鯪魚糜致腐微生物分離及其復(fù)合生物防腐劑研究

柏建玲，王惠惠，蔡淑珍，莫樹平，楊小鵑，何瑩龍，蘇悅，吳清平

（廣東省科學(xué)院微生物研究所華南應(yīng)用微生物國家重點實驗室廣東省微生物安全與健康重點實驗室，廣東廣州510070）

魚類含有豐富的蛋白質(zhì)且肉質(zhì)細膩，在貯藏、運輸、加工及銷售過程中極易腐敗變質(zhì)，從而導(dǎo)致資源浪費和環(huán)境污染[1-2]。鯪魚（Cirrhinus molitorella）是廣東省大宗淡水養(yǎng)殖產(chǎn)品，它具有生長快、養(yǎng)殖成本低、產(chǎn)量大、肉質(zhì)細嫩、營養(yǎng)豐富等特點。鯪魚個體小、骨刺多，因此一般被制作成魚糜、魚丸等產(chǎn)品銷售[3-4]。國內(nèi)外學(xué)者通過對水產(chǎn)食品腐敗微生物研究發(fā)現(xiàn)，水產(chǎn)食品所含微生物中只有部分微生物參與腐敗過程，因此提出了特定腐敗菌的概念，特定腐敗菌的生長繁殖在很大程度上起著主導(dǎo)腐敗變質(zhì)的作用[5-7]。魚類防腐保鮮主要通過低溫冷凍和添加化學(xué)防腐劑，低溫冷凍成本高且影響產(chǎn)品品質(zhì)，化學(xué)防腐劑存在嚴重安全隱患[8-9]。而多數(shù)魚肉產(chǎn)品天然生物防腐劑仍處于研究階段[10]。

ε-聚賴氨酸（ε-polylysine，ε-PL）是一種天然防腐劑，具備廣譜、水溶性及穩(wěn)定性好等優(yōu)點，我國已批準其在部分食品中使用[11-13]。將具備抑菌效果的物質(zhì)按照一定比例復(fù)配使用，可以提高水產(chǎn)品及其制品的保鮮效果[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)，將乙二胺四乙酸二鈉、乳酸鏈球菌素（Nisin）和納他霉素復(fù)合使用，可抑制水產(chǎn)品中革蘭氏陰性菌的生長[16-17]；此外，利用殼聚糖成膜特性，與ε-聚賴氨酸復(fù)合使用可以延長南美對蝦的儲存期[18]。關(guān)于復(fù)合生物防腐劑的研究報道較多，然而復(fù)配劑在食品防腐中所起的作用未引起人們的足夠重視，且針對其防腐增效機理和抑菌譜擴展機理缺乏系統(tǒng)的研究[19-23]。因此，本文應(yīng)用微生物學(xué)方法從鯪魚魚糜中分離腐敗微生物，將其作為研究對象，應(yīng)用ε-聚賴氨酸和不同增效劑進行抑菌試驗研究，篩選最佳配比控制水產(chǎn)品中腐敗微生物的生長，以達到防腐保鮮、延長食物貨架期的目的。

1 材料與方法

1.1 材料

鯪魚魚糜：市售，放置于4℃冰箱保存?zhèn)溆茫沪?聚賴氨酸：浙江新銀象生物工程有限公司；甘氨酸（生物試劑，99%）、L-丙氨酸（生物試劑，98.5%）：上海源葉生物科技有限公司；L-蘋果酸（生物試劑，98%）：大連美侖生物技術(shù)有限公司；乙二胺四乙酸二鈉（ethylene diamine tetraa-cetic acid disodium salt，EDTA-2Na）、乳酸鈉、檸檬酸鈉（分析純）：廣州化學(xué)制劑廠；肉湯培養(yǎng)基、營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、麥芽汁瓊脂培養(yǎng)基：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司。

1.2 試驗菌種

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC2593）、銅綠假單胞菌（Pseudmonas aeruginosa CMCC10104）、大腸桿菌（Escherichia coli ATCC25922）：廣東省科學(xué)院微生物研究所菌種保藏中心提供；庫爾特氏桿菌（Kurthia gibsonii YB12）、小穗葡萄球菌（Staphylococcus sciuri YB13）、溶酪大球菌（Macrococcus caseolyticus YM14）、黃體微球菌（Micrococcus luteus YM31）、喜馬偕爾邦考克氏菌（Kocuria himachalensis YM35）：廣東省科學(xué)院微生物研究所微生物安全與健康中心實驗室分離鑒定保存。

1.3 致腐微生物分離鑒定方法

輕度腐敗的鯪魚魚糜樣品均質(zhì)處理后，采用稀釋平板分離法，取0.1 mL菌懸液分別稀釋后（10-1、10-2、10-3）涂布于肉湯培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)48 h。對分離得到的單菌落通過菌株培養(yǎng)特征、生理生化試驗及16S rRNA分子鑒定法進行鑒定。

1.4 增效劑篩選

1.4.1 復(fù)合生物防腐劑配制

選擇7種可能對生物防腐劑具有增效作用的增效劑進行篩選試驗，將增效劑按照比例分別與ε-PL復(fù)配形成復(fù)合生物防腐劑，具體配方為配方1（ε-PL0.5g/kg、EDTA-2Na 0.5 g/kg）、配方 2（ε-PL 0.5 g/kg、檸檬酸鈉0.5 g/kg）、配方 3（ε-PL 0.5 g/kg、L-丙氨酸 0.5 g/kg）、配方4（ε-PL 0.5 g/kg、甘氨酸 0.5 g/kg）、配方 5（ε-PL 0.5g/kg、L-蘋果酸0.5g/kg）、配方 6（ε-PL0.5g/kg、乙酸鈉 0.5g/kg）、配方 7（ε-PL 0.5 g/kg、乳酸鈉 0.5 g/kg），CK1（空白）、CK2（0.5 g/kg ε-PL）。通過防腐試驗，篩選最佳螯合增效劑及合適濃度。

1.4.2 復(fù)合生物防腐劑的抑菌測定

復(fù)合生物防腐劑對試驗菌株的抑菌測定采用牛津杯法。配制培養(yǎng)基，倒平板，制備指示菌菌懸液，取適量指示菌菌懸液涂布于指示菌平板上，放置牛津杯，分別添加125 μL1.4.1配制好的7種復(fù)合生物防腐劑及 CK1、CK2，在 30 ℃條件下培養(yǎng) 24 h～72 h，觀察結(jié)果，測量并記錄抑菌圈直徑。

TWEAK上游引物5′-ATCGCAGCCCATTATGAAGT-3′、下游引物 5′-GAAGAGTCCGAAGTAGGTGAGG-3′，p38MAPK 上游引物 5′-TCGAGACCGTTTCAGTCCAT-3′、下游引物5′-CCACGGACAAATATCCACT-3′，GAPDH上游引物5′-ATCACCATCTTCCAGGAGCGA-3′、下游引物5′-CCTTCTCCATGGTGGTGAAGA-3′均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.5 鯪魚魚糜防腐應(yīng)用試驗

1.5.1 鯪魚魚糜防腐處理方法

分別將復(fù)合生物防腐劑添加至鯪魚魚糜樣品中，不添加復(fù)合生物防腐劑作為對照組。經(jīng)過處理的魚糜樣品放置在4℃冰箱進行貯藏試驗，每天取樣測定揮發(fā)性鹽基氮和菌落總數(shù)。每個處理重復(fù)3次。復(fù)合生物防腐劑配制見表1。

表1 復(fù)合生物防腐劑配制Table 1 Compound bio-preservation preparation

1.5.2 檢測項目

揮發(fā)性鹽基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N）：按照GB 5009.228—2016《食品安全國家標準食品中揮發(fā)性鹽基氮》方法進行測定；菌落總數(shù)：按照GB 4789.2—2016《食品安全國家標準食品微生物學(xué)檢驗菌落總數(shù)》方法進行測定。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有結(jié)果均使用SPSS17.0軟件進行數(shù)據(jù)分析，采用SigmaPlot 12.5軟件進行繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 鯪魚魚糜致腐微生物的分離鑒定

從市售的鯪魚魚糜中分離致腐微生物9株，將菌株 編 號 為 YB12、YM15、YB13、YM13、YM14、YM31、YM35、YM32、YM36，菌落形態(tài)見圖 1。

圖1 鯪魚魚糜致腐微生物的菌落形態(tài)Fig.1 The colony morphology of mud carp surimi spoilage microorganisms

從圖1可以看出，分離篩選致腐微生物主要為細菌，菌落形狀均為圓形，具有光澤，菌落表面呈隆起狀。菌落邊緣呈圓潤光滑狀，菌落不透明，顏色主要為黃色和乳白色。

表2 鯪魚魚糜致腐微生物鑒定結(jié)果Table 2 Identification results of spoilage microorganisms in mud carp surimi

如表2所示，分離鑒定了9株優(yōu)勢腐敗菌，分別為YB12、YM15、YB13、YM13、YM14、YM31、YM35、YM32、YM36。其中革蘭氏陽性菌6個，占66.7%；革蘭氏陰性菌3個，占33.3%。

2.2 增效劑的篩選

根據(jù)鯪魚魚糜優(yōu)勢致腐微生物鑒定結(jié)果，選擇分離鑒定的 5 株優(yōu)勢致腐微生物：YB12、YB13、YM14、YM31、YM35和3株標準菌株：金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus ATCC2593）、銅綠假單胞菌（Pseudmonas aeruginosa CMCC10104）、大腸桿菌（Escherichia coli ATCC25922）作為指示菌，進行生物防腐劑ε-PL增效劑的篩選。將7種增效劑分別與ε-PL復(fù)配，測試其對指示菌的抑制情況，測量并記錄抑菌圈直徑，結(jié)果見圖2。

圖2 螯合增效劑分別與ε-聚賴氨酸復(fù)合對指示菌的抑制作用結(jié)果Fig.2 The results of the inhibitory effects of synergist agent compounded with ε-polylysine on indicator bacteria

由圖2可知，L-丙氨酸、甘氨酸、L-蘋果酸對ε-PL具有較強的增效作用，與ε-PL形成的復(fù)合生物防腐劑對魚糜中幾種指示菌及標準菌株均有不同程度的抑制作用，復(fù)合生物防腐劑可能破壞了指示菌細胞膜的完整性，引起細胞膜的通透性增加，造成胞內(nèi)物質(zhì)如核酸、蛋白質(zhì)等成分泄漏，細胞凋亡率增加，從而達到抑菌效應(yīng)。根據(jù)試驗結(jié)果，結(jié)合對魚肉風(fēng)味的影響，選取L-丙氨酸、甘氨酸、L-蘋果酸3種增效劑進行后續(xù)試驗研究。

2.3 復(fù)合生物防腐劑對鯪魚魚糜致腐微生物抑菌試驗

通過最佳配方研究獲得復(fù)合生物防腐劑配方2個（1#、2#），以本實驗室分離保存的3株標準菌株及分離的5株鯪魚魚糜優(yōu)勢致腐微生物為指示菌，測定復(fù)合生物防腐劑的抑菌效果見圖3。

圖3 研制復(fù)合生物防腐劑對分離冷鮮魚致腐微生物抑制效果Fig.3 The inhibitory effects of the developed compound biological preservation on the decaying microorganisms of separated chilled fish

由圖3可知，2種復(fù)合生物防腐劑對3株標準菌株和分離的5株冷鮮魚優(yōu)勢致腐微生物菌株均具有較好的抑制作用，抑菌效果明顯優(yōu)于單獨使用ε-聚賴氨酸。

2.4 樣品菌落總數(shù)的測定

鯪魚魚糜樣品經(jīng)復(fù)合生物防腐劑處理后，4℃冰箱貯藏過程中菌落總數(shù)變化見圖4。

圖4 魚糜樣品菌落總數(shù)變化情況Fig.4 Changes in the total number of colonies of mud carp surimi

由圖4可知，隨著貯藏時間的增加，CK1與CK2組的魚糜樣品菌落總數(shù)均呈現(xiàn)上升趨勢；CK1在第7天時菌落總數(shù)達到 7.40 lg（cfu/g），而添加 1#、2# 復(fù)合生物防腐劑的魚糜樣品在貯藏前7 d菌落總數(shù)整體均處于一個較低的水平。魚糜樣品貯藏至第10天，1#、2#處理組菌落總數(shù)出現(xiàn)明顯的上升，分別為6.79 lg（cfu/g）和5.43 lg（cfu/g）。結(jié)果表明，2#復(fù)合生物防腐劑處理的魚糜樣品菌落總數(shù)均最低，防腐效果最好。

2.5 樣品揮發(fā)性鹽基氮的測定

揮發(fā)性鹽基氮是評價魚肉鮮度的主要指標，魚糜在貯藏過程中，微生物和酶會引起蛋白質(zhì)分解而產(chǎn)生氨以及胺類等含氮物質(zhì)，其含量越高，表明氨基酸被破壞的越多，魚糜腐敗程度越為嚴重[21]。各處理組中揮發(fā)性鹽基氮含量如圖5所示。

圖5 魚糜樣品揮發(fā)性鹽基氮變化情況Fig.5 Changes of volatile based nitrogen in mud carp surimi

由圖5可知，隨著貯藏時間的增加，對照組與添加復(fù)合生物防腐劑的魚糜樣品揮發(fā)性鹽基氮均呈現(xiàn)上升趨勢；添加1#和2#復(fù)合生物防腐劑的魚糜樣品揮發(fā)性鹽基氮含量整體均低于CK1和CK2，與魚糜樣品菌落總數(shù)變化情況趨勢一致。其中，2#處理魚糜樣品中揮發(fā)性鹽基氮含量在第8天時為25.42 mg/100 g，而對照組CK1達到32.35 mg/100 g，表明ε-PL、甘氨酸、L-蘋果酸復(fù)配使用能明顯抑制腐敗菌的生長，延長魚糜產(chǎn)品的貯藏時間。

3 結(jié)論

鯪魚魚糜具有肉質(zhì)細嫩、營養(yǎng)豐富、水分含量高等特點，在貯藏、運輸、加工處理及銷售過程中極易腐敗變質(zhì)，從而導(dǎo)致資源浪費和環(huán)境污染。本文采用微生物學(xué)方法從魚糜中分離篩選出9株優(yōu)勢致腐微生物，通過分子鑒定，造成魚糜腐敗多為革蘭氏陽性菌。應(yīng)用不同生物增效劑與ε-PL復(fù)配使用，研究復(fù)合生物防腐劑對3種標準菌株及5株優(yōu)勢致腐微生物菌株的抑菌效應(yīng)，通過篩選優(yōu)化復(fù)配劑，采用ε-PL、甘氨酸、L-蘋果酸復(fù)配使用能明顯抑制致腐微生物的生長，降低貯藏期間魚糜中菌落總數(shù)及游離氨基氮的產(chǎn)生。本研究為延長魚糜的貯藏時間，為魚糜的保鮮技術(shù)應(yīng)用提供研究基礎(chǔ)。