雞蛋殼膜多肽酶解工藝及抗氧化活性研究

張偉云，張鳳清

（長春工業(yè)大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，吉林長春130012）

雞蛋殼膜，俗稱“鳳凰衣”[1]，含有90%以上的蛋白質(zhì)，且氨基酸組成合理，是一種優(yōu)質(zhì)蛋白[2]。其中，殼膜中的蛋白質(zhì)主要有角蛋白（keratin）、膠原蛋白（collagen）、卵清蛋白（ovalbumin）、溶菌酶（lysozyme）、骨橋蛋白（osteopontin）等成分[3]。目前，在醫(yī)藥領(lǐng)域具有加速上皮形成[4-5]、消炎[6]及促進(jìn)肌膚生長等功效，同時(shí)對(duì)臨床中褥瘡、皮膚燙傷[7]及外傷性鼓膜穿孔[8]等也有良好的治療效果。但大部分殼膜蛋白中存在大量的二硫鍵，使得殼膜蛋白性質(zhì)相當(dāng)穩(wěn)定，不溶于酸、堿等[9]。殼膜蛋白的難溶性，不易被人體吸收，限制了其加工和應(yīng)用。因此，建立一種溫和、可行且安全的方法用于雞蛋殼膜中蛋白質(zhì)的水解，增加其資源利用率顯得尤為重要。

蛋白酶酶解法，主要通過酶促反應(yīng)將蛋白質(zhì)中的二硫鍵打開，以獲得可溶性多肽[10]。研究發(fā)現(xiàn)，利用蛋白酶酶解法生產(chǎn)抗氧化性酶解液可以得到大量的具有免疫活性[11]、抗高血壓、抑制腫瘤、抗氧化[12]、抗高血脂等功能的生物活性肽[13]。

本研究采用酶解法，將雞蛋殼膜酶解成小分子肽，并對(duì)其酶解工藝進(jìn)行優(yōu)化。通過測(cè)定雞蛋殼膜多肽不同抗氧化體系的清除效果，研究其體外抗氧化活性，旨在為雞蛋殼膜綜合利用提供科學(xué)依據(jù)，同時(shí)使雞蛋殼膜變廢為寶，可以改善環(huán)境，提高產(chǎn)品經(jīng)濟(jì)附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

雞蛋殼膜：市售；堿性蛋白酶（AP-200a）（20萬 U/g）：安琪酵母股份有限公司；胃蛋白酶（3萬U/g）、木瓜蛋白酶（10萬 U/g）、復(fù)合蛋白酶（50萬 U/g）（均為食品級(jí)）：河南萬邦實(shí)業(yè)有限公司；2，2－聯(lián)苯基－1－苦基肼基（DPPH）、2，2'－聯(lián)氨－雙（3－乙基苯并噻唑啉－6－磺酸）二銨鹽（ABTS）：上海麥克林生化科技有限公司；抗壞血酸（VC）：國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；鄰苯三酚：北京化工廠；pH精密試紙：上海三愛思試劑有限公司；海洋魚低聚肽校正曲線標(biāo)準(zhǔn)品：上海曦玉分析儀器科技有限公司；其它試劑均為分析純。

UV-5500紫外可見分光光度計(jì)：上海元析儀器有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋：金壇市江南儀器廠；TG16G型高速離心機(jī)：湖南凱達(dá)科學(xué)儀器有限公司；DYF-200C萬能粉碎機(jī)：上海皓莊儀器有限公司；FD-1A-50型冷凍干燥機(jī)：上海五久自動(dòng)化設(shè)備有限公司；安捷倫1260型四元梯度液相色譜儀：美國安捷倫科技有限公司；TSKgel G2000 SWXL型凝膠柱：上海曦玉分析儀器科技有限公司；JA2003B型千分之一電子天平：上海越平科學(xué)儀器有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 雞蛋殼膜多肽制備的工藝流程

雞蛋殼膜→預(yù)處理（粉碎）→加水溶解→用1.0mol/L的NaOH溶液或HCl調(diào)節(jié)pH值→調(diào)節(jié)水浴溫度→加一定量蛋白酶恒溫酶解→高溫滅活→離心（4000r/min，15 min）→取上清液→冷凍干燥→雞蛋殼膜多肽

1.2.2 酶解試驗(yàn)

1.2.2.1 蛋白酶種類的確定

取雞蛋殼膜，粉碎至粉末，均分成4等份，加適量水?dāng)噭颍x用食品級(jí)胃蛋白酶、堿性蛋白酶（AP-200a）、木瓜蛋白酶和復(fù)合蛋白酶，在各自最適條件下酶解5 h，酶解后高溫滅活10 min，以4 000 r/min離心15 min，取上清液，冷凍干燥得雞蛋殼膜凍干粉。以水解度為指標(biāo)，篩選最適蛋白酶。

1.2.2.2 雞蛋殼膜酶解工藝優(yōu)化

單因素試驗(yàn)：分別研究酶解時(shí)間、料液比、酶添加量3個(gè)因素對(duì)水解度的影響。酶解時(shí)間取 3、4、5、6、7h；料液比取 1∶7、1∶8、1∶9、1∶10、1∶11（g/mL）；酶添加量取0.5%、1.0%、2.0%、3.0%、4.0%，依次將上述3個(gè)因素中的任意2個(gè)因素確定為定值，變化另外1個(gè)因素，考察其變化范圍對(duì)雞蛋殼膜酶解效果的影響。

響應(yīng)面試驗(yàn)：在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以雞蛋殼膜多肽的水解度為響應(yīng)值，考察酶解時(shí)間（A）、料液比（B）、酶添加量（C）3個(gè)因素對(duì)響應(yīng)值的交互影響，根據(jù)Box-Behnken design（BBD）設(shè)計(jì)三因素三水平的響應(yīng)面試驗(yàn)。各因素水平如表1所示。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平Table 1 Factors and levels of response surface experiments

1.2.3 水解度的測(cè)定

總氮含量測(cè)定：采用GB 5009.5—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定》中的凱氏定氮法；氨基酸態(tài)氮含量測(cè)定：采用GB 5009.235—2016《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品中氨基酸態(tài)氮的測(cè)定》中的甲醛值法；水解度（DH）計(jì)算公式見公式1。

1.3 多肽分子量及分布范圍測(cè)定

為了探究本法得到的雞蛋殼膜肽粉中肽的分子量及其分布范圍，本法依據(jù)GB/T 22729—2008《海洋魚低聚肽粉》中的方法進(jìn)行測(cè)定，通過高效凝膠過濾色譜對(duì)肽粉中肽的分子量分布情況進(jìn)行檢測(cè)，以海洋魚低聚肽為校正曲線標(biāo)準(zhǔn)品。

1.4 雞蛋殼膜多肽的體外抗氧化活性測(cè)定

1.4.1 DPPH·清除率測(cè)定

參考王敏等[14]的方法，并作適當(dāng)修改。分別取2.0 mL不同質(zhì)量濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mg/mL）的樣品溶液與系列同等質(zhì)量濃度的VC溶液，再分別加入等量的2.0mL DPPH溶液（0.1mmol/L，溶于無水乙醇）置于具塞試管中，搖勻反應(yīng)30 min，在517 nm下測(cè)定吸光度為A（空白為等量的無水乙醇）。2.0mL乙醇溶液加入2.0mL樣品溶液，搖勻反應(yīng)30 min后，在517 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)j。2.0 mL DPPH溶液加入2.0 mL蒸餾水在517 nm處測(cè)定其吸光度值A(chǔ)0。雞蛋殼膜多肽對(duì)DPPH·的清除能力以清除率R1表示。DPPH·清除率的計(jì)算公式見公式2。

1.4.2 ABTS+·清除率測(cè)定

參考姬晨曦等[15]的方法，并作適當(dāng)修改。取適量體積7.4 mmol/L的ABTS溶液和等體積2.6 mmol/L的過硫酸鉀溶液，混合均勻后室溫（25℃）避光放置12 h～16 h，形成ABTS+儲(chǔ)備液備用。將ABTS+儲(chǔ)備液用無水乙醇稀釋至吸光度為0.70±0.002，即ABTS+工作液備用。分別取 600 μL 不同質(zhì)量濃度（0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0 mg/mL） 的樣品溶液與系列同等質(zhì)量濃度的VC溶液，再分別加入5.0 mL ABTS+工作液置于具塞試管中，搖勻反應(yīng)15 min，在734 nm下測(cè)定吸光度為A（空白為等量的無水乙醇）。5.0 mL乙醇溶液加入600 μL樣品溶液，搖勻反應(yīng)15 min后，在734 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)j。5.0 mL ABTS+工作液溶液加入600 μL蒸餾水在734 nm處測(cè)定其吸光度值A(chǔ)0。雞蛋殼膜多肽對(duì)ABTS+·的清除能力以清除率R2表示。ABTS+·清除率的計(jì)算公式見公式3。

1.4.3 ·OH清除率測(cè)定

參考綦蕾等[16]的方法，并作適當(dāng)修改。分別取2.0mL不同質(zhì)量濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL）的樣品溶液與同等質(zhì)量濃度的VC溶液，再依次加入1 mL 9 mmol/L FeSO4、1 mL 9 mmol/L水楊酸乙醇溶液，混勻后加入1 mL 9 mmol/L H2O2于具塞試管中，在37℃下水浴30 min后，在波長510 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)（空白為等量的蒸餾水），用蒸餾水代替FeSO4、水楊酸乙醇溶液、H2O2，在37℃下水浴30 min后，在波長510 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)j。用蒸餾水代替樣品溶液，在37℃下水浴30 min后，在波長510 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)0。雞蛋殼膜多肽對(duì)·OH的清除能力以清除率R3表示。·OH清除率的計(jì)算公式見公式4。

參考胡小軍等[17]的方法，并作適當(dāng)修改。分別取50 mmol/L、pH8.2的Tris-HCl緩沖液4.5 mL于試管中，在25℃水浴中放置20 min后，再分別加入1.0 mL不同質(zhì)量濃度（0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mg/mL）的樣品溶液與系列同等質(zhì)量濃度的VC溶液，然后加入0.4 mL 25.0 mmol/L的鄰苯三酚溶液、1.0 mL 8.0 mol/L的HCl溶液混勻后，在25℃水浴中放置5 min，在波長為325 nm處測(cè)定吸光度A（空白為等量的蒸餾水）。用蒸餾水代替Tris-HCl緩沖液、鄰苯三酚溶液、HCl溶液，在25℃水浴中放置5 min，在波長為325 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)j。用蒸餾水代替樣品溶液，在25℃水浴中放置5 min，在波長為325 nm處測(cè)定吸光度值A(chǔ)0。雞蛋殼膜多肽對(duì)的清除能力以清除率R4表示。清除率的計(jì)算公式見公式5。

1.4.5 酶的體外抗氧化驗(yàn)證

根據(jù)1.4.2試驗(yàn)方法，用確定的堿性蛋白酶（AP-200a）作為樣品，對(duì)ABTS+·的清除能力進(jìn)行測(cè)定。

1.5 數(shù)據(jù)處理

采用Excel進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，試驗(yàn)結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。采用Origin9.0軟件繪制圖表，通過Design-Expert.V 8.0.6.1軟件獲得響應(yīng)面數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶種類的確定

酶是具有生物活性的蛋白質(zhì)，它具有高效性和專一性，酶種類是酶解過程中最重要的影響因素之一[18]。為了方便比較，在各個(gè)蛋白酶最適溫度和最適pH值下對(duì)雞蛋殼膜進(jìn)行酶解，不同蛋白酶對(duì)水解度的影響如圖1所示。

圖1 酶種類對(duì)酶解效果的影響Fig.1 Effect of enzyme types on enzymatic hydrolysis

由圖1可知，堿性蛋白酶（AP-200a）對(duì)雞蛋殼膜的酶解效果最好，水解度達(dá)到（27.52±1.21）%，而另外3種蛋白酶相對(duì)較低。所以選擇堿性蛋白酶（AP-200a）作為最優(yōu)酶，進(jìn)行后續(xù)酶解工藝的優(yōu)化。

2.2 雞蛋殼膜酶解單因素試驗(yàn)

酶解時(shí)間、料液比、酶添加量對(duì)酶解效果的影響見圖2。

圖2 酶解時(shí)間、料液比、酶添加量分別對(duì)酶解效果的影響Fig.2 Effect of enzymatic hydrolysis time，material-liquid ratio，amount of enzyme on enzymatic hydrolysis effect

由圖2（A）可知，當(dāng)酶解時(shí)間3 h～5 h時(shí)，水解度呈逐漸上升的趨勢(shì)。酶解時(shí)間5h時(shí)，水解度最大。隨著酶解時(shí)間的延長，水解度變化不大，故設(shè)定5 h為較優(yōu)的酶解時(shí)間。由圖 2（B）可知，當(dāng)料液比1∶7（g/mL）～1∶9（g/mL）時(shí)，水解度呈逐漸上升趨勢(shì)，超過1∶9（g/mL）時(shí)，水解度趨于平穩(wěn)，故選 1∶9（g/mL）為較優(yōu)的料液比。由圖 2（C）可知，隨著酶添加量增加，水解度逐漸增大，當(dāng)酶添加量超過2.0%時(shí)，水解度變化不大并趨于平穩(wěn)。因此，最佳的酶添加量為2.0%。

2.3 響應(yīng)面設(shè)計(jì)結(jié)果

2.3.1 BBD模型建立

在最佳酶解條件下，按照表1設(shè)計(jì)進(jìn)行試驗(yàn)，以殼膜多肽水解度為響應(yīng)值，共17組試驗(yàn)，其中5組中心點(diǎn)，每組重復(fù)3次。對(duì)得到的數(shù)據(jù)進(jìn)行擬合，得到的二次回歸方程為Y=27.21+1.38A+0.82B+0.81C+0.02AB+0.025AC-0.023BC-1.78C2-0.95B2-1.06C2。響應(yīng)面分析結(jié)果見表2，響應(yīng)面二次模型的ANOVA分析見表3。

表2 響應(yīng)面分析結(jié)果Table 2 Analysis result for response surface

表3 響應(yīng)面二次模型的ANOVA分析Table 3 ANOVA for response surface quadratic model

續(xù)表3 響應(yīng)面二次模型的ANOVA分析Continue table 3 ANOVA for response surface quadratic model

由表3中ANOVA分析結(jié)果可知，該法所建模型極顯著（P模型＜0.000 1），且失擬項(xiàng)表現(xiàn)為不顯著（P失擬項(xiàng)=0.439 1），具有極好的相關(guān)矯正系數(shù)（R2adj=0.999 9），表明該模型建立成功，對(duì)現(xiàn)實(shí)試驗(yàn)效果具有良好的預(yù)判效果，能很好地模擬現(xiàn)實(shí)試驗(yàn)規(guī)律。

2.3.2 BBD分析

通過對(duì)BBD模型擬合結(jié)果進(jìn)行分析，可以更好地判斷各個(gè)因素間的交互影響以及影響規(guī)律。各因素交互作用對(duì)水解度的影響見圖3。

圖3 各因素交互作用對(duì)水解度的影響Fig.3 Effect of interaction of various factors on hydrolysis degree

如圖3所示，三維圖中坡度的陡峭程度代表因素在交互影響中的顯著性，因素的三維圖越陡峭，顯著性越大；而二維等高線圖則是三維圖的投影，通過其疏密程度可判斷因素的顯著性，在變化區(qū)間內(nèi)，因素的等高線越密集，顯著性越大，對(duì)響應(yīng)值的影響也越大。由圖3a和圖3b可以看出，當(dāng)固定料液比（B）和酶添加量（C），變化酶解時(shí)間（A）時(shí)，酶解時(shí)間對(duì)應(yīng)響應(yīng)值等高線的密度明顯高于料液比和酶添加量的等高線密度，表明酶解時(shí)間在取值范圍內(nèi)變化時(shí)對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性要高于料液比和酶添加量，表3中A、B和C的F值分別為63 146.40、22 282.77和21 476.22，這與上述試驗(yàn)規(guī)律相一致。造成這種現(xiàn)象的原因可能是由于酶解時(shí)間不足，蛋白酶與底物接觸不充分，導(dǎo)致酶促反應(yīng)不充足，酶解過程不完全，所得多肽含量較低；當(dāng)酶解時(shí)間過長時(shí)則會(huì)導(dǎo)致部分多肽進(jìn)一步水解成氨基酸，使水解度稍微下降。此現(xiàn)象與圖3中二維等高線圖規(guī)律相符，當(dāng)酶解時(shí)間、料液比和酶添加量處于低值時(shí)，殼膜蛋白水解度均低于20%，而當(dāng)酶解時(shí)間、料液比和酶添加量高于 5 h、1∶9（g/mL）和 2%時(shí)，殼膜蛋白的水解度普遍高于27%。圖3c中可以看出，料液比與酶添加量的二維等高線變化趨勢(shì)相類似，但二維圖中等高線呈橢圓形，表明料液比對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性略高于酶添加量。引起這種結(jié)果的原因是當(dāng)料液比過低時(shí)，雞蛋殼膜不易分散，易形成聚集體，殼膜與蛋白酶接觸面積降低，酶解效率下降，水解度降低；而料液比過高時(shí)，對(duì)蛋白酶和殼膜起到稀釋作用，使得兩者接觸幾率下降，水解度稍微下降。因此，BBD試驗(yàn)結(jié)果表明，因素變化對(duì)響應(yīng)值影響的顯著性規(guī)律為酶解時(shí)間（A）＞料液比（B）＞酶添加量（C），這與表3中的試驗(yàn)數(shù)據(jù)相符。

2.3.3 最優(yōu)條件確定及回歸模型驗(yàn)證

在設(shè)定的取值范圍內(nèi)，以最大水解度為指標(biāo)，對(duì)試驗(yàn)預(yù)期結(jié)果進(jìn)行最優(yōu)化擬合，選擇各個(gè)因素的最佳取值為酶解時(shí)間 5.39 h，料液比 1∶9.43（g/mL），酶添加量2.38%，此時(shí)殼膜蛋白水解度為27.81%。依據(jù)現(xiàn)實(shí)試驗(yàn)可行性，將酶解條件調(diào)整為酶解時(shí)間5 h，料液比1∶9.5（g/mL），酶添加量 2.4%，在此條件下，重復(fù)進(jìn)行6次驗(yàn)證試驗(yàn)，得到的平均水解度為27.15%。試驗(yàn)結(jié)果表明，通過BBD設(shè)計(jì)結(jié)果建立的二次多元回歸模型可以很好的擬合現(xiàn)實(shí)試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)試驗(yàn)結(jié)果具有較好的預(yù)測(cè)性。

2.4 雞蛋殼膜多肽的分子量分布

在BBD優(yōu)化后的最佳工藝條件下，通過高效凝膠色譜法對(duì)酶解后殼膜多肽中肽的相對(duì)分子質(zhì)量大小及分布情況進(jìn)行檢測(cè)。肽分子量分布餅狀圖見圖4。

圖4 肽分子量分布餅狀圖Fig.4 Molecular mass distribution of polypeptides in a pie chart

如圖4所示，酶解后的雞蛋殼膜多肽中分子量在5 000 Da以下的肽段占98.1%，其中小于1 000 Da的小分子肽占90.9%。該法得到的1 000 Da以下的分子肽所占比例較高，此類小分子肽更易被人體消化吸收，且具有大分子蛋白質(zhì)所沒有的一些物理化學(xué)特性，尤其是分子量較小的肽段，具有一定的抗氧化性[19-20]，試驗(yàn)預(yù)期效果良好，可用于雞蛋殼中殼膜蛋白的酶解。

2.5 雞蛋殼膜多肽體外抗氧化結(jié)果

2.5.1 雞蛋殼膜多肽對(duì)DPPH·清除能力

按照1.4.1試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn)，以雞蛋殼膜多肽質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以DPPH·清除率為縱坐標(biāo)，雞蛋殼膜多肽的DPPH·清除能力見圖5。

圖5 雞蛋殼膜多肽清除DPPH·的效果Fig.5 Effect of eggshell membrane in removing DPPH·

DPPH·是一種穩(wěn)定的有機(jī)氮自由基，在乙醇溶液中顯深紫色，能吸收抗氧化物的電子而引起樣品顏色的改變，其褪色程度與接受電子數(shù)成正比[21]。VC是較好的抗氧化劑，將雞蛋殼膜多肽的抗氧化能力與VC的抗氧化能力進(jìn)行比較。由圖5可知，雞蛋殼膜多肽對(duì)DPPH·清除率弱于VC，但是隨著質(zhì)量濃度的增加，雞蛋殼膜多肽對(duì)DPPH·清除率逐漸增大。當(dāng)雞蛋殼膜多肽質(zhì)量濃度為0.4 mg/mL時(shí)，對(duì)DPPH·清除率為（93.03±0.51）%，同種質(zhì)量濃度下VC的清除率為（95.63±0.97）%，與VC的效果相當(dāng)。

2.5.2 雞蛋殼膜多肽對(duì)ABTS+·清除能力

按照1.4.2試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn)，以雞蛋殼膜多肽質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以ABTS+·清除率為縱坐標(biāo)，雞蛋殼膜多肽的ABTS+·清除能力見圖6。

圖6 雞蛋殼膜多肽清除ABTS+·的效果Fig.6 Effect of eggshell membrane in removing ABTS+·

ABTS經(jīng)氧化后會(huì)生成藍(lán)綠色ABTS+·，雞蛋殼膜多肽可清除ABTS+·，從而使ABTS+·母液在一定程度褪色。由圖6可看出，雞蛋殼膜多肽和VC都有清除ABTS+·的能力，雞蛋殼膜多肽對(duì)ABTS+·清除率弱于VC，但是隨著質(zhì)量濃度的增加，雞蛋殼膜多肽對(duì)ABTS+·清除率逐漸增大。當(dāng)雞蛋殼膜多肽質(zhì)量濃度為0.9 mg/mL 時(shí)，對(duì) ABTS+·清除率為（94.53±0.92）%，同種質(zhì)量濃度下VC的清除率為（98.50±0.70）%，與VC的效果相當(dāng)。說明雞蛋殼膜多肽也具有較好的清除ABTS+·的能力。

2.5.3 雞蛋殼膜多肽對(duì)·OH清除能力

按照1.4.3試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn)，以雞蛋殼膜多肽質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以·OH清除率為縱坐標(biāo)，雞蛋殼膜多肽的·OH清除能力見圖7。

圖7 雞蛋殼膜多肽清除·OH的效果Fig.7 Effect of eggshell membrane in removing·OH

由圖7可知，雞蛋殼膜多肽和VC都有清除·OH的能力，雞蛋殼膜多肽對(duì)·OH清除率較弱于VC，但是隨著質(zhì)量濃度的增加，雞蛋殼膜多肽對(duì)·OH清除率逐漸增大。當(dāng)雞蛋殼膜多肽質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL時(shí)，對(duì)·OH清除率為（43.33±1.10）%，同種質(zhì)量濃度下VC的清除率為（99.07±0.25）%，在相同質(zhì)量濃度下，·OH清除率為VC的43.74%，較VC有一定差距。

按照1.4.4試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn)，以雞蛋殼膜多肽質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以清除率為縱坐標(biāo)，雞蛋殼膜多肽的清除能力見圖8。

圖8 雞蛋殼膜多肽對(duì)清除能力Fig.8 Effect of eggshell membrane in removing

由圖8可知，雞蛋殼膜多肽和VC都有清除的能力，雞蛋殼膜多肽對(duì)清除率較弱于VC，但是隨著質(zhì)量濃度的增加，雞蛋殼膜多肽對(duì)清除率逐漸增大。當(dāng)雞蛋殼膜多肽質(zhì)量濃度為3.0 mg/mL時(shí)，對(duì)清除率為（53.40±0.70）%，同種質(zhì)量濃度下 VC的清除率為（99.20±0.44）%，在相同質(zhì)量濃度下，清除率為VC的53.83%，較VC有一定差距。

2.5.5 堿性蛋白酶對(duì)ABTS+·清除能力

按照1.4.2試驗(yàn)方法進(jìn)行試驗(yàn)，以堿性蛋白酶（AP-200a）質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，以ABTS+·清除率為縱坐標(biāo)，堿性蛋白酶（AP-200a）對(duì)ABTS+·清除能力見圖9。

由圖 9可知，堿性蛋白酶（AP-200a）對(duì) ABTS+·清除能力很弱，當(dāng)濃度達(dá)到1.0 mg/mL時(shí)，對(duì)ABTS+·的清除率為（7.11±0.54）%，而雞蛋殼膜多肽和VC的清除能力都接近100%。結(jié)果表明，雞蛋殼膜凍干粉中雖然含有的少量酶，但是堿性蛋白酶（AP-200a）本身無明顯抗氧化活性。因此，說明雞蛋殼膜多肽具有很好的抗氧化活性。

3 結(jié)果與討論

目前，對(duì)各種肽的研究越來越多，活性肽抗氧化活性的研究已取得一定成果，大豆低聚肽已被列為新資源產(chǎn)品。還有小麥肽、玉米肽等，也被大家所關(guān)注。而對(duì)蛋殼膜類研究較少，雞蛋殼膜具有致密的纖維結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，不易被分解。本試驗(yàn)以水解度為指標(biāo)，篩選出堿性蛋白酶（AP-200a）酶解效果最佳，通過單因素考察和響應(yīng)面分析優(yōu)化了雞蛋殼膜的酶解工藝，確定采用酶添加量 2.4%，料液比 1∶9.5（g/mL），酶解時(shí)間 5 h，在此條件下，殼膜多肽水解度為27.15%，與預(yù)測(cè)值27.81%接近，表明該方法可行。水解后相對(duì)分子質(zhì)量小于1 000 Da的小分子肽所占比例為90.9%；且殼膜多肽對(duì)DPPH·、ABTS+·的清除率分別為（93.03±0.51）%、（94.53±0.92）%，與 VC的效果相當(dāng)；但對(duì)·OH 和 O2-的清除率分別為（43.33±1.10）%和（53.40±0.70）%。劉文穎等[22]測(cè)得大豆低聚肽的分子量小于1000Da的組分高達(dá)83.54%。有研究報(bào)道，分子量小的組分比分子量過大的組分抗氧化性更強(qiáng)[23]。楊珊珊等[24]發(fā)現(xiàn)，當(dāng)濃度為4 mg/mL時(shí)，蛋清多肽對(duì)DPPH·清除率可達(dá)到65.7%。梁盈等[25]發(fā)現(xiàn)大米活性肽具有較好的抗氧化活性，對(duì)DPPH·和·OH的清除能力分別達(dá)46.70%、68.23%。還有研究發(fā)現(xiàn)，大豆低聚肽、小麥低聚肽、海洋生物小分子肽、洋蔥多肽等都同樣具有抗氧化效果[26-28]。但是大多研究中沒有驗(yàn)證酶解液或是得到的肽粉中所含的蛋白酶是否具有抗氧化活性，本試驗(yàn)在做殼膜多肽對(duì)ABTS+·的清除能力的同時(shí)，驗(yàn)證了堿性蛋白酶（AP-200a）對(duì)ABTS+·的清除能力，結(jié)果表明，堿性蛋白酶（AP-200a）沒有明顯的抗氧化活性。因此，通過該方法酶解后的雞蛋殼膜多肽具有一定抗氧化活性。

因此，試驗(yàn)以雞蛋殼膜為原料，對(duì)其進(jìn)行制備小分子肽的研究，得到了分子量組分較小的雞蛋殼膜多肽，創(chuàng)新了雞蛋殼膜酶解工藝的試驗(yàn)優(yōu)化方法，并對(duì)其進(jìn)行了一系列的體外抗氧化活性研究，研究結(jié)果表明雞蛋殼膜多肽具有良好的抗氧化活性。同時(shí)，本研究為雞蛋殼膜綜合再利用、變廢為寶提供了理論基礎(chǔ)，既可以達(dá)到保護(hù)環(huán)境以及資源化利用的目的，也為今后的蛋類產(chǎn)品研究奠定了研究基礎(chǔ)。