綿羊BMPR2基因組織表達及其多態性與產羔數的相關性分析

文禹粱 郭曉飛 馬琳 張效生 張金龍 趙生國 儲明星

摘要 [目的] 為探討骨形態發生蛋白2型受體（bone morphogenetic protein receptor? BMPR2）基因在卵泡期和黃體期及單羔和多羔小尾寒羊組織表達特征及其多態性與小尾寒羊產羔數之間的關系。[方法] 采用qPCR技術檢測BMPR2基因在小尾寒羊14種組織中的表達模式。同時，使用Sequenom MassARRAYSNP技術對BMPR2基因3個單核苷酸多態性（single nucleotide polymorphism，SNP）位點在6個綿羊品種中的多態性進行檢測，并與小尾寒羊產羔數進行關聯。[結果] BMPR2在14種組織中呈廣譜表達，其中在肺臟、大腦、肝臟以及下丘腦組織高表達;BMPR2在卵泡期多羔組下丘腦-垂體-卵巢組織中的表達量均高于單羔組。BMPR2基因g.203707935A>G和g.203708072T>C位點在單、多羔綿羊品種間的等位基因頻率差異顯著（P<0.05）。通過相關分析發現，g.203708352A>G位點與小尾寒羊三胎產羔數顯著相關（P<0.05），野生型產羔數顯著高于雜合型。通過對該位點不同基因型與小尾寒羊FecB基因型復合分析發現，3種復合基因型與小尾寒羊三胎產羔數顯著關聯（P<0.05），AA-GG基因型產羔數顯著高于AA-AG和AA-AA基因型，推測該位點突變可能削弱了FecB基因信號強度，導致產羔數下降。[結論] BMPR2基因g.203708352A>G位點與小尾寒羊產羔數呈顯著負相關，為小尾寒羊產羔性狀選育提供了參考依據。

關鍵詞 綿羊;BMPR2基因;組織表達;單核苷酸多態性（SNP）

中圖分類號 S 826? 文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2021）20-0098-07

doi：10.3969/j.issn.0517-6611.2021.20.026

開放科學（資源服務）標識碼（OSID）：

Tissue Expression of BMPR2 Gene and Correlation Analysis of Its Polymorphism with Litter Size in Ovis aries

WEN Yu-liang? GUO Xiao-fei3，MA Lin1 et al （1.Key Laboratory of Animal Genetics，Breeding and Reproduction of Ministry of Agriculture and Rural Affairs，Institute of Animal Sciences，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100193;2.College of Animal Science and Technology，Gansu Agricultural University，Lanzhou，Gansu 730070;3.Tianjin Institute of Animal Sciences，Tianjin 300381）

Abstract [Objective] To investigate the expression features of bone morphogenetic protein receptor 2 gene （BMPR2） in various tissues of Small Tail Han （STH） ewes during different physiological periods （follicular and luteal phases） and with different fecundity （monotocous and polytocous ewes），and analyze the correlation between its polymorphism with litter size in STH sheep.[Method] qPCR technology was used to detect the expression model of BMPR2 in 14 kinds tissues of STH sheep.Sequenom MassARRAYSNP assay was applied to detect three single nucleotide polymorphism （SNPs） of BMPR2 in six sheep breeds，and then the correlation between BMPR2 polymorphism and litter size in STH sheep was analyzed.[Result]BMPR2 gene was expressed in all selected tissues of STH sheep and highly expressed in the lung，brain，liver and hypothalamus tissues，and the expression of BMPR2 in hypothalamus，pituitary，and ovary of polytocous ewes was higher than that of monotocous ewes at follicular phase.The allele frequencies of g.203707935A>G and g.203708072T>C loci of BMPR2 were significantly different （P<0.05） between monotocous and polytocous sheep breeds.The correlation analysis showed that g.203708352A>G locus of BMPR2 had significant negative effects on litter size of STH sheep， the litter size of wild type was significantly higher than heterozygote genotype （P<0.05）.The combination analysis of g.203708352A>G locus of BMPR2 and FecB （A746G） showed that the litter size of AA-GG genotype was significantly higher than that of AA-AG and AA-AA genotypes （P<0.05）.Therefore，it was speculated that g.203708352A>G locus mutation might weaken the downstream signal intensity of FecB，resulting in the decrease of litter size.[Conclusion]The SNP locus of g.203708352A>G in BMPR2 might have negative significant association with the litter size of STH sheep.The present study provided the reference basis for lambing traits selection of STH sheep.

Key words Sheep;Bone morphogenetic protein receptor 2 gene;Tissue expression;Single nucleotide polymorphism （SNP）

基金項目

國家自然科學基金項目（31772580）;農業農村部動物遺傳育種與繁殖（家禽）重點實驗室開放課題（poultrylab2019-10）;天津市農業科學院青年科研人員創新研究與實驗項目（201915）;國家肉羊產業技術體系專項（CARS-38）;中國農業科學院科技創新工程項目（ASTIP-IAS13）;天津市農業科技成果轉化與推廣項目（201704020）。

作者簡介 文禹粱（1993—），男，河南新鄉人，博士研究生，研究方向：動物分子遺傳學研究。*通信作者，趙生國，教授，博士，從事動物遺傳資源研究;儲明星，研究員，博士，從事羊優異繁殖性狀的分子機理研究。

收稿日期 2020-12-16

綿羊產羔性狀是重要的經濟性狀之一，遺傳力較低，受遺傳、環境和激素水平等多種因素的調控，但產羔對遺傳進展的經濟效益貢獻高達96%，因此挖掘和鑒定綿羊產羔相關的主效基因和多態位點可給羊產業帶來巨大的經濟效益[1-2]。標記輔助選擇（marker assisted selection，MAS）技術在低遺傳力性狀的選擇上應用廣泛，因此為標記輔助選擇篩選有效的多態位點顯得尤為重要。鑒于全基因組重測序技術是挖掘功能基因最有效的方式之一[3-5]。中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所肉羊遺傳育種團隊前期對10個綿羊品種共99個個體進行全基因組重測序，并按照單、多羔進行分組，使用Fst方法基于Oar_3.1版本篩選獲得可能與綿羊產羔數相關的基因BMPR2及其g.203707935A>G、g.203708072T>C和g.203708352A>G共3個SNPs位點[6]。

BMPR2是骨形態發生蛋白（bone morphogenetic proteins，BMPs）家族成員之一，為70 ku的膜蛋白受體，具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性[7-8]。其被定位于綿羊2號染色體，編碼區全長3 117 bp，包含13個外顯子，共編碼1 038個氨基酸。研究發現，BMPR2通過BMP/SMAD信號通路發揮生物學作用[9-11]。該通路被廣泛認為與哺乳動物卵巢顆粒細胞增殖、生殖激素的合成與分泌以及卵母細胞成熟和排卵等生理活動息息相關[12]，其主要通過調節促性腺激素釋放激素（gonadotropin-releasing hormone，GnRH）誘導的垂體中相關促性腺激素基因的表達調控，影響促卵泡素（follicle-stimulating hormone，FSH）、促黃體素（luteinizing hormone，LH）以及雌二醇（estradiol，E2）等生殖激素的合成和分泌，進而調控動物的排卵活動[13-14]。BMPR2是BMP家族2型受體，而BMP家族中的骨形態發生蛋白4（bone morphogenetic protein 4，BMP4）與小尾寒羊產羔數顯著相關[15]。作為BMP家族另外一種受體，骨形態發生蛋白1型受體（bone morphogenetic protein receptor 1B，BMPR1B）基因已被鑒定為調控綿羊多羔性狀的主效基因[16]，其增加1個拷貝數，布魯拉美利奴羊的排卵數和產羔數分別增加1.65個和0.67只[17]。這說明BMP家族在調控綿羊產羔性狀上發揮著積極作用。Takeda等[18]對小鼠促性腺激素LβT2細胞的研究發現BMPR2參與BMP誘導的FSH轉錄調控，并且BMP6和BMP7的mRNA含量因BMPR2對GnRH誘導的ERK信號通路的影響而有所差異。BMPR2基因在人、小鼠、牛以及綿羊卵母細胞和顆粒細胞中表達，并且在卵巢原發性、繼發性以及竇狀卵泡顆粒細胞發揮積極作用[19-23]。Costa等[24]在山羊卵巢中研究發現BMPR2在直徑0.2 mm的卵泡中mRNA表達水平顯著高于直徑0.1 mm的卵泡。綜上可知，對參與BMP信號通路的BMPR2基因進行研究將有助于更好地理解綿羊的產羔機制。筆者以單羔、多羔小尾寒羊為試驗材料，利用實時熒光定量 PCR（qPCR）技術檢測BMPR2基因在小尾寒羊14種組織中的表達特征，并對篩選的3 個SNPs采用Sequenom MassARRAYSNP技術在6個綿羊品種中分型，再與小尾寒羊產羔數進行相關性分析，以探討BMPR2基因表達及其多態性與綿羊產羔數之間的關系，為更好地闡釋綿羊產羔機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 樣本采集

試驗羊只來自山東省鄆城縣小尾寒羊種羊場，在經過FecB分型（FecB++型）的3歲健康小尾寒羊母羊中，根據產羔記錄隨機挑選單羔和多羔母羊各6只，運輸到天津市畜牧獸醫研究所種羊場飼養。對上述12只小尾寒羊母羊放置陰道孕酮栓塞（controlled internal device release，CIDR）實施同期發情試驗，放栓時長12 d，撤栓后用腹腔鏡觀察卵泡發育和排卵情況，并使用公羊試情以確定母羊發情狀態和采樣時間，分別在撤栓后45 h（卵泡期）和10 d（黃體期）進行屠宰。采集心、肝、脾、肺、腎、甲狀腺、腎上腺、大腦、小腦、下丘腦、垂體、卵巢、子宮和輸卵管共14種組織樣品。將采集的新鮮組織放入2 mL的RNase-Free凍存管并迅速放入液氮罐中，然后轉移至 -80 ℃冰箱中貯存備用。

1.2 血液DNA和組織RNA的提取和檢測

綿羊血液DNA和組織RNA的提取方法參照DNA、RNA提取試劑盒（北京天根科技有限公司）說明書。利用Nanodrop2000微量分光光度計（Nano Drop Technologies，美國）檢測提取DNA、RNA樣本濃度和OD值，利用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳對DNA、RNA質量進行檢測。

1.3 引物設計及cDNA合成

根據GenBank提供的綿羊BMPR2編碼區序列，利用Primer Premier 3.0軟件設計跨外顯子引物，由北京天一輝遠生物科技有限公司合成。引物信息詳見表1。

利用反轉錄試劑盒（PrimeScriptTM RT Reagent Kit，TaKaRa，日本）合成cDNA，反轉錄反應體系（20 μL）參考文禹粱等[15]，全程操作在冰上進行。反應條件如下：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，對反轉錄產物進行鑒定后，將符合標準的cDNA保存于-20 ℃冰箱中備用。

1.4 熒光定量PCR（qPCR）

熒光定量檢測利用Roche Light Cycler480 Ⅱ 型熒光定量PCR儀進行。反應體系（20 μL）和反應程序參考文禹粱等[15]相關報道。將備用cDNA 樣本5倍稀釋后，以2倍梯度稀釋獲得稀釋倍數為1～128倍共8個濃度樣品，用于標準曲線的繪制;用上述cDNA作為模板，對BMPR2和RPL19分別進行qPCR分析。

1.5 基因分型

采用Sequenom MassARRAYSNP技術對BMPR2基因g.203707935A>G、g.203708072T>C和g.203708352A>G位點在不同產羔數的綿羊品種中進行分型。分型樣品為704個不同品種綿羊血樣，包括83只湖羊、68只策勒黑羊、23只灘羊、70只蘇尼特羊和80只草原型藏羊以及有產羔數記錄的380只小尾寒羊。其中，小尾寒羊、湖羊和策勒黑羊為多羔品種，其他均為單羔品種。分型的具體步驟參考馬曉萌等[25]相關報道。分型樣品為DNA，質量濃度為40～80 ng/μL，每個樣品用量為20 μL。

1.6 數據統計與分析

采用2-△△Ct法[26]計算目的基因相對表達量。利用SPSS 22.0（IBM，美國）統計軟件進行單因素方差分析，并利用最小顯著差異（least significant difference，LSD）法進行多重比較。應用Microsoft Excel 2016（Microsoft Excel，美國）軟件統計綿羊BMPR2基因共3個SNPs位點基因型頻率、等位基因頻率、多態信息含量（polymorphism information content，PIC）、雜合度（heterozygosity，He）和有效等位基因數（number of effective alleles，Ne），計算公式參考Guo等[27]相關報道，隨后進行哈代-溫伯格平衡（Hardy-Weinberg equilibrium，HWE）檢測。BMPR2不同基因型與產羔性狀的相關性分析模型參考文禹粱等[15]相關報道。

2 結果與分析

2.1 DNA檢測

提取不同品種綿羊血液基因組 DNA，并進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1所示。血液基因組DNA條帶單一且無雜帶，濃度與純度均表現良好，可滿足后續試驗要求。

2.2 RNA檢測

提取小尾寒羊14種組織的總RNA，并使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測其質量。如圖2A所示，提取的組織總RNA無明顯降解，28S和18S條帶清晰可見，灰度值約2∶1。利用Nanodrop2000微量分光光度計檢測提取RNA樣本濃度和OD值，OD260/OD280均在1.9～2. 說明提取的RNA純度較高。以反轉錄之后的cDNA為模板對RPL19基因進行擴增，結果如圖2B所示，可見RPL19基因在14種組織中擴增效果良好，滿足qPCR試驗要求。

2.3 BMPR2基因的組織表達

2.3.1 BMPR2基因在卵泡期不同組織間的表達模式。

作為BMP/SMAD通路唯一的2型受體，BMPR2在14種組織中廣譜表達，無組織特異性（圖3）。以垂體組織中的BMPR2基因mRNA的相對表達量作為參照，在肺臟、大腦、肝臟以及下丘

腦中的相對表達量較高，分別為垂體組織表達量的18.71倍、15.26倍、13.82倍和11.90倍，差異均達到極顯著水平（P<0.001）。BMPR2基因在卵巢、子宮和輸卵管中的表達量分別為垂體的2.73倍（P=0.48）、3.64倍（P=0.29）和3.43倍（P=0.32）。

2.3.2 BMPR2基因在性腺軸組織間的表達模式。

對BMPR2在不同生理時期單羔和多羔組的表達模式進行了研究（圖4）。結果顯示，多羔組BMPR2在卵泡期下丘腦、垂體和卵巢組織中的相對表達量均高于單羔組，而多羔組BMPR2在黃體期下丘腦組織中的相對表達量低于單羔組，但差異均未達到顯著水平（P>0.05）。

2.4 BMPR2基因多態性 BMPR2基因g.203707935A>G（a）、g.203708072T>C（b）和g.203708352A>G（c）分型結果如圖5所示。

由表2可知， BMPR2基因g.203707935A>G和g.203708072T>C位點在單、多羔綿羊品種間的等位基因頻率存在顯著差異（P<0.05）。

由表3可知，g.203707935A>G位點除在小尾寒羊中處于中度多態（0.25

多態（PIC<0.25）;g.203708072T>C位點在6個綿羊品種中均處于中度多態（0.25G位點在6個綿羊品種中均處于低度多態（PIC<0.25）。卡方檢驗結果表明，g.203707935A>G位點在6個綿羊品種中均處于哈代-溫伯格平衡狀態（P>0.05）;g.203708072T>C位點除了小尾寒羊外在其余綿羊品種中處于哈代-溫伯格平衡狀態（P>0.05）;g.203708352A>G位點僅在小尾寒羊和湖羊品種中處于哈代-溫伯格平衡狀態（P>0.05）。

2.5 BMPR2基因多態性與小尾寒羊產羔數的關系

由表4可知，BMPR2基因g.203708352A>G位點的突變與小尾寒羊三胎產羔數顯著相關（P<0.05），野生型產羔數顯著高于雜合型。對該位點不同基因型與小尾寒羊FecB基因型進行復合，共產生3種基因型（表5），且與小尾寒羊三胎產羔數顯著關聯（P<0.05）。AA-GG基因型產羔數顯著高于AA-AG和AA-AA基因型。

3 討論

為理解綿羊產多羔的分子機制，育種專家一直致力于尋找影響綿羊產羔數的關鍵基因。迄今為止，BMPR1B、骨形態發生蛋白15（bone morphogenetic protein 15，BMP15）、生長分化因子9（growth differentiation factor 9，GDF9）已被鑒定為影響綿羊產羔數的主效基因[28-31]。但相對于中國巨大的羊產業來說還相對較少，因此尋找影響綿羊產羔相關主效基因依然是長久且明確的目標[32]。BMPR2作為BMP通路唯一的2型受體在哺乳動物卵泡發育和卵巢顆粒細胞增殖等方面均發揮著重要作用[33-34]。目前其對綿羊產羔數的影響還尚未報道。該研究選擇全基因組重測序技術篩選獲得的BMPR2基因，首次對BMPR2基因在小尾寒羊各組織mRNA水平和多態性進行分析，并探討其與綿羊產羔之間的關系。

3.1 BMPR2基因組織表達對動物繁殖活動的影響 該研究發現BMPR2基因在卵泡期小尾寒羊14種組織呈廣譜表達，且在卵泡期多羔組下丘腦-垂體-卵巢組織表達均高于單羔組，表明其對小尾寒羊各項器官正常的生理功能起重要調節作用，特別是在哺乳動物卵巢發育以及性激素分泌方面。FSH、LH和E2作為衡量卵巢功能的重要激素，對卵巢功能和排卵有著重要調節作用。研究發現，BMPR2在卵泡發育的各個階段均可以被檢測到，并且在性激素的分泌、卵巢的發育、卵泡生長以及顆粒細胞增殖方面有重要促進作用[18，35]。Liu 等[30]研究發現，BMPR2作為受體，對牛卵泡生長和顆粒細胞增殖有促進作用。BMPR2在優勢卵泡（d>13 mm，E2>180 ng/mL）顆粒細胞和卵泡膜細胞中的mRNA是其他卵泡類型的1.5～2.0倍[35]，在牛卵泡細胞中添加BMPR2可使卵泡直徑顯著增加[36]。Foroughinia等[37]研究發現BMPR2在母綿羊高繁殖力組卵泡的表達量極顯著高于低繁殖力組，且在卵巢組織的表達趨勢與在卵泡組織中相似，但差異不顯著。這與該研究在卵泡期下丘腦、垂體和卵巢組織中BMPR2的表達模式相符。Hu等[38]通過對芬蘭羊進行高通量轉錄組學測序發現，BMPR2基因在高繁殖力組表達量顯著高于低繁殖力組。由此可見，BMPR2作為配體基因，積極參與哺乳動物的生理生殖活動，在卵巢功能調控特別是激素分泌方面有一定的促進作用。

3.2 BMPR2基因多態性與小尾寒羊產羔數的相關性分析

這3個SNP位點均位于綿羊2號染色體BMPR2基因第12個外顯子上，且在NCBI網站中已有報道，但與綿羊產羔數關聯分析尚未見文獻報道。g.203707935A>G和g.203708072T>C位點在單、多羔綿羊品種中的等位基因頻率均存在顯著差異，初步表明這些位點與綿羊產羔數有關。3個SNP位點在各綿羊品種中的選擇潛力不盡相同，這可能是因為某些品種數量相對較少，或某些品種遺傳多樣性相對較低[39]。g.203708352A>G位點與小尾寒羊產羔數顯著相關（P<0.05），野生型產羔數顯著高于雜合型，暗示該位點突變可能在一定程度上對綿羊排卵數起抑制作用，這可能是因為該位點的錯義突變使得蛋白質序列第581位異亮氨酸置換為纈氨酸所導致。FecB基因作為影響綿羊產羔數的主效基因，是由于BMPR1B編碼區發生了A746G突變，導致第249位的氨基酸由谷氨酰胺變為精氨酸 （Q249R），從而提高了綿羊排卵數和產羔數[23，40]。BMPR1B為BMP的1型受體，其突變后增加了信號轉導過程對下游受體的信號強度，導致卵泡早熟、排卵數增加[40]。據此可推測出g.203708352A>G位點的突變可能影響了FecB基因效應，從而導致產羔數下降。將該位點與 FecB各基因型進行復合分析發現，3種復合基因型與小尾寒羊三胎產羔數顯著關聯（P<0.05），AA-GG產羔數顯著高于AA-AG和AA-AA基因型。據此可推測出g.203708352A>G位點突變拷貝數的增加可能對FecB基因效應有一定的抑制作用，從而削弱了BMP下游信號選擇強度，進而影響卵泡發育、成熟以及排卵整個生理過程，最終導致排卵數減少、產羔數降低。

4 結論

該研究發現BMPR2基因表達與綿羊產羔數存在一定程度的負相關，基因分型發現g.203708352A>G位點的突變可顯著減少小尾寒羊產羔數，推測該位點對小尾寒羊產羔數的調控可能是通過影響FecB基因效應來實現的。

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