.0軟件進行數據處理，平均值的差異性采用單因素方差分析（one-way ANOVA）中的最小顯著性差異法（least significant difference，LSD）進行檢驗，P＜0.05表示差異顯著。數值用平均值±標準差表示。

2 結果與分析

2.1 體外模擬消化過程中總多酚含量變化規律

黃秋葵模擬體外消化過程中總多酚釋放量的變化見圖1。

圖1 黃秋葵模擬體外消化過程中多酚釋放量的變化Fig.1 Changes in total polyphenols of okra in vitro digestion

模擬體外消化前，由圖1可知，經植物乳桿菌（70.74mg GAE/100gFW）和鼠李糖乳桿菌（64.45mg GAE/100 g FW）發酵以后的黃秋葵汁液總多酚含量比未發酵組（60.86 mg GAE/100 g FW）顯著升高（P＜0.05），分別提高了1.16倍和1.06倍。而經干酪乳酸桿菌（60.07 mg GAE/100gFW）和長雙歧桿菌（58.42mg GAE/100 g FW）發酵的黃秋葵汁液中總多酚含量與未發酵組對比，并未發生顯著變化。有研究表明微生物可以產生果膠酶、纖維素酶、半纖維素酶，這些酶可以有效地將不溶性的結合酚轉化為可溶性多酚[13]。

模擬口腔消化過程，發酵黃秋葵與未發酵組的多酚釋放量在消化5 min內，有一定的提高，但差異均不顯著（P＞0.05）。模擬體外胃消化過程中，黃秋葵多酚釋放量在消化30min內顯著升高，達到釋放最高點（P＜0.05），各乳酸菌發酵后的多酚釋放量分別為76.79、63.95、69.80、62.98mg GAE/100g FW，并在之后的胃消化過程中，多酚釋放量趨于穩定（P＞0.05）；其中經植物乳桿菌發酵的黃秋葵在胃消化的30min內多酚釋放量最大，未發酵組多酚釋放量變化最顯著，由65.85mg GAE/100g FW降低至49.95 mg GAE/100 g FW，減少24.15%。在胃消化結束時，經過不同乳酸菌發酵的多酚釋放量分別為64.53、59.66、59.27、56.41 mg GAE/100 g FW。

在體外模擬腸道消化過程中，未發酵的黃秋葵多酚釋放量從47.89mg GAE/100g顯著降低到40.28mg GAE/100 g FW（P＜0.05）。植物乳桿菌、鼠李糖乳桿菌、長雙歧桿菌發酵的黃秋葵多酚釋放量經過腸消化以后雖然也顯著降低，但是顯著高于未發酵組。在腸消化結束時，經過不同乳酸菌發酵的多酚釋放量分別為46.42、40.36、44.22、49.20 mg GAE/100 g FW。由上述結果可知，模擬人體消化后植物乳桿菌發酵的消化液中多酚的損失量最低，為29.92%。

經過模擬口腔消化，發現多酚釋放量小幅增加，可能是由于與多糖結合的酚類物質在淀粉酶的作用下被釋放出來。模擬胃液消化后的多酚類物質釋放量在前30 min達到最高值，后續明顯減少，表明模擬胃消化初期，強酸環境和胃蛋白酶的存在下，胃蛋白酶會分解蛋白質，從而使一些與蛋白質結合的多酚類物質釋放出來，同時酸水解破壞酚類物質與其它物質之間的化學鍵，促進多酚的釋放，隨著消化時間的延長，多酚長時間暴露在強酸環境造成多酚的降解，但是無明顯變化[14]。在模擬腸道消化過程中，多酚釋放量明顯減少，可能是多個酚羥基結構的多酚在堿性環境中不穩定，易發生降解[15]。有研究表明，柑橘[16]、南酸棗[17]等食物中的酚物質主要在模擬胃消化過程中釋放，大部分多酚在模擬胃液條件中穩定存在，而在模擬腸液條件下發生降解，與本文研究結果一致。

2.2 體外模擬消化過程中抗氧化活性的變化規律

由于模擬體外消化過程對抗氧化成分的含量和結構都產生很大的影響，所以研究消化過程抗氧化能力的變化也十分重要。本文采用DPPH、ABTS法測定乳酸菌發酵黃秋葵樣品在模擬人體消化過程中抗氧化能力的動態變化，結果見圖2、圖3。

圖2 黃秋葵模擬胃腸消化過程中抗氧化活性（DPPH·）的變化Fig.2 Changes in antioxidant activity（DPPH·）of citrus okra in vitro digestion

模擬消化前，由圖2可知，0 min經不同乳酸菌發酵以后的黃秋葵汁液對DPPH自由基清除率都顯著高于未發酵組樣品（P＜0.05）。消化前各乳酸菌發酵組DPPH自由基的清除率分別為61.06%、52.05%、55.17%、59.62%。黃秋葵發酵液對DPPH自由基清除率隨著消化過程中總多酚含量的變化而變化。在經過體外模擬胃消化30 min時，DPPH自由基清除率達到最高；之后隨著消化時間的延長，總多酚的含量不斷降低，清除率也不斷降低。但是在消化結束時，植物乳桿菌（49.26%）和干酪乳酸桿菌（41.39%）發酵的樣品對DPPH自由基清除率顯著高于未發酵組（34.10%）（P＜0.05）。

圖3 黃秋葵模擬胃腸消化過程中抗氧化活性（ABTS+·）的變化Fig.3 Changes in antioxidant activity（ABTS+·）of citrus okra in vitro digestion

模擬消化前，由圖3可知，經不同乳酸菌發酵后的黃秋葵汁液對ABTS+自由基清除率都顯著高于未發酵組樣品（P＜0.05）。消化前各乳酸菌發酵組的ABTS+自由基清除率分別為57.06%、47.32%、50.35%、55.26%。黃秋葵發酵液對ABTS+自由基清除率隨著消化過程中總多酚含量的變化而變化。在消化結束時，由植物乳桿菌（44.56%）發酵的樣品對ABTS+自由基清除率顯著高于未發酵組（29.14%）（P＜0.05）。由上述結果可知，在消化終點，植物乳桿菌發酵的黃秋葵消化液清除DPPH自由基、ABTS+自由基的能力是未發酵組的1.44、1.53倍。

結果表明發酵液的抗氧化能力與總多酚含量呈正相關。Bouayed等[18]和Jiao等[19]研究了蘋果和藍莓模擬胃腸道消化過程中多酚類和抗氧化活性的變化，同樣發現抗氧化能力與酚類化合物的含量成正比關系。發酵后抗氧化能力增強可能是乳酸菌發酵釋放具有抗氧化能力的酶或者促進發酵樣品中結合態的活性成分釋放，還有可能是由于乳酸菌本身具有的抗氧化能力。

3 結論

通過對比不同乳酸菌發酵的黃秋葵樣品，在模擬體外消化過程中總多酚及抗氧化性的動態變化，以求篩選合適的發酵劑，為豐富提高黃秋葵活性成分吸收的加工方式提供數據支撐。結果表明，經植物乳桿菌發酵以后的黃秋葵汁液中總多酚含量是未發酵組的1.16倍。模擬人體消化后植物乳桿菌發酵的消化液中多酚的損失量最低，為29.92%。在消化終點，植物乳桿菌發酵的黃秋葵消化液清除DPPH自由基、ABTS+自由基的能力是未發酵組的1.44、1.53倍。綜上，植物乳桿菌發酵是提高黃秋葵中多酚含量和生物可及性的有效方式。