葡萄籽提取物作為食品防腐保鮮劑

尹佳，劉得鵬，謝富忠，高宇迪，李繼鋒

吉林化工學院生物與食品工程學院（吉林 132022）

葡萄是中國最具消費價值的水果之一，每年有將近80%的葡萄被加工處理成葡萄制品，葡萄的大量生產和消費會產生大量的副產物——葡萄廢棄物（葡萄皮渣、梗、籽），占葡萄總量的20%左右。在葡萄廢棄物中，葡萄籽的生物活性物質最豐富，主要有原花青素和葡萄籽多酚等活性物質。葡萄籽提取物（GSE）是一種天然的保健食品，含有豐富的多酚，如兒茶素、表兒茶素、原花青素和單體黃烷醇[1]。它擁有通過清除自由基不僅具有顯著的抗氧化能力，而且由于其核心結構具有抗菌性3,4,5-三羥基苯基[2]。因為GSE具有抗氧化、抗腫瘤、抗炎癥、抗過敏、防治心血管疾病、抗衰老等多種功效[3]，故將葡萄籽廢渣中的活性成分通過一些方法提取出來，充分利用食品工業殘渣，可以提高食品加工副產物的利用率。GSE以優越的抗氧化活性和無副作用等受到青睞，被美國食品藥品監督管理局視為安全食品。近幾年GSE被廣泛應用于食品、化妝品、保健品及飼料等領域，是一種具有替代或補充天然原料資源的潛力。

1 葡萄籽提取物

1.1 葡萄籽提取物的化學組成及營養成分

GSE是從葡萄籽中提取分離得到的一類多酚類混合物質，所含的酚類物質主要由酚酸類物質和黃酮類化合物組成。葡萄籽中多酚類物質的含量約692.5 mg/L[4]，主要的酚類化合物是黃酮醇、原花青素、白藜蘆醇和黃烷-3-醇。楊青山等[5]研究表明不同品種的GSE中原花青素種類基本一致，但含量水平有所差異，其中原花青素B1、原花青素B2、表兒茶素及兒茶素的含量相對較高，平均超出1%含量水平。葡萄籽的主要營養成分詳見表1。

表1 葡萄籽的主要營養成分[6] 單位：%

1.2 GSE的功能及作用機理

1.2.1 抗氧化活性

GSE中的酚類物質是使其具有抗氧化活性的主要原因。GSE中的酚類物質可以通過以下2種方式在食品制品中發揮其抗氧化作用：一是通過對金屬離子的螯合，阻止金屬離子引發自由基的生成，從而間接實現抗氧化作用[7]；二是為過氧化物自由基提供氫原子使過氧化物成為氫過氧化物，以淬滅自由基，進而改善活性氧物質的清除能力[8]。此外，GSE強大的抗氧化活性可以保護腎臟免于誘發腎病[9]。Albrahim等[10]研究結果顯示給予甲狀腺功能亢進癥的小鼠口服GSE可將TBARS升高的水平顯著降低至正常水平。此外，降低的GSH和GST均顯著降低。產生顯著的抗氧化活性。孫欣等[11]研究表明GSE能有效提高女運動員機體總抗氧化能力和運動能力，減輕運動員因大強度運動而引起的氧化應激、脂質過氧化損傷。GSE能夠有效保護細胞膜較少的受到過氧化物的攻擊，從而延緩運動疲勞，減少運動損傷的發生。

1.2.2 抗腫瘤作用

GSE中存在的酚類化合物具有抗癌和細胞周期調節活性[12]。這些酚類化合物顯示出對腫瘤細胞的細胞毒活性，而不會影響正常的健康細胞。葡萄籽多酚類物質的抗癌細胞增殖和誘導癌細胞凋亡作用及其機制成為近年來天然抗腫瘤藥物的研究熱點之一。其中，葡萄籽多酚抗前列腺癌（PCA）細胞DU145的研究最為深入。有研究表明，葡萄籽多酚類物質無論在體內還是體外都能顯著抑制PCA細胞的增殖，并且能以時間和劑量依賴性地誘導PCA細胞凋亡[13]。葡萄籽原花青素（GSPE）具有抗氧化、抗炎、可調節機體免疫、減輕機體損傷等能力，還能發揮抗腫瘤作用，抑制肺癌、乳腺癌和胃癌等多種腫瘤生長[14]。另外，有研究顯示，誘導細胞凋亡可能是GSPE抗癌機制之一，其對骨肉瘤細胞有抑制增殖和遷移、促進凋亡、誘導細胞周期阻滯的作用[15]。GSPE作用于人食管癌細胞ECA109細胞24 h后，發現GSPE可以抑制ECA109的增殖和侵襲能力，誘導ECA109細胞凋亡[16]。故葡萄籽多酚類化合物能抑制多種腫瘤細胞生長，促進腫瘤細胞凋亡，而且還能拮抗化療藥物對正常細胞的毒性，因而具有較好的防癌、抗癌功效。

1.2.3 抗炎作用

GSE具有抗炎作用。許智涵[17]研究證實GSE可以通過調控導視網膜色素上皮細胞中內質網應激的IRE1-XBP1信號通路、提高分子伴侶GRP78的表達水平，從而抑制相關炎癥因子的表達，最終達到抑制細胞炎癥反應和保護視網膜的效果。GSPE對脂多糖誘導的BV-2小膠質細胞炎癥反應具有抑制作用，其可能減輕中樞神經系統的炎性浸潤和髓鞘的脫失，逆轉BV-2小膠質細胞結構變化并抑制細胞炎癥反應，從而改善中樞神經系統炎癥微環境，達到治療自身免疫性腦脊髓炎的作用[18]。張先杰等[19]用GSPE對腎血管型高血壓大鼠作6周治療后發現，與高血壓模型組相比，GSPE治療組的大鼠組血清中的腫瘤壞死因子（TNF-α）以及腎皮質、海馬組織及腹主動脈中TNF-α的蛋白表達水平均顯著降低，研究結果證明GSPE對促炎介質TNF-α具有一定抑制作用。

1.2.4 抗菌作用

GSE對革蘭陰性菌和革蘭陽性菌均有抑菌效果。Baydar等[20]報道GSE的濃度范圍在0.5%~1%區間對大腸桿菌具有普遍抑菌作用，濃度提高到2.5%時具有殺菌作用；此外，GSE在濃度1.0%，2.5%，5.0%和10.0%時對金黃色葡萄球菌和嗜水氣單胞菌均有殺菌作用。李建慧等[21]研究證明，GSE對金黃色葡萄球菌、傷寒沙門桿菌、普通變形桿菌、志賀里脊桿菌、大腸艾希桿菌和枯草芽孢桿菌6種致病菌均具有明顯的抑制作用。趙揚帆等[22]報道GSE對于各種各樣的細菌，如酵母菌和真菌都有明顯的抑制作用。上述研究結果說明將GSE添加于食品中，能明顯提高食品的品質及食品的安全性。

2 葡萄籽提取物的提取純化方法

GSE是極強性物質，可溶于水，易溶于乙醇、甲醇、乙酸乙酯等極性有機溶劑，難溶于乙醚和氯仿等有機溶劑。GSE的提取方法主要采用溶劑萃取法、超聲波輔助提取法、微波輔助提取法、酶解提取法、超臨界CO2萃取法、加壓熱水萃取法。

2.1 溶劑萃取法

溶劑萃取法是根據物料中各成分在溶劑中溶解性的不同，選擇對待提取成分的溶解度大、而對不需提取成分的溶解度小的溶劑，將有效成分從原料中溶解出來的一種方法。研究者最常用的提取分離GSE的方式之一。該方法的優點包括：操作可連續化，反應速度快，生產周期短；采用多級萃取時，溶質濃縮倍數越大、純化度越高。缺點包括：抗氧化物質溶于有機溶劑后不易分離，容易造成資源浪費。盧靖等[23]從葡萄果渣中提取多酚，在50%乙醇、80 ℃提取40 min條件下，多酚提取量為3.39 mg/g，其5倍稀釋液與0.1 g/L抗氧化劑二丁基羥基甲苯（BHT）的抗氧化性相當，并且多酚的抗氧化活性隨著其質量濃度增加而增強。劉葉等[24]利用快速溶劑萃取儀在80%乙醇，壓強8.97 MPa、50 ℃提取時間20 min的條件下，多酚提取量為28.89 mg/g。利用快速溶劑萃取儀提取葡萄籽多酚物質能極大地縮短提取時間。

2.2 超聲波輔助提取法

超聲波輔助提取法是將超聲波產生的空化效應、振動效應、粉碎效應、攪拌效應等綜合效應應用到天然產物成分的提取工藝中，通過破壞其細胞壁，增加溶劑的穿透力，從而達到高效提取細胞內容物的目的。該方法的優點是超聲波提取效率高，提取溫度低，能夠有效保護抗氧化活性物質。缺點是獲得的產品純度不夠。賈榮等[25]利用超聲波法輔助乙醇提取山葡萄籽多酚，在乙醇體積分數60%、超聲功率120 W、料液比1∶8（g/mL）、50 ℃提取30 min的最優條件下，多酚得率和含量為11.71%和32.86%。蒲艷[26]研究超聲波輔助法提取葡萄籽提取物原花青素的工藝研究，通過單因素試驗和響應面試驗進行優化，確定最佳工藝參數：48%乙醇、超聲功率266 W，50 ℃水浴浸提85 min，在該工藝下原花青素提取率為1.123%。

2.3 微波輔助提取法

微波可使物料的內部迅速升溫，瞬間產生的高壓高溫可導致物料細胞破碎，有利于目標成分快速溶出，從而提高提取效率。微波輔助提取法使用的溶劑量少，提取快速，可同時測定多個樣品，設備簡單，操作容易，但是萃取劑的選擇范圍受限，通常需要選擇極性大的萃取劑。王偉等[27]以乙醇作為提取劑，對葡萄籽中原花青素的提取進行優化，得到60%乙醇，液料比25∶1 mL/g，427 W微波處理3 min，在該條件下葡萄籽原花青素得率為8.66%±0.25%。師守國等[28]運用微波加熱提取技術，確定提取山野葡萄皮渣中的白黎蘆醇的最佳工藝條件為70%乙醇、液料比20∶1 mL/g、微波功率250 W、提取30 min，在此條件下白黎蘆醇提取率可大幅提高。

2.4 超臨界CO2萃取法

超臨界流體萃取技術是利用壓力和溫度對超臨界流體溶解能力的影響，在超臨界狀態下，將超臨界流體與待提取的物質接觸，使其有選擇性地依次把沸點、極性和相對分子質量不同的成分萃取出來。與傳統溶劑浸提法相比，超臨界萃取法的萃取效率高；可有選擇地進行多種物質的分離；操作溫度低，能較好保證被提取物質性能，但是該方法設備價格比較昂貴，生產成本高[29]。劉文玉等[30]采用響應面法優化超臨界CO2萃取法進行葡萄籽原花青素的提取。原花青素提取工藝的最佳條件為乙醇體積分數69.22%、CO25 L/h、液料比1.13∶1 mL/g、提取壓力35 MPa、溫度55 ℃條件下停留62.82 min，產率和產物純度分別達到163.60±0.93 mg/kg和88.5%，提取效果明顯優于傳統的提出工藝。宗建軍等[31]利用超臨界CO2萃取技術從葡萄籽中提取含有不飽和脂肪酸的葡萄籽油，預測在萃取壓力28 MPa、CO215.5 L/h、萃取溫度321 K最佳條件下停留時間155 min，萃取率達到14.12%。

3 葡萄籽提取物的安全性

葡萄屬于生活中比較常見的水果，雖然葡萄籽一般不直接食用，但經試驗證實GSE具有很高的食用安全性，急性毒性和慢性長期毒性試驗均未見毒副作用。據報道[32]，食用GSE的2.0%~2.5%對大鼠沒有不良影響。在大鼠中口服給藥后未觀察到明顯的GSE嚴重毒性。大鼠GSE的致死劑量（LD50，對50%的測試模型具有致命作用的物質的劑量）高于4 000~5 000 mg/kg[33]。沈繼紅等[34]將葡萄多酚以10 g/kg劑量灌胃小鼠，14 d內動物無死亡，不同性別的小鼠均未見明顯的中毒癥狀，研究結果證明該物質屬實際無毒物質。國際上對GSE尚無用量方面的規定。歐美、日本等國家將GSE作為膳食補充劑的一般推薦用量為150~300 mg/d，而在食品工業中則以低濃度（0.01%~1%）使用[35]。中國常用量與國際上基本一致。

4 葡萄籽提取物在食品領域的應用

4.1 在果蔬中防腐保鮮的應用

GSE對減少化學合成防腐劑的使用和降低環境污染具有重要的現實意義。楊晶琪等[36]研究表明，1%GSE負壓滲透處理可顯著抑制青霉菌（Penicillium expansum）和鏈格孢菌（Alternaria alternata）這2種病原菌在鴨梨果實上的發病率及病斑直徑擴展，最終可以延緩鴨梨果實的成熟衰老，減少貯藏期間失重率、腐爛率及果柄褐變程度。有研究顯示GSE處理能明顯降低桃果實貯藏期自然腐爛率和減輕果肉褐變，抑制多酚氧化酶（PPO）活性；延緩桃果實硬度、可滴定酸含量的下降；保持較高的可溶性固形物和抗壞血酸含量[37]。吳寧等[38]將GSE應用于香菇保鮮中，結果表明一定濃度的GSE能有效延長香菇保鮮時間，5 g/L葡萄籽提取物的保鮮效果最理想。GSE在提高果實抗病性及采后貯藏品質的應用上具有重要意義，有望開發成為相對安全、無公害的果實防腐保鮮劑。

4.2 在肉類中防腐保鮮的應用

肉類制品在貯藏中易發生氧化反應，產生變味及變色現象，造成營養成分損失，為使肉類在貨架期內保持良好品質，添加抗氧化劑非常必要。李超等[39]研究表明，添加0.25% GSE能明顯減緩發酵鴨肉香腸的氧化速度和產酸速度，進而提高香腸貯存期穩定性。張濤等[40]指出，GSE能提高發酵豬肉香腸的氧化穩定性，進而提高香腸的貨架期。金海莉等[41]通過對延邊黃牛肉樣品的表面顏色、感官評定、pH、滴水損失率、揮發性鹽基氮值及菌落總數的測定，綜合分析得出GSE對延邊黃牛肉保鮮的最佳質量分數是0.10%，且GSE試驗組樣品比對照組樣品的保鮮期延長2~4 d。GSE能夠提高秘魯魷魚魚丸的持水性，降低魚丸中水分的流動性，抑制氧化三甲胺的熱分解，降低魚丸中TMA、DMA和甲醛含量[42]。在白鰱魚丸中添加量0.1 g/kg迷迭香提取物和0.3 g/kg葡萄籽提取物時，白鰱魚丸的保鮮效果最優，可明顯抑制微生物生長，延緩魚丸品質劣變，延長貨架期[43]。因此，GSE保鮮劑在肉類制品保鮮中擁有廣闊市場前景。

5 結語與展望

中國的葡萄資源比較豐富，葡萄年產量位居世界前列，隨著食品加工行業的深入發展，葡萄籽廢棄物——葡萄籽產量會越來越多，所以利用食品工業廢果渣提取天然保鮮劑有著極為廣闊的發展前景。GSE作為天然抗氧化劑、天然防腐劑和營養強化劑在食品中應用，符合消費者追求食品安全性和營養性的需求。GSE提取工藝簡單，成本低，具有多種營養成分，隨著葡萄籽副產品的開發利用，GSE的研究開發都具有深遠意義。